절차는 막 전위 또는 현재 및 세포 내 칼슘 농도의 변화를 동시에 기록하는 것으로 설명됩니다. 시교차상핵 뉴런은 전체 세포 패치 클램프 구성에서 패치 클램프 전극을 사용하여 칼슘 지시자 bis-fura-2로 채워집니다.
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방법 논문
시교차상핵 뉴런(Suprachiasmatic Nucleus Neuron)의 동시 전기생리학적 기록과 칼슘 이미징(Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons)
이 논문에서
요약
초록
동시 전기생리학 및 형광 이미징 기록 방법을 사용하여 세포 내 칼슘 농도를 조절하는 데 있어 막 전위 또는 전류의 변화의 역할을 연구했습니다. 명암 주기와 같은 환경 조건의 변화는 뉴런 및 신경망 활동과 포유류 뇌에서 마스터 일주기 시계의 위치인 시교차상핵(SCN) 내 일주기 시계 유전자 군의 발현을 수정할 수 있습니다. 흥분성 시냅스 전달은 시냅스후 Ca2+ 농도의 증가로 이어지며, 이는 일주기 시계 유전자의 리듬 발현을 변화시키는 신호 경로를 활성화하는 것으로 여겨집니다. SCN을 포함하는 시상하부 절편은 칼슘 지시약 bis-fura-2를 포함하는 내부 용액으로 채워진 미세 전극을 사용하여 패치 고정되었습니다. 미세전극과 SCN 뉴런 멤브레인 사이에 밀봉이 형성된 후, 부드러운 흡입을 사용하여 멤브레인을 파열하고 칼슘 프로브를 소마와 수상돌기를 모두 채우는 뉴런으로 확산시켰습니다. 세포 내 칼슘 농도의 정량적 비율계량 측정은 막 전위 또는 전류와 동시에 기록되었습니다. 이러한 방법을 사용하면 개별 뉴런의 시냅스 활성 및 활동 전위 발화에 의해 생성되는 세포 내 칼슘 농도 변화의 역할을 연구할 수 있습니다. 이 프레젠테이션에서는 뇌 절편에 유지되는 개별 SCN 뉴런의 세포 내 칼슘과 함께 전기생리학적 활동을 동시에 기록하는 방법을 보여줍니다.
서론
유전자 발현의 변화는 시냅스 신호전달의 결과로 뉴런에서 발생하는 것으로 알려져 있습니다. 흥분성 신경전달물질인 글루타메이트에 의한 신호전달은 신경세포막의 전위를 탈분극시켜 결국 유전자 전사 및 번역을 유도할 수 있습니다1,2. 글루타메이트에 의한 이온성 수용체의 활성화는 세포 외 칼슘 이온이 세포로 들어갈 수 있도록 하며, 이는 유전자 전사를 활성화하는 데 있어 두 번째 전달자로서 중요한 역할을 하는 것으로 생각됩니다. 활동전위 발화 빈도와 같은 막의 전기적 활동과 세포 내 칼슘 농도의 변화 사이의 관계를 평가하려면 전체 세포 패치 클램핑과 형광 칼슘 프로브3-5의 정량적 이미징의 두 가지 방법을 조합하여 개별 뉴런에서 관계를 연구할 수 있어야 합니다. 단일 세포 기록 기술을 사용하면 뇌의 식별 가능한 부분에서 개별 뉴런의 활동을 기록할 수 있습니다. 전체 세포 기록 기술을 사용하면 멤브레인 전압 또는 전류를 제어할 수 있으므로 특정 이온 채널 전류를 실험적으로 조작할 수 있습니다. 형광 칼슘 프로브로 채워진 마이크로피펫을 사용하면 뉴런이 칼슘 프로브로 잘 채워지도록 할 수 있습니다. 이 기술은 성체 절편 제제에서 뇌 절편 제제로 작업할 때 분명한 이점이 있는데, 이러한 뉴런은 더 일반적인 세포 투과 프로브를 사용하여 로드하기가 특히 어렵고 잠재적인 배....
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프로토콜
1. 시상하부 뇌 절편의 준비
- 동물과 관련된 모든 절차에 대해 사전에 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받으십시오. 여기에 설명된 동물 절차는 2013년 동물 안락사에 대한 AVMA 지침과 일치하며 오리건 보건 과학 대학 IACUC의 사전 승인을 받았습니다.
- MgCl2 및 CaCl2 없이 슬라이싱 버퍼 500ml를 준비합니다(표 1). 실온에서 용액을 95%O2 및 5% CO2로 버블링한 다음 계속 폭기하면서 MgCl2 와 CaCl2 를 추가합니다. 자당을 사용하여 삼투압을 300mOsm으로 조정합니다. 삼투압은 증기압 삼투압계로 측정됩니다.
- MgCl2 및 CaCl2 없이 1L의 기록 매체를 준비합니다(표 2). 용액을 95 % O2 및 5 % CO2 로 거품을 일으킨 다음 계속 통기하면서 MgCl2 와 CaCl2 를 첨가합니다. NaO....
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결과
시상하부 뇌 절편을 사용하여, 전압 및 전류 클램프 조건 모두에서 whole cell 모드로 세포 내 칼슘 변화를 동시에 기록하였습니다. Figure 1A에 표시된 미세전극은 약간의 양압을 가한 상태에서 고배율(40X 또는 63X UV 대물렌즈)로 원하는 위치까지 내립니다. 뉴런에 접촉한 후, 가벼운 흡입을 통해 gigaohm seal을 형성합니다. 전압 클램프 모드에서 세포막 전위를 -60 mV로 설정한 후, 추가적인 흡입으로 막을 파괴하여 whole cell 구성을 만듭니다. 모니터로 관찰하면 뉴런 내부에 프로브가 빠르게 채워지는 것을 볼 수 있습니다. 세포체와 유사한 초점 평면에 있는 수지상 돌기를 시각화할 수 있습니다(Figure 1A 삽입도). 또는 초점을 조정하여 원위 수지상 돌기의 칼슘 변화를 측정할 수 있습니다. -60 mV의 전압 클램프 모드에서 기록하며, 10 Hz로 +20 mV까지 짧은(2 msec) 스텝을 가하여 활동 전위 발화를 시뮬레이션하였는데.......
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토론
위에서 설명한 방법은 뉴런 막 전기적 활동과 세포내 칼슘 농도 사이의 연관성을 동시에 기록하는 강력한 도구를 제공합니다. 이 방법은 형광 염료를 사용한 세포내 칼슘 측정이라는 두 가지 매우 잘 특성화된 방법, 즉 전체 세포 패치 클램프 기록과 세포내 칼슘 측정을 결합한다는 점에서 여러 가지 강점을 가지고 있습니다. 우리의 접근 방식은 다른 연구자가 설명한 것과 유사합니다6,23.
이 방법을 사용할 때 여러 항목을 고려해야 합니다. 첫 번째는 세포 내 미세전극 용액으로 세포 내용물을 투석하는 전체 세포 패치 구성의 사용입니다. 투석은 전압 개폐 이온 채널의 런다운과 두 번째 메신저 매개 신호의 손실로 이어질 수 있습니다24-26. 둘째, 세포 손상 또는 기가옴 밀봉의 손상은 세포 입력 저항 감소와 관련될 수 있는 칼슘 수치 증가를 초래할 수 있습니다24. 셋째, 프로브가 포함된 세포간 용액은 미세전극 팁.......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 연구는 미국 국립일반의학연구소(National Institute of General Medical Sciences, GM096972)의 보조금으로 지원되었습니다.
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| MgCl2• 6H2O | 피셔 사이언티픽 | M33-500 | |
| CaCl2• 2H2O | 피셔 사이언티픽 | C79-500 | |
| D-포도 | 피셔 사이언티픽 Co. | D16-500 | |
| NaHCO3 | 피셔 사이언티픽 | S233-500 | |
| 설탕 | 피셔 사이언티픽 ( | S5-500 | |
| 칼륨 D-글루코네이 | 트 시그마-알드리치 | G4500 | |
| HEPES | 시그마-알드리치 | H4034 | |
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참고문헌
- Bading, H., Ginty, D. D., Greenberg, M. E. Regulation of gene expression in hippocampal neurons by distinct calcium signaling pathways. Science. 260, 181-186 (1993).
- Ghosh, A., Ginty, D. D., Bading, H., Greenberg, M. E. Calcium regulation of gene expression in neuronal cells.....
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재인쇄 및 허가
