방법 논문

시교차상핵 뉴런(Suprachiasmatic Nucleus Neuron)의 동시 전기생리학적 기록과 칼슘 이미징(Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons)

DOI:

10.3791/50794

⸱

2013년 12월 8일

 , 
1Center for Research on Occupational and Environmental Toxicology, Oregon Health & Science University, 2Department of Behavioral Neuroscience, Oregon Health & Science University

이 논문에서

요약

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절차는 막 전위 또는 현재 및 세포 내 칼슘 농도의 변화를 동시에 기록하는 것으로 설명됩니다. 시교차상핵 뉴런은 전체 세포 패치 클램프 구성에서 패치 클램프 전극을 사용하여 칼슘 지시자 bis-fura-2로 채워집니다.

초록

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동시 전기생리학 및 형광 이미징 기록 방법을 사용하여 세포 내 칼슘 농도를 조절하는 데 있어 막 전위 또는 전류의 변화의 역할을 연구했습니다. 명암 주기와 같은 환경 조건의 변화는 뉴런 및 신경망 활동과 포유류 뇌에서 마스터 일주기 시계의 위치인 시교차상핵(SCN) 내 일주기 시계 유전자 군의 발현을 수정할 수 있습니다. 흥분성 시냅스 전달은 시냅스후 Ca2+ 농도의 증가로 이어지며, 이는 일주기 시계 유전자의 리듬 발현을 변화시키는 신호 경로를 활성화하는 것으로 여겨집니다. SCN을 포함하는 시상하부 절편은 칼슘 지시약 bis-fura-2를 포함하는 내부 용액으로 채워진 미세 전극을 사용하여 패치 고정되었습니다. 미세전극과 SCN 뉴런 멤브레인 사이에 밀봉이 형성된 후, 부드러운 흡입을 사용하여 멤브레인을 파열하고 칼슘 프로브를 소마와 수상돌기를 모두 채우는 뉴런으로 확산시켰습니다. 세포 내 칼슘 농도의 정량적 비율계량 측정은 막 전위 또는 전류와 동시에 기록되었습니다. 이러한 방법을 사용하면 개별 뉴런의 시냅스 활성 및 활동 전위 발화에 의해 생성되는 세포 내 칼슘 농도 변화의 역할을 연구할 수 있습니다. 이 프레젠테이션에서는 뇌 절편에 유지되는 개별 SCN 뉴런의 세포 내 칼슘과 함께 전기생리학적 활동을 동시에 기록하는 방법을 보여줍니다.

서론

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유전자 발현의 변화는 시냅스 신호전달의 결과로 뉴런에서 발생하는 것으로 알려져 있습니다. 흥분성 신경전달물질인 글루타메이트에 의한 신호전달은 신경세포막의 전위를 탈분극시켜 결국 유전자 전사 및 번역을 유도할 수 있습니다1,2. 글루타메이트에 의한 이온성 수용체의 활성화는 세포 외 칼슘 이온이 세포로 들어갈 수 있도록 하며, 이는 유전자 전사를 활성화하는 데 있어 두 번째 전달자로서 중요한 역할을 하는 것으로 생각됩니다. 활동전위 발화 빈도와 같은 막의 전기적 활동과 세포 내 칼슘 농도의 변화 사이의 관계를 평가하려면 전체 세포 패치 클램핑과 형광 칼슘 프로브3-5의 정량적 이미징의 두 가지 방법을 조합하여 개별 뉴런에서 관계를 연구할 수 있어야 합니다. 단일 세포 기록 기술을 사용하면 뇌의 식별 가능한 부분에서 개별 뉴런의 활동을 기록할 수 있습니다. 전체 세포 기록 기술을 사용하면 멤브레인 전압 또는 전류를 제어할 수 있으므로 특정 이온 채널 전류를 실험적으로 조작할 수 있습니다. 형광 칼슘 프로브로 채워진 마이크로피펫을 사용하면 뉴런이 칼슘 프로브로 잘 채워지도록 할 수 있습니다. 이 기술은 성체 절편 제제에서 뇌 절편 제제로 작업할 때 분명한 이점이 있는데, 이러한 뉴런은 더 일반적인 세포 투과 프로브를 사용하여 로드하기가 특히 어렵고 잠재적인 배경 형광 문제를 줄이기 때문입니다6-8.

빛은 포유류가 시상하부상핵(SCN)에 위치한 생체 시계를 조정하는 주요 방법입니다. 망막에서 전달되는 빛 정보는 SCN12,13에서 글루타메이트가 분비되는 망막시상하부관(RHT)을 통해 9-11로 전달됩니다. 글루타메이트는 SCN 뉴런에 위치한 NMDA 및 AMPA 이온성 수용체를 열어 칼슘과 나트륨의 유입을 생성하고, 궁극적으로 시계 유전자14-17 계열의 발현을 변경하고 생체 시계18-20의 위상을 변화시키는 세포 내 신호 전달 폭포를 시작합니다. 그러나 칼슘은 이온성 글루타메이트 수용체를 통해 직접 또는 막 탈분극 및 전압 의존성 칼슘 채널(VDCC)의 활성화를 통해 뉴런에 들어갈 수 있습니다21. 따라서 우리는 활동 전위 발화 및 시냅스 입력22에서 발생하는 것과 같은 SCN 뉴런에서 세포 내 칼슘 농도와 막 전기 활동 사이의 관계를 조사하기 위한 실험 프로토콜을 개발했습니다.

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프로토콜

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1. 시상하부 뇌 절편의 준비

  1. 동물과 관련된 모든 절차에 대해 사전에 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받으십시오. 여기에 설명된 동물 절차는 2013년 동물 안락사에 대한 AVMA 지침과 일치하며 오리건 보건 과학 대학 IACUC의 사전 승인을 받았습니다.
  2. MgCl2 및 CaCl2 없이 슬라이싱 버퍼 500ml를 준비합니다(표 1). 실온에서 용액을 95%O2 및 5% CO2로 버블링한 다음 계속 폭기하면서 MgCl2 와 CaCl2 를 추가합니다. 자당을 사용하여 삼투압을 300mOsm으로 조정합니다. 삼투압은 증기압 삼투압계로 측정됩니다.
  3. MgCl2 및 CaCl2 없이 1L의 기록 매체를 준비합니다(표 2). 용액을 95 % O2 및 5 % CO2 로 거품을 일으킨 다음 계속 통기하면서 MgCl2 와 CaCl2 를 첨가합니다. NaOH (10 N)로 pH를 7.2-7.4로 조정하고 자당으로 삼투압을 300 mOsm으로 조정한다. HEPES 완충액의 추가는 선택 사항이며 pH를 더욱 안정화하는 데 사용되었습니다.
  4. 슬라이싱 및 기록 용액은 사용하기 전에 며칠 동안 냉장고에 보관할 수 있습니다.
  5. 아가로스 3%를 준비하고 멸균 페트리 접시(깊이 6mm)에 붓고 냉장 보관합니다.
  6. 아가로스 큐브 3개를 약 6mm x 6mm x 6mm로 자릅니다.
  7. 4주에서 8주 된 Sprague-Dawley 쥐를 이소플루란으로 깊이 마취시킵니다. 마취 깊이를 테스트합니다. 마취의 깊이는 발바닥을 꼬집은 후 뒷다리의 철수 반사가 없을 때 적절한 것으로 간주됩니다. 일단 적절하게 마취되면, 쥐는 신속한 참수로 안락사된다.
  8. 먼저 시신경을 절단하도록 주의하면서 뇌를 빠르게 제거하고 5% CO2 및 95% O2로 포화된 얼음처럼 차가운 슬라이싱 용액에 넣고 2-3분 동안 식힙니다.
  9. 뇌를 다듬습니다. 얼음 위에 놓인 유리 페트리 접시 위에 축축한(슬라이스 용액이 있는) 원형 여과지에 집게를 사용하여 뇌를 놓습니다.
  10. 뇌를 관상상으로 절단하여 남아 있는 소뇌와 뇌간을 제거한 다음 상부 피질과 측면을 제거하여 시상하부를 포함하는 뇌 블록을 남기고 SCN, 시신경 및 시신경이 포함된 측면을 조심스럽게 보존합니다.
  11. 뇌와 아가로스 블록을 부착할 수 있을 만큼 큰 시아노아크릴 접착제를 얼음처럼 차갑지만 건조한 마이크로톰 슬라이싱 챔버에 얇게 펴 바릅니다.
  12. 얼음처럼 차가운 뇌 블록 꼬리 쪽을 접착제 위에 아래로 옮기고 SCN이 포함된 면이 먼저 절단되도록 하고 시신경이 "V"자 모양을 위로 향하게 합니다.
  13. 다른 3면에 아가로스 블록을 놓습니다. 챔버를 5% CO2 및 95% O2로 연속적으로 기포된 얼음처럼 차가운 슬라이싱 버퍼로 채웁니다. 시아노아크릴 접착제는 뇌와 아가로스 블록을 제자리에 고정하는 수분으로 응고됩니다.
  14. 진동 블레이드 마이크로톰으로 SCN을 포함하는 관상 시상하부 절편(220-250μm 두께)을 자릅니다. 일반적으로 시신경이 약 2-4mm 너비인 곳에서 절편이 선택되며, SCN은 등쪽에 있는 SCN이 3번째 뇌실의 양쪽에 있는 시신경에 두 개의 작은 "움푹 들어간 곳"으로 나타나는 흰색 띠처럼 나타납니다(그림 1A).
  15. Leica DMLFS 현미경의 스테이지에 장착된 레코딩 챔버(36°C)에 슬라이스를 놓습니다. 챔버는 95% O2 및 5% CO2로 폭기되고 인라인 히터로 예열된 연속 유동 기록 용액(2ml/분)으로 채워집니다.
  16. 절편 준비 후 0.5-8시간 후에 SCN 뉴런에서 전체 세포 패치 클램프 및 칼슘 이미징 기록을 수행합니다.

2. 패치 클램프 녹음

  1. 전극 용액(세포 내) 용액을 총 최종 물 부피의 절반으로 준비합니다.
  2. 용액을 KOH(1N)로 pH 7.3으로 조정합니다.
  3. 남은 물을 넣으십시오. 용액의 최종 삼투압은 280-290mOsm 범위여야 합니다.
  4. 전극 용액을 0.2μm 필터에 통과시키고 부분 표본(0.5ml)을 마이크로분리 튜브에 넣고 -20°C에서 보관합니다.
  5. 1mg bis-fura-2 육사칼륨 염과 0.2μm 여과수 99.29μl를 혼합하여 칼슘 프로브 bis-fura-2 육사칼륨 염 원료 용액(10mM)을 준비합니다.
  6. 별도의 튜브 (각각 2-5 μl)로 부분 표본을 넣고 동결 (-20 ° C)합니다.
  7. 사용 직전에 내부 용액과 Ca2+ 프로브의 분취액을 해동합니다. 2μl의 bis-fura-2 원액을 400μl의 내부 용액에 추가하여 최종 50μM 칼슘 프로브 농도를 얻습니다. 용액을 혼합하기 위해 간단히 분쇄합니다. 칼슘 프로브 농도(10-250μM)는 실험 설계 및 이미징 시스템에 따라 다릅니다. bis-fura-2는 두 개의 연결된 fura-2 분자로 구성되어 있습니다.
  8. 세포 내 용액으로 채울 때 약 1μm의 외부 팁 직경과 7-10MΩ의 저항으로 전체 세포 패치 전극을 2단계로 당깁니다.
  9. Microfil 튜브를 통해 저용량 시료에 대해 4mm 주사기 필터(0.2μm)로 여과된 칼슘 프로브가 포함된 내부 용액 몇 μl를 전극에 다시 채웁니다.
  10. 전극에 소량의 양압을 가하면 적색광 조명 아래에서 녹음 챔버로 안내되므로 비디오 모니터에서 볼 수 있습니다.
  11. 저전력 대물렌즈(4X)를 사용하여 SCN 위에 미세 전극을 놓습니다. SCN은 제3심실의 양쪽에 있는 두 개의 반투명 영역과 시신경 카이즘의 등쪽으로 식별됩니다(그림 1A).
  12. 현미경을 고배율 배율(40X 또는 63X)로 전환합니다. SCN의 하위 영역과 개별 SCN 뉴런은 더 높은 배율로 기록하기 위해 표적이 될 수 있습니다.
  13. 미세 전극이 뉴런 표면으로 전진할 때 부드러운 양압을 가합니다.
  14. 미세 전극에 부드러운 음압을 가하여 3-10GΩ의 저항을 가진 밀봉을 형성합니다.
  15. 수집 소프트웨어로 제어되는 증폭기를 사용하여 멤브레인 전압을 -60mV로 조정합니다.
  16. 전극에 추가 음압을 가하여 세포막을 전체 세포 모드로 파열합니다.
  17. 전체 세포 모드에 들어가면 SCN 뉴런, 소마 및 수상돌기가 형광 프로브로 채워집니다.
  18. 멤브레인 전압은 칼슘 프로브 이미지 데이터가 모니터링 및 저장되는 동안 전류 클램프 모드에서 측정되거나 전압 클램프 모드에서 전류가 측정됩니다(아래 설명 참조). 실험 중 340nm/380nm 비율의 형광 데이터 그래프와 함께 획득한 이미지를 볼 수 있습니다.

3. 세포 내 Ca2+ 측정

  1. 정량적 Ca2+ 측정은 10nm 대역폭의 모노크로노미터를 통해 340nm 및 380nm에서 자외선으로 조직을 빠르게 여기하고 UG11 광학 필터를 통과하여 400nm 이상의 고조파 파장, 400nm DCLP 이색성 및 510±40nm 방출 필터를 통해 방출된 빛을 제한하여 한 쌍의 이미지를 기록하여 얻습니다.
  2. 이미지는 광표백을 최소화하고 레코딩 속도를 최대화하도록 획득 시간과 비닝을 조정한 냉각식 CCD 카메라를 사용하여 획득됩니다.
  3. 정량적 이미징 소프트웨어는 이미지를 획득하고 표시하는 데 사용됩니다.
  4. 초기 이미지에서 상대 형광 강도 단위 데이터(예: soma, dendrite 등)로 변환할 관심 영역을 선택합니다. 또한 배경 형광을 측정할 영역을 선택합니다(그림 1B).
  5. 원시 이미지와 정량화된 광학 데이터는 실험 중에 지속적으로 저장됩니다. 실험 후, 저장된 이미지는 일반적으로 정량화할 관심 영역을 보다 정확하게 선택하는 데 더 많은 시간이 소요될 수 있을 때 다시 분석됩니다.
  6. 데이터는 추정된 세포 내 칼슘 농도(Est[Ca2+]i)로 제시될 수 있습니다. 칼슘 농도를 계산하기 위해 340 nm에서 여기(excitation)와 배경 빼기(background subtraction)를 380 nm로 나눈 값(R)을 340 nm 및 380 nm로 나눈 값이 칼슘 농도4를 계산하는 데 사용된다. 배경 빼기 및 기타 계산은 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 수행됩니다.
  7. 최대 및 최소 bis-fura-2 형광의 체외 측정은 Ca2+ 결합의 경우 10mM CaCl2, Ca2+ 자유 조건의 경우 10mM EGTA를 사용하여 수행할 수 있습니다. 프로브의 Ca2+ 분리 상수, Kd는 bis-fura-2(Invitrogen)에 대해 370nM으로 간주됩니다.

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결과

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시상하부 뇌 절편을 사용하여 전압 및 전류 클램프 조건 모두에서 전체 세포 모드에서 세포 내 칼슘의 변화를 동시에 기록했습니다. 그림 1A에 표시된 미세 전극은 소량의 양압이 가해진 고배율(40X 또는 63X UV 대물렌즈)에서 위치로 내려갑니다. 뉴런에 닿으면 부드러운 흡입으로 기가옴 밀봉이 형성됩니다. 전압 클램프 모드에서 세포막 전위를 -60mV로 설정한 후 추가 흡입으로 멤브레인이 파괴되어 전체 세포 구성이 생성됩니다. 뉴런은 모니터에서 볼 때 프로브로 빠르게 채워집니다. 솜털(soma)과 유사한 초점면(focal plane)에서의 수지상 과정(dendritic processes)을 시각화할 수 있습니다(그림 1A 삽입). 또는 원위 수상돌기의 칼슘 변화를 측정하기 위해 초점을 조정할 수 있습니다. -60 mV에서 전압 클램프 모드로 기록하여 10Hz에서 +20 mV까지 짧은(2 msec) 단계를 사용하여 활동 전위 발사를 시뮬레이션했으며, 이는 많은 SCN 뉴...

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토론

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위에서 설명한 방법은 뉴런 막 전기적 활동과 세포내 칼슘 농도 사이의 연관성을 동시에 기록하는 강력한 도구를 제공합니다. 이 방법은 형광 염료를 사용한 세포내 칼슘 측정이라는 두 가지 매우 잘 특성화된 방법, 즉 전체 세포 패치 클램프 기록과 세포내 칼슘 측정을 결합한다는 점에서 여러 가지 강점을 가지고 있습니다. 우리의 접근 방식은 다른 연구자가 설명한 것과 유사합니다6,23.

이 방법을 사용할 때 여러 항목을 고려해야 합니다. 첫 번째는 세포 내 미세전극 용액으로 세포 내용물을 투석하는 전체 세포 패치 구성의 사용입니다. 투석은 전압 개폐 이온 채널의 런다운과 두 번째 메신저 매개 신호의 손실로 이어질 수 있습니다24-26. 둘째, 세포 손상 또는 기가옴 밀봉의 손상은 세포 입력 저항 감소와 관련될 수 있는 칼슘 수치 증가를 초래할 수 있습니다24. 셋째, 프로브가 포함된 세포간 용액은 미세전극 팁...

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공개 사항

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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

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이 연구는 미국 국립일반의학연구소(National Institute of General Medical Sciences, GM096972)의 보조금으로 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
NaCl피셔 사이언티픽 (주)S271-3
KCl피셔 사이언티픽P217-500
NaH2PO4• H2O시그마 케미컬S-9638
MgCl2• 6H2O피셔 사이언티픽M33-500
CaCl2• 2H2O피셔 사이언티픽C79-500
D-포도피셔 사이언티픽 Co.D16-500
NaHCO3피셔 사이언티픽S233-500
설탕피셔 사이언티픽 (S5-500
칼륨 D-글루코네이트 시그마-알드리치G4500
HEPES시그마-알드리치H4034
아데노신 5&프라임;-트리포스페이트 디칼륨 염 이수화물시그마-알드리치A8937
구아노신 5&프라임;-트리포스페이트 트리스 염시그마-알드리치G9002
아가로스(초순수)생명 기술15510-027멸균 페트리 접시에 겔 구멍 6mm 두께 층
KOH시그마 - 알드리치P-6310
NaOH시그마 - 알드리치S-5881
비스 - 푸라 - 2, 헥사 칼륨 염InvitrogenB6810셀 불침투성
장비 이름회사카탈로그 번호코멘트
MicrotomeLeicaVT1000S조직 슬라이싱
시아노아크릴 접착제(Roti-Coll1)Carl Roth GmbH+CoArt-Nr. 0258.1
미세 전극 풀러Narshige International USAPP-83
미세 전극 모세관World Precision Instruments1B150F-4
Microfil 34 gWorld Precision InstrumentsMF34G-5
주사기 필터Corning#431212
현미경LeicaDM LFS4X, 40X UV 및 63X UV 대물렌즈 및 에피 형광
CCD 카메라HamamatsuORCA ER12 비트 CCD
Fura-2 필터 큐브Chroma71500AUG11 필터
포함 세트 Polychrome IVTill Photonics GmBH모노크로노미터
자외선 차단 보안경자외선 제품
EPC-9 증폭기HEKA Eletronik
Metafluor분자 장치이미징 소프트웨어
패치 마스터HEKA Eletronik데이터 수집 소프트웨어
이고르 버전 6Wavemetrics전기 생리학 및 Ca2+ 데이터 분석
VAPRO 5520Westcor증기압 삼투압 온도계
당 주)

참고문헌

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