방법 논문

폐수 유래 전기 활성 미생물 생물막: 성장, 유지 관리 및 기본 특성화

16.5K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/50800

⸱

2013년 12월 29일

 , 
1Department of Environmental Microbiology, UFZ - Helmholtz-Centre for Environmental Research

이 논문에서

요약

전위차 조절기에 의해 제어되는 3전극 설정을 사용하여 유가식 반응기에서 양극 전기활성 미생물 생물막의 시간amperometric 성장이 입증되었습니다. 세포외 전자 전달은 전자 공여체가 있는 경우와 전자 공여체가 없는 경우 순환 전압전류법을 사용하여 특성화됩니다. 기본적인 데이터 분석이 입증됩니다.

초록

유가식 반응기에서 폐수 접종물로부터 양극 전기활성 미생물 생물막의 성장은 전위차 조절기에 의해 제어되는 3전극 설정을 사용하여 입증됩니다. 따라서 potentiostats를 사용하면 전극 전위를 정확하게 조정할 수 있고 재현 가능한 미생물 배양 조건을 보장할 수 있습니다. 성장하는 동안 현재 생산량은 크로노암페어 측정법(CA)을 사용하여 모니터링됩니다. 이러한 데이터를 기반으로 최대 전류 밀도(jmax)와 쿨롱 효율(CE)이 생체 전기 촉매 성능의 특성화를 위한 척도로 논의됩니다. 순환 전압전류법(CV), 비파괴, 즉 비침습적 방법은 전기 활성 박테리아의 세포 외 전자 전달(EET)을 연구하는 데 사용됩니다. CV 측정은 미생물 기질이 있는 상태에서 양극 생물막 전극에서 수행됩니다. 턴오버 조건, 그리고 기판이 없는 경우, 즉 비턴오버 조건, 다른 스캔 속도를 사용합니다. 그 후, 데이터 분석이 예시되고 미생물 EET의 기본 열역학 매개변수가 도출되고 설명됩니다: 피크 전위(Epi), 피크 전류 밀도(jp), 형식 전위(EF) 및 피크 분리(ΔEP). 또한 이 방법의 한계와 최첨단 데이터 분석이 다루어집니다. 따라서 이 비디오 기사는 기본 실험 단계와 기본 데이터 분석에 대한 가이드를 제공합니다.

서론

미생물 세포외 전자 전달(EET)의 기초를 밝히고 엔지니어링 시스템에서의 활용은 중요하고 빠르게 증가하는 연구 개발 분야입니다1-3. 순수 균주뿐만 아니라 정의된 공동 배양 및 복잡한 컨소시엄을 포함한 이러한 전기 활성(또는 생체 전기 촉매 또는 전기화학적 활성) 미생물에 대한 연구에는 복잡한 기술, 방법 및 프로토콜이 필요합니다4. 이러한 방법은 전기 화학, 재료 과학, 미생물학과 같은 다양한 과학 분야에서 파생되며 다양한 계층 적 수준에 대한 통찰력을 제공합니다. 전체 미생물 생물막에서 단일 분자까지. 따라서 전기 화학 및 전기 화학적 방법은 모든 활동의 기초를 나타냅니다.

전통적으로 연료 전지 유형 설정은 이러한 엔지니어링 시스템의 원형 인 미생물 연료 전지 (MFC) 5에서 전기 활성 미생물 배양의 성장 및 유지 관리에 자주 사용되었습니다. 불행히도 이러한 유형의 MFC는 종종 단일 전극의 전위를 모니터링하거나 제어할 수 없었기 때문에 전극 프로세스에 대한 제한된 통찰력만 가능하고 셀 전압만 보고되었습니다. 이제 MFC에서 단일 전극의 전위에 대한 개별 모니터링 및 제어가 기초 연구뿐만 아니라 엔지니어링에도 분명한 이점을 나타낸다는 사실이 점점 더 인정되고 있습니다. 또한, 현재 복원, 담수화, 합성 및 바이오 컴퓨팅과 같은 미생물 전기 화학 기술의 응용 분야가 다양 화됨에 따라 소위 미생물 생체 전기 화학 시스템 (BES) 2,6,7 에서 개별 전극 전위의 외부 제어가 상당한 경우가 많습니다. 이 제어는 일반적으로 외부 전원 또는 전위차 조절기를 사용하여 달성됩니다. 따라서 potentiostats를 사용하면 다른 유형의 설정과 달리 개별 전극 전위를 정확하게 조정할 수 있습니다. 이는 전극이 세포외 전자 전달의 말단 미생물 전자 수용체(양극의 경우) 또는 전자 공여체(음극의 경우)를 나타내기 때문에 매우 중요합니다. 그림 1은 양극에서 미생물 EET에 대한 지식의 현재 상태를 보여줍니다 (예 : 2,4,6,8,9 음극에서의 EET는 여전히 주로 미개척10 입니다.

따라서 전극 전위의 제어는 재현 가능한 미생물 배양 조건의 사용뿐만 아니라 EET 열역학11의 관점에서 조정할 수 있습니다. 이 기사에서는 크로노암페어 측정법(CA) 및 순환 전압주사법(CV)을 사용하여 유가식 반응기 실험에서 전기 활성 미생물 생물막의 특성 매개변수를 추출하는 방법을 보여줍니다. 여기에는 성능 파라미터 최대 전류 밀도(jmax) 및 쿨롱 효율(CE)과 EET 특성이 포함됩니다. 여기서 가능한 전자 전달 부위와 실제 전자 전달 부위의 공식 전위(E, f)를 식별하는 데 중점을 둘 것입니다. 이러한 파라미터의 추출은 지오박터 사양에 의해 지배되는 폐수 유래 혼합 배양 생물막의 예에 표시됩니다. 12 이러한 폐수 유래 생물막은 전 세계의 수많은 연구 그룹에서 입증 된 바와 같이 간단한 전기 화학적 선택 절차에 의해 얻어집니다13-16.

미생물 세포 외 전자 전달을 연구하는 동적 전기 화학 기술

전기 활성 미생물 배양의 EET에 대한 열역학적 특성화를 위해서는 동적 전기화학 기술이 필요합니다. 일반적으로 이러한 기술에는 전위 제어, 즉 전압전류계와 전류 제어, 즉 다음이 포함됩니다. 갈바노다이나믹, 기법17. 따라서, 전위 제어 기술이 더 널리 퍼져 있으며, 예를 들어, 구형파 전압주사법 및 선형 스윕 전압주사법(18)을 포함한다. 그러나 가장 인기 있는 것은 순환 전압전류법(CV)19,20입니다. CV는 배터리 연구에서 재료 과학을 통한 효소 생체 전기 화학에 이르기까지 다양한 전기 화학 분야에서 잘 알려져 있으며 널리 퍼져 있습니다21. 살아있는 미생물 세포에 대한 적용은 10년 이상 거슬러 올라갈 수 있으며,22 및 지난 몇 년 동안 크게 증가할 수 있습니다23,24. 특히 CV와 분광법의 조합은 EET 메커니즘과 그 분자 특성에 대한 전례 없는 통찰력을 제공했습니다(예: 25,26) 이와 병행하여 미생물 EET의 열역학적 및 이론적 특성을 추출하기 위한 이론적 틀이 확장되고 심화되었습니다27-30. 그러나 이와는 대조적으로, 실험적 취급 부주의 또는 부적절한 데이터 분석은 종종 미생물 생전기화학 분야에서 CV의 적절한 적용을 방해합니다. 그러므로, 워크샵(예: EU-ISMET 2012) 및 튜토리얼19 외에도, 이 비디오 기사는 전기활성 박테리아에 대한 순환 전압전류법 실험 수행을 위한 기본 가이드를 제공할 것입니다. 따라서 기본 실험 단계와 기본 데이터 분석에 중점을 두고 있으며 최신 역학 분석 프로토콜을 제공하기 위한 것이 아닙니다. 다음 논의를 위한 가장 중요한 말단은 Box 1에 요약되어 있습니다(Harnisch 및 Freguia19에서 수정되고 수정됨).

프로토콜

바이오전기화학적 유가식 반응기의 선택 절차는 기질 및 무산소 조건의 선택으로 인해 매우 구체적이기 때문에 입증된 예에서 멸균 조건에서 작업할 필요가 없습니다.

1. 성장 배지의 준비

  1. Kim et al.에 따라 인산염 완충액을 사용하여 적절한 양의 성장 배지를 준비한다.도 13(표 1 참조). 여기서, 아세트산나트륨(10mM)이 기질로서 작용하고 있다. 이 기사에서 사용된 성장 배지는 하나의 예일 뿐이며 실험 목적에 따라 구성 요소가 다를 수 있습니다.
  2. 성장 배지 20ml당 1ml의 1차 폐수를 접종물로 추가합니다. 폐수 표본은 기계적인 여과 (예를 들면 숫자 2를 보십시오) 후에 도시 폐수 처리장에서 가지고 가고 4 °C.
    에 닫히는 콘테이너에 있는 사용법까지 3 달까지 저장될 수 있습니다 (참고: 실험의 목적에 따라 정확한 초기 세포 수가 중요할 수 있으므로 이를 결정해야 합니다. 시연된 예에서, 생물막이 정상 상태 조건에 도달하기 때문에 초기 세포 수는 중요하지 않습니다.)
  3. 배지에 바늘을 삽입하고 질소 흐름을 켜서 접종물을 포함한 배지를 질소로 최소 30분 동안 세척하여 탈기시킵니다.흐름은 매체의 완전한 혼합을 관찰할 수 있을 만큼 충분히 강해야 합니다.
    (참고: 매체의 부피에 따라 탈기 시간을 연장하는 것도 고려해야 합니다. 탈기 설정 중 유가식 반응기(단계 2.1-2.2))

2. Fed-batch 반응기 설정

  1. 적절한 반응기 용기를 가져 가라.- 여기서는 수정 된 4 넥 250ml 둥근 바닥 플라스크가 사용됩니다 .
    (참고: 일반적으로 용기에는 최소 4개의 흡입구가 있어야 합니다. 이는 3개의 전극과 샘플링/매체 교환에 필요합니다. 샘플링 또는 매체 변화로 인해 반응기가 정기적으로 열릴 때 생산된 가스량을 무시할 수 있으며, 그렇지 않으면 버블 카운터를 설치해야 합니다. 원치 않는 광방성 성장을 피하기 위해 반응기는 직사광선 노출로부터 차폐되어야 합니다.)
  2. 3전극 설정(자세한 내용은 그림 3 및 섹션 3 참조)의 경우 기준 전극(RE)(여기서는 Ag/AgCl, sat. KCl, 0.197V 대 SHE), 작동 전극(WE) 및 상대 전극(CE)을 실리콘 플러그를 통한 개별 입구를 통해 플라스크에 배치합니다(밀폐 밀폐.
    (참고: WE 및 CE 흑연 막대가 사용됩니다. 전극의 와이어는 실리콘 플러그를 통해 당겨져 외부에 고정됩니다. 기준 전극은 뚫린 구멍을 통해 실리콘 플러그를 통해 삽입됩니다. 단락을 방지하려면 교반 또는 매체 재순환 중에도 전극의 물리적 접촉이 없는지 확인하십시오. 매체 용액으로 완전히 덮인 전극을 놓습니다. 밀봉을 위해 모든 흡입구의 실리콘 플러그를 파라필름으로 감쌉니다.)
  3. 질소로 플러시하면서 샘플링 포트를 통해 접종물(여기서는 250ml)을 포함한 성장 배지를 반응기에 붓습니다.
  4. 실리콘 플러그로 마지막 흡입구를 닫고 밀폐하여 밀봉하십시오. 참고: 미량의 산소는 혼합 종 생물막에 해를 끼치지 않습니다. 그들은 낮은 수준의 산소를 견딜 수 있고 심지어 소비할 수 있으며, 이로 인해 CE가 감소할 수 있습니다.

3. 크로노암페로메트릭 생물막 성장

  1. 전극을 전위차 조절기의 해당 케이블에 연결합니다. 용기를 온도 조절 챔버에 놓고, 여기서는 35 ° C가 사용됩니다31, 일정한 환경 조건을 보장하기 위해.
  2. 소프트웨어를 열어 전위차도를 제어하고 기술을 선택하십시오 : 크로노 암페로메트리 (Chronoamperometry). 예를 들어 매개 변수를 다음과 같이 설정하십시오 : 500 시간 (≈ 20 일)의 기간 동안 0.2 V (Ag / AgCl 대비)의 일정한 전위 EWE. 전류는 매분마다 시간 단계 dti로 기록됩니다.
    참고: 적용된 전위의 선택은 연구된 시스템/미생물에 따라 다릅니다. 일반적으로 양극 공정은 양의 전위에서, 음극 공정은 음의 전위에서 연구됩니다. 또한 전자 공여체/수용체의 표준 전위와 예상되는 미생물 전자 전달 부위의 공식 전위로부터 적절한 전위를 추론할 수 있으며, 여기에서 시작점으로 최근 문헌을 참조하십시오.
  3. 크로노암페롬 측정을 시작합니다. 시간 경과에 따른 측정된 전류의 그래프는 소프트웨어에 의해 표시되며, 관찰된 최대 전류(imax)는 섹션 4 및 5에서 논의된 바와 같이 중요한 온라인 매개변수입니다.

4. 생물막 유지 관리

  1. 환경 조건(예: 온도)에 따라 산화 전류가 흐르기 시작하여 안정기에 도달합니다(그림 4 참조). 다시 제로 전류에 도달한 후 크로노암페어 측정을 일시 중지하고 중간 용액을 보충합니다. 더 빠른 생물막 성장을 위해 최대 전류의 고원에 도달한 직후 매체를 교체하십시오. 샘플링 포트를 열고 얇은 생물막을 파괴하지 않고 조심스럽게 매체를 배출합니다. 매체를 다시 채우는 동안 질소로 다시 플러시합니다. 샘플링 포트를 닫고 밀폐하십시오.
  2. 최대 산화 전류가 정상 상태에 도달할 때까지 4.1단계의 절차를 반복합니다(그림 4 참조).
    (참고: 상수 imax는 안정적인 정상 상태 생물막 형성을 나타내는 것으로 여겨집니다.)
  3. 기질 분석을 위해 신선 및 교환된 배지 용액의 1ml 샘플을 채취합니다(예: HPLC). 초기 기질(아세테이트) 농도(c0)와 나머지 기질 용액(c1)의 농도는 이후에 효율성 계산에 필요합니다(데이터 분석 섹션 참조).
    참고: 예를 들어 추가 기질 소비로 인한 변경되지 않은 결과를 얻으려면 기질 샘플을 즉시 분석하십시오. 이것이 불가능할 경우 샘플을 최소 -18°C의 냉동고에 한 달 이상 보관하지 마십시오.)

5. EET 연구를 위한 순환 전압전류법 적용

  1. 표시된 대로 전류 흐름의 최대값과 최소값에서 순환 전압전류법을 수행합니다(그림 4). 관심 질문에 따라 CV는 일반적으로 시스템이 안정적인 상태에 도달했을 때 수행되어 비슷한 결과를 얻습니다. (참고: 전류의 생성은 턴오버 조건이라고 하며 기판의 미생물 산화 및 후속 전자 전달과 관련이 있습니다. 미생물 생체 전기 촉매; 비턴오버 CV는 CA에서 (거의) 제로 전류 흐름에서 수행됩니다.)
  2. 전위차도 제어 소프트웨어에서 기술을 선택하십시오 : 순환 전압 전류법, 그리고 여기에 적절한 매개 변수를 설정하십시오 (예 : 스캔 속도 v = d E / d t 1 mV / sec의 스캔 속도 v = dE / dt 0.3 V 대 RE에서 0.3 V 대 RE의 시작 전위 E2 = Ei -0.5 V.
    참고: 순환 전압전류법을 사용할 때 WE에서 적용된 전압은 전위차도에 의해 시간에 따라 선형적으로 변경됩니다(그림 5 참조).- 상자 2는 실험 매개변수 선택 및 문제 해결을 위한 기본 규칙을 제공합니다.
  3. 순환 전압주사법을 시작하고 재현 가능한 CV를 수행하는 데 필요한 만큼의 사이클을 기록합니다. 일반적으로 최소 3 사이클이 필요합니다. 결과 플롯을 순환 볼타모그램이라고 합니다(그림 7 참조). 참고: 측정 조건에 따라 다음 섹션에서 설명한 것처럼 다른 정보를 얻을 수 있습니다.

6. 데이터 플로팅

여기서는 데이터 플로팅에 대해서만 설명합니다. 더 자세한 논문은 다음 섹션에서 이어집니다.

  1. 적절한 데이터 분석 소프트웨어를 사용하면 모든 데이터를 텍스트로 내보내고 ASCII 파일로 가져옵니다.
  2. 절대 전류(i)가 아닌 우선적으로 전류 밀도(j)를 계산하고 사용합니다.
    (참고: 그러나 j를 계산하기 위한 다른 프로토콜이 존재하므로 어떤 프로토콜이 사용되었는지 분명히 하십시오. 여기서 기하학적 당 전류 밀도, 즉 돌출된 전극의 표면적이 사용됩니다.)
  3. 크로노암페어로메트리: 측정된 전류 밀도를 시간의 함수로 표시합니다.
  4. 순환 전압전류법: 측정된 전류 밀도를 WE Ewe의 전위 함수로 표시합니다.

결과

1. 크로노암페로메트리(Chronoamperometry)

크로노암페로메트리(Chronoamperometric) 측정으로부터 두 가지 작동 특성을 계산할 수 있습니다. 바로 최대 전류 밀도(j최대), 즉 초당 최대 전자 흐름 및 쿨롱 효율(모세전기영동 (Capillary Electrophoresis)), 즉소모된 기질과 관련된 총 전류 흐름. 그림 4 유동식 배치 반응기(fed-batch reactor)를 이용한 여러 성장 주기의 전형적인 크로노암페로메트리(chronoamperometric) 바이오필름 성장 곡선을 보여줍니다. 초기 지체기(lag-phase) 이후 첫 번째 전류 밀도 최대치가 나타납니다. 이후 기질 고갈로 인해 전류가 다시 감소합니다. 전류 흐름이 (거의) 0이 되면 표시된 대로 배지를 교체합니다. 이러한 기질 보충 후 전류 밀도가 다시 증가하며, 이어지는 최대 전류 밀도는 첫 번째보다 더 높게 나타납니다. 여러 번의 성장 주기 후에 j최대값 일정하며, 이는 바이오필름 형성이 정상 상태(steady-state)에 도달했음을 나타냅니다.14정상 상태에 도달함에 따라 j최대 값은 여러 매개변수에 따라 달라집니다. 예: 전극 재료, 반응기 온도 및 생물막 조성은 흔히 특정 전기 활성 미생물 생물막/전극 시스템의 특성으로 간주됩니다. (유동형 반응기의 경우 제외) j최대치, 다만 일정한 정상 상태 전류 밀도가 사용됩니다.) 두 번째 작동 특성은 쿨롱 효율입니다. (CE) (식 1). 이는 전류 흐름으로 기록된 전자의 수입니다. Qp 이론적 최대 전자 수와 관련된 유가배양 주기당 Qth, 이는 해당 주기 동안의 기질 소비량으로부터 계산됩니다.

정적 평형 공식 CE=QP/Qth×100; 공정 도표의 효율 계산.

(식 1)

총 전달 전하량은 CA 곡선을 적분하여 얻을 수 있습니다( 그림 6 참조):

전하량 계산, 방정식, \( Q_P = \int_0^t i \, dt \), 적분법.

(식 2)

이론적으로 가능한 전하량은 패러데이 법칙(Faraday’s law)에 의해 계산됩니다:

열역학 방정식 Qth=ΔcVzF, 화학 퍼텐셜 분석, 교육용.

(식 3)

여기서 V 는 배양 배지의 부피, F는 패러데이 상수(F = 96,485.34 C/mol), z는 산화된 기질에서 방출된 전자 수(아세테이트의 경우 CO2로 산화되는 동안 8개의 전자가 방출됨)이며, Δc = c0-c1은 기질 소비량을 나타냅니다(이는 HPLC 등의 화학적 분석 방법으로 결정됩니다).

2. 순환 전압전류법:

비회전(nonturnover) 조건과 회전(turnover) 조건( 그림 4에 표시됨)에 대해 순환 전압-전류 곡선(Cyclic voltammograms)을 기록합니다. 두 경우 모두 서로 다른 유형의 정보를 얻을 수 있습니다. 다음에서는 잠재적 전자 전달(EET) 부위와 실제 EET 부위를 어떻게 식별할 수 있는지 논의합니다.

2.1 비회전 조건 – 가능한 EET 부위 확인:

그림 7 비회전 조건에서의 전형적인 CV를 보여줍니다. 즉기질이 없는 상태에서. 그림 7A 높은 주사 속도(여기서는 50 mV/sec)에서의 바이오필름 CV를 보여주며, 여기서는 하나의 피크 쌍, 즉 하나의 형식 전위만이 나타난다. Ef 식별할 수 있습니다. 일반적으로 산화-환원 쌍의 형식 전위는 산화 피크의 피크 전위로부터 계산할 수 있습니다. EpA 및 해당 종의 환원 피크 EpC 산술 평균을 구하여(다음도 참조하십시오. 그림 7C):

전기화학 방정식: Ej = (EpA + Epc)/2, 볼탐메트리 연구에서 산화환원 전위를 분석함.

(식 4)

동일한 바이오필름에 충분히 낮은 스캔 속도(여기서는 1 mV/sec)를 적용하면 최대 4개의 산화환원 쌍을 식별할 수 있습니다(각각의 형식 전위는 그림 7B에 표시되어 있습니다). 그 이유는 낮은 스캔 속도를 사용할 때 커패시턴스 배경 전류가 감소하기 때문이며, 자세한 내용은 박스 1 및 예:17,21을 참조하십시오. 하지만 비회전(nonturnover) CV는 전극에 존재하는 모든 산화환원 활성 화합물, 즉 가능한 EET 부위의 Ef만을 보여줍니다. 오직 회전(turnover) CV 분석만이 실제 EET 전달 부위의 Ef를 제공합니다(단계 2.2 참조).

비전환 CV를 추가로 분석할 때, 피크 분리 ΔEp (식 5) 또는 최대 피크 전류 ipA 및 최소 피크 전류 ipC와 같은 다른 특성 파라미터들을 분석할 수 있습니다 (그림 7C 참조).

정적 평형 방정식 ΔEP=EpA-EpC; 교육용 공식 도표.

(식 5)

이러한 파라미터들, 특히 서로 다른 스캔 속도에서 기록된 데이터는 전극에서의 전자 전달 과정에 대한 메커니즘 및 속도론적 분석에 활용될 수 있습니다. 하지만 화학 시스템에서는 잘 확립된 이러한 속도론적 분석이 전기 활성 미생물 바이오필름의 경우에는 간단하지 않습니다(예: e.g.19,30 참조).

  1. 교체 조건 – 실제 EET 부위 확인:

기질이 존재하는 상태에서 CV 측정을 수행하면 턴오버 CV가 얻어집니다(다음 참조 그림 8A). 데이터를 도식화하면 전형적인 S자형의, 소위 생체전기촉매(bioelectrocatalytic) 곡선을 확인할 수 있습니다.17-19데이터를 추가로 분석할 때, 1차 도함수의 최댓값은, 즉CV 곡선의 변곡점은 형식 전위를 제공합니다. Ef ~의 실제적인 EET 부위(s) (참조 그림 8B). 젊은 경우, 즉얇은, Geobacteraceae-가 우세한 바이오필름에서, 여기서는 CA 시작 후 168시간이 지난 시점에 두 개의 변곡점이 관찰됩니다. 이후 미분 곡선은 생전기촉매 활성 EET 부위의 형식 전위에 해당하는 두 개의 최대값을 보여주며, 이는 Ag/AgCl(포화 KCl, SHE 대비 0.197 V) 대비 -0.376 V 및 -0.295 V입니다. 그림 7B 이들 부위는 ~로 명명됩니다 Ef,2 및 Ef,3각각이다. 이 결과는 또한 공식 전위와 관련된 산화환원 과정이 Ef,1 및 전자(Electron)f,4 (비전환 CV에서) 생체 전기촉매 작용과 관련이 없습니다. 바이오필름이 성장하여 두꺼워짐에 따라 CV에는 단 하나의 변곡점만 나타납니다. 즉미분 곡선에서 하나의 최대값을 의미합니다. 이 형식 전위는 Ef여기서 -0.32 V vs. Ag/AgCl (sat KCl)이며, 이는 얇은 생물막의 EET에 할당된 두 공식 전위의 산술 평균과 (거의) 같습니다.예: 제공된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요. Ef,2 및 Ef,3) – 참조 그림 9이는 이러한 매우 기본적인 CV 분석이 빠르고 비침습적인 방식으로 EET 열역학에 대한 통찰을 제공하지만, 주목할 점은 더 이상의 기전적 또는 속도론적 결론을 도출하는 것은 허용하지 않는다는 것을 보여줍니다.

특히 본 프로토콜의 특정 조건에서 형성된 바이오필름은 ~가 매우 지배적입니다. 지오박터(Geobacter) 종 (여기서는 시연되지 않음)12,15. 선택된 파라미터 변경 예: 기질, 온도, 기타또한 미생물 조성에 영향을 미치며, 이에 따라 전기화학적 특성에도 영향을 줄 것입니다.

표 1. Kim et al.32에 따른 성장 배지

구성 요소(mg/L) / (ml/L)   
NaH2PO4•H2O2,690.00
나트륨2고배율 조직병리 검사 (HPO)44,330.00
NH4염소310.00
염화칼륨130.00
아세트산나트륨820.00
금속 용액12.50
비타민 용액12.50
표 2. 금속 및 비타민 용액의 성분33.
미량 원소 용액:비타민 용액:
성분mg/L   성분mg/L   
Nitriloacetic acid1,500.0Biotin2.0
MgSO4•7H2O         3,000.0Folic acid2.0
MnSO4•2H2O         500.0Pyridoxine hydrochloride10.0
NaCl  1,000.0Thiamine hydrochloride5.0
FeSO4•7H2O          100.0Riboflavin5.0
CoSO4 or CoCl2     100.0Nicotinic acid5.0
CaCl2•2H2O            100.0DL-Calcium pantothonate5.0
ZnSO4   130.0Vitamin B120.1
CuSO4•H2O10.0p-Aminobenzoic acid5.0
AlK(SO4)2               10.0Lipoic acid5.0
H3BO3 10.0
Na2MoO4•2H2O     10.0
참고: nitriloacetic acid를 KOH로 pH 6.5가 되도록 용해한 후, 미네랄을 추가하십시오.


생물전기화학 용어 도표; 전기화학의 방정식 및 공식 포함.
순환 전압-전류법 파라미터 설정 및 트러블슈팅 가이드, 최적의 CV 실험을 위한 전위 창 및 스캔 속도 조정에 중점.

미생물 전자 전달 도식; MET, DET, MIET, DIET 경로; 전자 전달 분석.
그림 1. 가능한 미생물 세포외 전자 전달 메커니즘의 모식도. 여기를 클릭하여 더 큰 이미지 보기.

수질 샘플링 과정; 폐수 처리 흐름에서 샘플을 수집하는 버킷 샘플러.
그림 2. 그리드 수집기 이후의 폐수 처리장 내 샘플링(독일 폐수 처리장). 여기에서 더 큰 이미지를 확인하십시오.

포텐시오스탯, 전극 설정이 포함된 전기화학 셀 도식 및 사진; CE, RE, WE 표시됨.
그림 3. 3전극 설정. (A) 모식도, (B) 실제 반응기; CE = 상대 전극, RE = 기준 전극, WE = 전기 활성 미생물 바이오필름이 형성된 작업 전극, SP = 샘플링 포트. 여기를 클릭하여 더 큰 이미지를 확인하십시오.

전기화학 그래프; CV 분석; 전류 대 시간; 정상 상태 접근; 마이크로암페어 및 시간 단위의 데이터.
그림 4. 유가식 폐수 접종물을 기반으로 한 생물막 성장의 크로노암페로메트리 플롯. 산화 전류는 배지 교체 3주기 후에 정상 상태에 도달한다. 지연기(lag-phase)와 배지 교체 시점, 그리고 정상 상태 생물막 조건에서의 턴오버 순환 전압-전류법(CV) 및 비턴오버 CV 수행 시점이 표시되어 있다(Liu14의 원시 데이터). 여기를 클릭하여 더 큰 이미지 보기.

전기화학 분석, E-t 도표, 순환 전압전류법, 전위 대 시간, 분석 화학.
그림 5. 순환 전압전류법 1주기 동안의 기본 전위-시간 경과. CV는 초기 전위 Ei에서 시작됩니다. 이후 인가 전압은 주사 속도 v로 시간에 따라 선형적으로 변화합니다. 선택된 정점 전위 E1에서 전압은 종료 전위 E2로 돌아가며, 여기에서 E2 = Ei입니다. 여기를 클릭하여 더 큰 이미지 보기.

피크 jmax를 보여주는 전류 밀도 j 대 시간 t의 전기화학 분석 그래프.
그림 6. 폐수 유래 바이오필름의 1회 성장 주기에 대한 전형적인 크로노암페로그램(chronoamperogram); 여기에서 최대 전류 밀도 jmax, 흐른 (실제) 전하량 Qp, 초기 기질 농도 c0 의 샘플링 및 1회 성장 주기 후의 기질 농도 c1 이 표시되어 있다. 여기를 클릭하여 더 큰 이미지 보기.

전기화학 분석 그래프; 전류 대 전압 결과를 보여주는 순환 전압전류도.
그림 7. G. sulfurreducens 바이오필름의 비회전 순환 전압전류도. 스캔 속도: (A) 50 mV/sec, (B) 1 mV/sec 23; (C) B의 확대도이며, 최대값에서의 양극의 피크 전류 밀도(jpA)와 해당 피크 전위(EpA)를 보여줌. 이에 대응하여 최소값에서는 음극의 피크 전류 밀도(jpC)와 해당 피크 전위(EpC)가 표시됨. 형식 전위 Ef와 피크 간격 ΔEp는 각각 식 4와 식 5로부터 도출됨(자세한 내용은 아래 텍스트 참조). 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

전기화학 분석; 볼탐메트리 그래프; 전류 대 전위; 피크 검출; 데이터 분석.
그림 8. (A) 대사 활동 중인 G. sulfurreducens 바이오필름의 턴오버 순환 볼탐모그램. 스캔 속도는 5 mV/sec였습니다. (B>) 볼탐메트리 곡선의 1차 도함수23. 실제 EET 사이트의 형식 전위인 Ef,2 및 Ef,3이 표시되어 있습니다. 여기를 클릭하여 더 큰 이미지 보기.

순환 전압전류법 그래프; 전류 대 전위; 전기화학적 분석; 데이터 결과.
그림 9. (A) 더 두꺼운 대사 활성 G. sulfurreducens 바이오필름의 (B) 턴오버 순환 전압전류도 및 1차 도함수. 스캔 속도는 5 mV/sec였습니다(그림 8과 비교). 여기를 클릭하여 더 큰 이미지 보기.

토론

제시된 프로토콜은 공급 배치 반응기에서 3전극 설정을 사용하여 폐수 접종에서 전기 활성 미생물 생물막을 성장시키는 쉽고 간단한 방법을 보여줍니다. 크로노암페로메트리는 다양한 접종물에서 전기 활성 미생물 생물막의 성장 및 선택뿐만 아니라 최대 전류 밀도 및 쿨롱 효율 측면에서 생물막의 근본적인 특성화를 가능하게 합니다. 비침습적 기술인 순환 전압전류법을 사용하면 미생물 생물막의 EET 열역학에 대한 기본 연구를 수행할 수 있으므로 가능한 실제 EET 전달 부위를 식별할 수 있습니다. 이러한 매개변수를 함께하면 i) 동일한 조건에 대해 서로 다른 미생물 생물막을 특성화하고 비교할 수 있을 뿐만 아니라 ii) 동일한 전기 활성 미생물 생물막에 대한 서로 다른 작동 조건의 영향을 연구할 수 있습니다. 그러나 이러한 실험은 시작점일 뿐입니다. 한편으로 미생물 생전기화학의 다면적인 분야는 전기화학적 방법 및 프로토콜의 더 깊고 심층적인 활용을 필요로 합니다. 여기에는 예를 들어, 동역학 및 기계론적 데이터를 추출하기 위한 모델뿐만 아니라 전기화학적 임피던스 분광법(34,35)과 같은 추가 방법이 포함됩니다. 반면에 전기화학적 방법은 분자 특성, 미생물 구성, 공간 미생물 조직 등에 대한 정보를 제공할 수 없습니다. 여기에는 비침습적이고 전기화학 또는 침습적에 결합된 추가 기술이 필요합니다4. 상자 2는 실험을 수행할 때의 중요한 단계와 초기 문제 해결에 대한 간단한 논의를 제공합니다.

공학적 관점에서 전기활성 생물막 양극은 현재 미생물 생전기화학 시스템의 한 구성 요소일 뿐이며 전체 시스템에 대해 다양한 다른 요인을 분석해야 한다는 점을 고려해야 합니다36. 그러나 우리는 이 비디오 기사가 앞으로 BES의 핵심 요소 , 즉 미생물 전극을 이해하고 조정하는 데 도움이 되기를 바랍니다.

공개 사항

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

F.H.는 BMBF(Research Award "Next generation biotechnological processes - Biotechnology 2020+")와 Helmholtz-Association(Young Investigators Group)의 지원을 인정합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1차 폐수폐수 처리장기계적 여과 후 취
250ml 3개의 추가 흡입구가 있는 둥근 바닥 플라스크Th.Geyer Berlin GmbH, Germany9.011 845으로 추가 흡입구 부착
Sensortechnik Meinsberg, GermanySE 11
흑연 막대 (Ø=1 cm, l=3 and 5 cm)CP-Handels-GmbH, Wachtberg, Germany전극 재질로 사용
스테인리스강, No. 1.4301, Wire Fe/Cr18/Ni10Goodfellow GmbH, Bad Nauheim, Germany155-923-05
Silicon plugsTh.Geyer Berlin GmbH,Germany 9.230 512 and
ParafilmneoLab, Heidelberg, Germany3-1011혐기성 상태를 유지하기 위한 밀봉용
Potentiostat/ Galvanostat 모델 MPG2BioLogic Science Instruments, 프랑스
EC-LabBioLogic Science Instruments, 프랑스전기화학 측정 수행을 위한 소프트웨어
Origin 8.6OriginLab데이터 분석 소프트웨어
한 세라믹 다이어프램이 있는 사내 유리 송풍기 Ag/AgCl 기준 전극(sat. KCl, 0.195V vs. SHE)

참고문헌

  1. Rabaey, K., Angenent, L., Schröder, U., Keller, J. Integrated Environmental Technology Series. Lens, P. , IWA Publishing. London, New York. (2010).
  2. Logan, B. E., Rabaey, K. Conversion of wastes into bioelectricity and chemicals using microbial electrochemical technologies. Science. 337, 686-690 (2012).
  3. Rabaey, K., Rozendal, R. A. Microbial electrosynthesis - revisiting the electrical route for microbial production. Nat. Rev. Microbiol. 8, 706-716 (2010).
  4. Harnisch, F., Rabaey, K. The Diversity of Techniques to Study Electrochemically Active Biofilms Highlights the Need for Standardization. ChemSusChem. 5, 1027-1038 (2012).
  5. Logan, B. E., et al. Microbial Fuel Cells: Methodology and Technology. Environ. Sci. Technol. 40, 5181-5192 (2006).
  6. Harnisch, F., Schröder, U. From MFC to MXC: chemical and biological cathodes and their potential for microbial bioelectrochemical systems. Chem. Soc. Rev. 39, 4433-4448 (2010).
  7. TerAvest, M. A., Li, Z., Angenent, L. T. Bacteria-based biocomputing with Cellular Computing Circuits to sense, decide, signal, and act. Energy Environ Sci. 4, 4907-4916 (2011).
  8. Lovley, D. R. Bug juice: harvesting electricity with microorganisms. Nat. Rev. Microbiol. 4, 12 (2006).
  9. Lovley, D. R. Reach out and touch someone: potential impact of DIET (direct interspecies energy transfer) on anaerobic biogeochemistry, bioremediation, and bioenergy. Rev. Environ. Sci. Biotechnol. 10, 101-105 (2011).
  10. Rosenbaum, M., Aulenta, F., Villano, M., Angenent, L. T. Cathodes as electron donors for microbial metabolism: Which extracellular electron transfer mechanisms are involved. Bioresource Technol. 102, 324-333 (2011).
  11. Schröder, U. Anodic electron transfer mechanisms in microbial fuel cells and their energy efficiency. Phys. Chem. Chem. Phys. 9, 2619-2629 (2007).
  12. Harnisch, F., et al. Revealing the electrochemically driven selection in natural community derived microbial biofilms using flow-cytometry. Energy Environ. Sci. 4, 1265 (2011).
  13. Kim, J. R., Min, B., Logan, B. E. Evaluation of procedures to acclimate a microbial fuel cell for electricity production. Appl. Microbiol. Biotechnol. 68, 23-30 (2005).
  14. Liu, Y., Harnisch, F., Fricke, K., Sietmann, R., Schröder, U. Improvement of the anodic bioelectrocatalytic activity of mixed culture biofilms by a simple consecutive electrochemical selection procedure. Biosens. Bioelectron. 24, 1006-1011 (2008).
  15. Torres, C. sI., et al. Selecting Anode-Respiring Bacteria Based on Anode Potential Phylogenetic, Electrochemical, and Microscopic Characterization. Environ. Sci. Technol. 43, 9519-9524 (2009).
  16. Virdis, B., Harnisch, F., Batstone, D. J., Rabaey, K., Donose, B. C. Non-invasive characterization of electrochemically active microbial biofilms using confocal Raman microscopy. Energy Environ. Sci. 5, 7017-7024 (2012).
  17. Scholz, F., Bond, A. M. Electroanalytical Methods: Guide to experiments and applications. 2, edn,(2010).
  18. Marsili, E., Rollefson, J. B., Baron, D. B., Hozalski, R. M., Bond, D. R. Microbial biofilm voltammetry: direct electrochemical characterization of catalytic electrode-attached biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 74, 7329-7337 (2008).
  19. Harnisch, F., Freguia, S. A Basic Tutorial on Cyclic Voltammetry for the Investigation of Electroactive Microbial Biofilms. Chemistry. 7, 466-475 (2012).
  20. Marsili, E., et al. Shewanella secretes flavins that mediate extracellular electron transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3968-3973 (2008).
  21. Bard, A. J., Inzelt, G., Scholz, F. Electrochemical Dictionary. , Springer. (2008).
  22. Kim, B. H., et al. Electrochemical activity of an Fe(III)-reducing bacterium, Shewanella putrefaciens IR-1, in the presence of alternative electron acceptors. Biotechnol. Tech. 13, 475-478 (1999).
  23. Fricke, K., Harnisch, F., Schröder, U. On the use of cyclic voltammetry for the study of anodic electron transfer in microbial fuel cells. Energy Environ. Sci. 1, 144 (2008).
  24. Marsili, E., Sun, J., Bond, D. R. Voltammetry and Growth Physiology of Geobacter sulfurreducens Biofilms as a Function of Growth Stage and Imposed Electrode Potential. Electroanalysis. 22, 865-874 (2010).
  25. Busalmen, J. P., Esteve-Núñez, A., Berná, A., Feliu, J. M. C-Type Cytochromes Wire Electricity-Producing Bacteria to Electrodes. Angew. Chem. 120, 4952-4955 (2008).
  26. Millo, D., et al. In Situ Spectroelectrochemical Investigation of Electrocatalytic Microbial Biofilms by Surface-Enhanced Resonance Raman Spectroscopy. Angew. Chem. Int. Edn. Engl. 50, 2625-2627 (2011).
  27. Hamelers, H. V., et al. New applications and performance of bioelectrochemical systems. Applied Microbiol. Biotechnol. 85, 1673-1685 (2010).
  28. Richter, H., et al. Cyclic voltammetry of biofilms of wild type and mutant Geobacter sulfurreducens on fuel cell anodes indicates possible roles of OmcB, OmcZ, type IV pili, and protons in extracellular electron transfer. Energy Environ. Sci.. 2, 506 (2009).
  29. Torres, C. I., Kato Marcus, A., Rittmann, B. E. Proton transport inside the biofilm limits electrical current generation by anode-respiring bacteria. Biotechnol. Bioeng. 100, 872-881 (2008).
  30. Torres, C. I., et al. A kinetic perspective on extracellular electron transfer by anode-respiring bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 34, 3-17 (2010).
  31. Patil, S. A., Harnisch, F., Kapadnis, B., Schröder, U. Electroactive mixed culture biofilms in microbial bioelectrochemical systems: The role of temperature for biofilm formation and performance. Biosens. Bioelectron. 26, 803-808 (2010).
  32. Kim, J. R., Min, B., Logan, B. E. Evaluation of procedures to acclimate a microbial fuel cell for electricity production. Appl. Microbiol. Biotechnol. 68, 23-30 (2005).
  33. Balch, W. E., Fox, G. E., Magrum, L. J., Woese, C. R., Wolfe, R. S. Methanogens: Reevaluation of a unique biological group. Microbiol. Rev. 43, 260-296 (1979).
  34. He, Z., Mansfeld, F. Exploring the use of electrochemical impedance spectroscopy (EIS) in microbial fuel cell studies. Energy Environ. Sci. 2, 215-219 (2009).
  35. Ter Heijne, A., et al. Identifying charge and mass transfer resistances of an oxygen reducing biocathode. Energy Environ. Sci. 4, 5035-5043 (2011).
  36. Logan, B. Scaling up microbial fuel cells and other bioelectrochemical systems. Appl. Microbiol. Biotechnol. 85, 1665-1671 (2010).

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

3

관련 논문