방법 논문

먹이 찾아 돌아다 행동에 대한 단일 비행 분석에 초파리

DOI:

10.3791/50801

⸱

2013년 11월 4일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Neurobiology Section, Division of Biological Sciences, University of California-San Diego, 2Department of Neuroscience, Columbia University, 3Dart NeuroScience, 4School of Dental Medicine, University of Pennsylvania

이 논문에서

요약

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이 비디오 문서에서는, 우리는 초파리 비행 성인 과일의 후각에 의존 식품 검색 행동에 대한 배고픔이나 포만감의 효과를 측정 할 수있는 자동화 된 분석을 설명합니다.

초록

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많은 동물의 경우, 기아는 적절한 음식 소스에 대한 검색을 용이하게하는 방법으로 후각 시스템의 변화를 촉진합니다. 이 비디오 문서에서는, 우리는 초파리 비행 성인 과일의 후각에 의존 식품 검색 행동에 대한 배고픔이나 포만감의 효과를 측정 할 수있는 자동화 된 분석을 설명합니다. 초파리에 보이지 않는 붉은 빛에 의해 조명 빛 단단한 상자에서, 사용자 정의 데이터 수집 소프트웨어에 연결된 카메라가 동시에 여섯 파리의 위치를​​ 모니터링합니다. 각 비행은 중앙에 음식 냄새가 포함 된 개별 경기장에서 도보로 제한됩니다. 테스트 경기장이 기능은 냄새의 축적을 방지하기 위해 다공성 바닥에 놓습니다. 악취 소스, 다른 생리적 상태 하에서 후각 민감도를 반영 메트릭을 찾을 수있는 레이턴시, 소프트웨어 분석에 의해 결정된다. 여기에서, 우리는이 행동 패러다임을 실행하는 중요한 역학 토론 및 비행 loadi에 관한 구체적인 문제를 다루NG, 악취 오염 분석 온도, 데이터 품질 및 통계 분석.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

식품 검색 및 식품 소비 1 : 기아의 미국 appetitive 행동의 두 가지 유형을 촉진합니다. 이 간단한 행동 분석은 2,3 꼴과 관련된 화성 행동의 연구에 유용합니다. 구체적으로는, 음식 냄새 목표 위치에 비행 위치, 보행 속도와 대기 시간을 추적합니다. 식품 지견 대기는 내부 appetitive 상태 변경의 하류 플라이 악취 검출 시스템의 감도의 변화를 측정하기위한 메트릭으로서 역할을한다. 이 분석의 수동 버전은 이전에 GABA-B 수용체의 신호가 3 비행 어른 냄새 현지화 행동에 대한 중요한 표시하는 데 사용되었다. 분석의 현재 자동화 된 버전은 신경 펩타이드 F (sNPF) 신호가 초파리의 후각지도를 재 형성하고 영향이 행동 2를 appetitive 방법 짧은 연구에서 쓸모 있었다.

시험은 어둡고, 온도 및 습도 조절 실에서 이루어집니다. 디지털투명 아크릴 테스트 판 이상으로 설정 비디오 카메라는 660 nm의 LED 조명에 의해 백라이트 파리를 추적 할 수 있습니다. 카메라로부터의 정보는 다음에 테스트 영역에 주둔 컴퓨터에 의해 실시간으로 처리된다. 우리는 테스트 기간 동안 비행 위치의 좌표를 기록하고 저장하는 데이터 수집 소프트웨어를 사용합니다.

이 패러다임에서는, 피사체가 중앙에 음식 냄새가 포함 된 무대로 출시되며 냄새 객체는 비행에 식품 검색 동작을 유도 경기장 내에서 악취 음식 그라데이션을 만듭니다. 비슷한 냄새 검색 프로토콜은 하나의 초파리 유충 7 chemosensation의 연구 방향으로 적용되었습니다. 이러한 4 개의 필드로 olfactometer 4,5 또는 T-미로 6과 같은 다른 행동 분석은 냄새 회피 또는 매력 행동을 평가하는 동안,이 패러다임은 최고의 후각 감성과 화성 행동을 평가하기에 적합합니다.

몇 가지 주요 장점이 ASSA 함께예. 데이터 수집 및 분석은 대부분 자동화되어 있기 때문에 첫째는, 대용량 데이터 세트의 빠른 획득을 허용한다. 둘째,이 분석은 격리하고 따라서 그들의 행동에 영향을 미칠 수있는 사회 후각 신호를 제거, 단일 파리의 동작을 측정한다. 셋째, 프로토콜 및 간단한 실험 설계의 단순 분석이 효율적으로 다른 사람을 가르 칠 쉽게.

또한,이 분석은 상기 초파리 8 가능한 광범위한 유전 툴킷과 조합하여 식품 검색 동작을 밑에 신경 회로를 조사하는데 사용될 수있다. 침묵 또는 흥분 뉴런 같은 GAL4-UAS 시스템뿐만 아니라 UAS-shibire의 TS1, UAS 파상풍 독소 및 UAS-TRPA1 (B)와 같은 도구를 사용하여 달성 될 수 있다는 도입 유전자의 표적 식 9-12를 도입 유전자.

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프로토콜

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1. 비행 수집 및 기아

  1. 후면 12 시간 빛 / 어둠주기에 제어 온도와 습도 조건 (예를 들어, 21 ° C, 50 ~ 60 % 상대 습도)에서 실험 비행.
  2. 여성 우화의 날에 파리를 수집하고 (최대 30 병 기준) 새로운 식품 유리 병에, 4 ~ 5 명의 남성과 함께 배치합니다. 나이는 2-5 일 파리.
  3. 플라이 기아의 챔버를 준비합니다.
    1. 빈 플라스틱 병의 바닥에 이르기까지 하나의 조직 (4.8 X 8.4 인치)를 밀어 넣습니다. 완전 증류수로 조직을 적신다. 조직 아래로 밀어 부드럽게 물을 짜내 개체를 사용합니다.
    2. 여분의 물을 버리고 병을 거꾸로. 이 촉촉한 수화 파리와 기아 챔버를 유지하기에 충분한 물을 수 있지만, 파리를 익사하는 것만으로는 충분하지됩니다.
  4. 기아 실에 식품 유리 병에서 파리를 전송하고 실험을 시작하기 전에 유리 병에게 약 18 ~ 24 시간을 연결합니다. 저장밤새 제어 온도와 습도 조건에서 유리 병 실험 다음날 시작될 때까지.

2. 음식 냄새의 준비

  1. 아가로 오스 유리 플라스크 내의 증류수 10 ㎖에 낮은 용융 온도의 0.1 g을 첨가하여 1 % 아가로 오스 용액을 준비한다. 비등하기 시작 그냥 때까지 전자 레인지에 아가로 오스 솔루션을 열하지만 분출도 전에.
    1. 전자 레인지를 중지하고 한 번 플라스크를 소용돌이 친다. 아가로 오스가 완전히 용해 될 때까지 두 번 더이 단계를 반복합니다. 50 ℃로 설정 열판에 플라스크를 따뜻하게 유지하여 액체 상태의 아가로 오스 솔루션을 유지
  2. 1 % 사과 사과 식초 솔루션을 만들기 위해 1.5 ㎖의 에펜 도르프 튜브에 1 % 아가로 오스 솔루션의 9​​90 μL와 사과 사이다 식초의 10 μl를 추가합니다. 소용돌이까지 솔루션을 50 ° C로 설정 마른 목욕 인큐베이터에서 혼합 및 장소

3. 테스트 룸 및 동작 실 설치

  1. 원하는 조건 (예 : 온도 및 습도)에 시험 장소를 설정합니다.
  2. LED 패널 (660 NM)를 켭니다.
  3. 뜨거운 물을 체 및 테스트 접시를 씻어 물기가 증발 할 때까지 건조 오븐을 가열한다. 시작 실험을하기 전에 테스트 실온으로 체와 접시를 냉각.
  4. 확산 판의 상단에 얕은 접시를 놓고 로컬 습도를 증가시키고, 아가 로스 액적 내의 물을 마스킹하는 물을 채운다.
  5. 물 접시 위에 체를 배치합니다.

4. 테스트 플레이트에 로딩 비행

테스트 플레이트 사양 다이어그램은 보충 파일 섹션에서 찾을 수 있습니다. 테스트 판은 투명 아크릴로 만든 6 테스트 경기장으로 구성되어있다. 간단한 슬라이더에 각각의 챔버로 플라이로드, 임시 봉쇄, 6 파리의 동시 발매를 허용 들고 챔버를 포함실험의 시작. 취기가 피펫 할 위치를 접시에 각 분야의 중심에 에칭 십자선이 나타냅니다.

  1. 아크릴 테스트 판에 슬라이더를 삽입합니다.
  2. 부드럽게면 플러그 과거 유리 병에 흡입기를 밀어 약 6 파리가 aspirator.it에 빠질 수 있도록하는 것은 그들을 취급 될 수있는 한 부드럽게 대하기 위해 중요합니다. 하나는 희미한 광원을 향해 유리 병 구멍을 지정하여 흡인기으로 크롤링 파리를 유도하기 위해 phototactic 비행 동작을 활용할 수 있습니다. 필요한 경우, 하나는 약 6 여성 파리를 대기음에 부드럽게 흡입을 적용 할 수 있습니다.
  3. 테스트 판의 첫 ​​번째 구멍에 흡입기의 끝을 삽입합니다. 하나의 비행 감방에 전달하고 부드럽게 다음 구멍에 비행을로드 앞으로 슬라이더를 진행 할 수 있습니다. 파리는 판의 6 들고 세포를 차지할 때까지 계속합니다.
  4. 직접 CR의 중심 상에 1 % 사과 사이다 식초 아가로 오스 솔루션의 피펫 5 μL테스트 플레이트의 내부면에 OSS-털이.

5. 테스트 플레이트의 위치를

  1. 테스트 판을 중앙에, "위치 Tool.vi."라는 이름의 파일을 엽니 다 위치 도구에 대한 "의 LabVIEW VI. vi는 보충 파일 섹션에서 찾을 수 있습니다. 화면의 왼쪽 상단 모서리에있는 흰색 화살표를 클릭하여 파일을 실행합니다.
  2. 경기장의 열기가 체 바닥에 직면하고 냄새 대상이 판의 천장에되도록 체의 상단에 테스트 판을 놓습니다. 모니터 화면에 십자선과 테스트 판의 뒷면에 새겨 져 십자선을 맞 춥니 다.
  3. 정렬이 완료되면, 모니터의 왼쪽 상단 모서리 부근에 위치 빨간 점을 클릭하여 실행을 중단.

6. 실험 기간 동안 비행 위치를 기록

  1. 각 식품 검색 시험 동안 비행의 좌표를 추적하고 기록하기 위해, 수집 소프트웨어 파일을 열고 "층Y 추적 -. 여섯 Zones.vi "의 LabVIEW VI를위한"비행 추적 - 식스 Zones.vi는 "보충 파일 섹션에서 찾을 수있는 모니터의 왼쪽 상단에있는 흰색 화살표를 클릭하여 파일을 실행합니다. .
  2. 파일 이름을 지정하고 클릭 "OK."
  3. 테스트 경기장에 파리를 공개하는 테스트 챔버에서 슬라이더를 사전. 이 분석 소프트웨어 좌표 부적절한 조정으로 이어질 것 같은 테스트 챔버를 이동하지 않도록주의하십시오.
  4. "시작"(녹화 시작)을 클릭하고 테스트 실에서 빛의 유일한 소스가 660 nm의 LED 패널 있는지 확인합니다.
  5. 시험이 완료되면, 체와 행동 실을 제거합니다. 체에서 테스트 판을 들어 올려 얼음 접시를 잠수하여 파리를 제거합니다. 부드럽게 뜨거운 물과 함께 접시를 청소하고 아가로 오스 파편을 제거합니다. 수분을 제거하는 건조 오븐에서 테스트 판을 놓습니다.
  6. 스말을 설정하여 테스트 환기를약 2 분 동안 L 팬. 팬의 전원을 끄고 다음 테스트 판에 파리의 다음 그룹을로드합니다.

7. 사용자 정의 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석

"비행 추적 식스 영역에 대한 데이터 분석은"보충 파일 섹션에서 찾을 수 있습니다. 데이터 수집 동안 수집 소프트웨어 레코드 개별 플라이 위치는 텍스트 파일의 각 시점 좌표. 테스트 플레이트 위에 위치 단일 디지털 카메라는 0.5 ㎐의 프레임 레이트로 화상을 취득한다. "플라이 추적 식스 영역에 대한 데이터 분석은"해당 텍스트 파일의 정보를 추출하여 분석 소프트웨어 프로그램) 평균 속도를 산출, b) 성공적 악취 소스 위치하고, 비행 c) 그래픽 윈도우​​를 작성하는 시점을 결정 보기에 사용자를 허용하는 : 시간에 시간과 평균 비행 속도에 냄새 소스의 위치, 파리의 거리를 비행. 또한 spre에 쉽게 수출에 대한 데이터 형식을adsheet 프로그램. 이 매크로에서, 식품 검색 대기 시간은 경기장의 중심 5mm 반경 내에서 적어도 5 초를 보내고 파리되는 시점으로 정의된다.

  1. 분석 소프트웨어 파일 "- 식스 영역 비행 추적을위한 데이터 분석"을 엽니 다. "윈도우"탭에서 "새 테이블을 만듭니다."를 클릭 여섯 테이블이 생성 될 때까지이 단계를 반복합니다.
  2. "매크로"탭에서 클릭 "Foodfinding." 주 패널은 다음과 같은 옵션이 나타납니다 : 오픈 원시 데이터 레이아웃 파일, 열기 원시 데이터가 데이터 파일에 대해 파일, 비행 위치, 거리, 속도, 레이아웃, FormatDataFile.
  3. 텍스트 파일에 값을 추가하지 않고 원시 데이터를 볼하려면 클릭 "레이아웃에 대한 열기 원시 데이터 파일." 찾아 표시되는 브라우저 창에서 실험 데이터 파일을 선택합니다. 를 클릭하십시오 "열기."
  4. 여섯 경기장 (각 비행을 묘사 여섯 XY 플롯 '의 각 각 비행의 위치를​​ 보려면 "비행 위치"를 클릭합니다시간이 지남에의 위치)이 화면에 나타납니다.
  5. 냄새 소스 (시간이 지남에 따라 냄새의 소스에서 파리의 거리를 묘사하는 여섯 그래프가 화면에 나타납니다)에서 각각 파리의 거리를 볼 수 "거리"를 클릭하십시오. Y = 5mm의 수평 라인은 파리가 음식 소스에있는 것으로 간주되는 임계 값을 나타냅니다.
  6. 시험 (시간이 지남에 파리의 속도를 묘사 여섯 그래프가 화면에 나타납니다) 동안 각 비행의 평균 속도를 볼 수 "속도"를 클릭하십시오.
  7. 평균 (처음 50 초 동안) 속도와 각 비행의 냄새 소스 (그림 1)을 찾는 대기 시간뿐만 아니라 모든 비행 위치, 거리, 속도 그래프와 레이아웃을 표시하기 위해 "레이아웃"을 클릭합니다. 적절히 배치를 위해서는, 여백을 조정할 필요가있다. 이 작업을 수행하려면 먼저 레이아웃 창을 클릭합니다. "파일"탭에서 클릭 "레이아웃을위한 페이지 설정을 선택합니다." 에 여백을 재설정0.2 인치에서 "확인"을 클릭하십시오. 즉시 각 위치 플롯의 왼쪽은 제목 "속도"와 함께 작은 테이블 "대기." 각 제목 아래에 입력 한 값은 mm / 초 및 초 식품 검색 대기 시간에 평균 속도를 나타냅니다. 대기에서 빈 항목은 비행 냄새 소스를 찾을 실패를 나타냅니다. 식품 검색 대기 시간은 파리 챔버의 중심에서 5mm 반경 내에서 적어도 5 초를 소비하는 시점으로 정의된다.
  8. 레이아웃을 인쇄하려면, 레이아웃 영역 (현재 파일에 대한 업데이트 레이아웃)을 클릭합니다. "파일"을 클릭하고 다음을 클릭합니다 "인쇄 레이아웃."
  9. 다음 파일을 보려면, 단순히 클릭 "레이아웃에 대한 열기 원시 데이터 파일." 당신이보기 및 클릭 할 다음 원시 데이터 파일을 클릭 "OK." 새로운 데이터 파일과 창을 업데이트 할 레이아웃 창을 클릭합니다.
  10. 이 설정은 나중에 사용하기 위해 실험을 파일에 저장 될 수 있습니다.

8. 에서 데이터 내보내기스프레드 시트 프로그램으로 데이터 분석 소프트웨어

  1. 각 파일에 대한 속도와 지연 시간 데이터를 내보내려면, 클릭 "열기 원시 데이터가 데이터 파일에 대한 파일." 실험 데이터 파일을 선택하고를 클릭하십시오 "열기." 새 브라우저 창이 나타납니다.
  2. 새 브라우저 창에서 "새"를 마우스 오른쪽 단추로 클릭 한 다음을 클릭합니다 "텍스트 문서." 새 텍스트 문서의 이름을 지정합니다. 새로 명명 된 텍스트 파일을 선택하고를 클릭하십시오 "열기." 이 저장 텍스트 파일에 원시 데이터 파일의 데이터.
  3. 다른 파일에서 데이터를 내보내려면 "데이터 파일 열기 원시 데이터 파일."클릭 다른 파일을 클릭하고 클릭하십시오 "열기." ) 단계 8.2에서 텍스트 파일을 선택합니다. 당신은 내보낼 남아있는 데이터 파일에 대해이 과정을 계속합니다.
  4. 원하는 모든 데이터 파일은 텍스트 파일에 추가되면, 클릭 "포맷의 데이터 파일." 이전 단계에서 데이터를 저장하고 새로운 진열창에게 ( "열기"를 클릭하는 데 사용되는 텍스트 문서를 선택W는 자동으로) 열립니다.
  5. 창에 새 텍스트 문서를 만드는 파일의 이름을 지정하고 클릭 "저장." 이것은 각각의 비행 및 스프레드 시트 프로그램으로 가져올 수 있습니다에 대한 파일 이름, 평균 속도, 대기 시간을 포함하는 텍스트 파일을 만듭니다.
  6. 누적 그래프는 시간의 함수 (도 3)와 같은 음식 냄새 목표 도달 파리의 총 수에 대한 데이터로 구성된다.
  7. 실험 데이터 세트를 비율에 대한 Z-테스트를​​ 이용하여 통계적인 유의성을 분석한다.

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결과

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데이터 분석 소프트웨어 및 레이아웃은,도 1에서 알 수있는 일례의 분석 조건의 설정에 따라 10 분의 시험 기간 동안 각 플라이의 성능을 평가하는 데 사용된다. 다음 기준은 각 비행의 데이터를 데이터 분석을 위해 사용됩니다 인한 부상, 질병, 스트레스, 또는 동기 부여의 부족으로 음식의 검색 작업을 수행 할 수없는 그 파리를 제거하도록 설계 여부를 결정하는 데 사용됩니다.

300 개 이상의 초 비활성 파리는 '비활성'으로 간주하고 그들은) 이미 음식 소스를 찾는데 성공 또는 b) 최소 100 초 동안의 평균 속도> 10mm / 초를 전시하지 않는 데이터 세트에서 거부됩니다 비 활동 기간 (그림 2A, 2B, 2C)를 다음.

건강한 파리는 즉시 보유 챔버에서의 릴리스에 따라 강력한 검색 동작을 나타낸다. 따라서, 만 파리를 선택하는활성 냄새 검색의 초기 단계 건...

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토론

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이 프로토콜에서는, 우리는 음식의 검색 행동 분석을위한 단계별 절차를 설명합니다. 식품 관련 악취 외에도, 또한 다른 냄새 개체를 찾을 플라이 능력의 연구를 위해 적응 될 수있다. 예를 들어, 남성 파리 3 메이트 현지화 행동의 연구 방향으로 적용 할 수있는 몇 가지 추가 고려 사항은 우리가이 절차에 관한 여기에서 언급 할 것이다이 프로토콜에 대한이 있습니다. :

첫째, 사육 온도는 실험 비행 테스트하기 전에 세되는 방법을 결정합니다. 그것은 나이의 범위는 실험에 가장 적합한 연령을 결정하기 위해 검사하는 것이 좋습니다. 21 ° C에서 사육 예를 들어, 우리의 경험에서, 공급 굶주린 비행 응답의 차이는 4 ~ 5 일 숙성 한 후 가장 강력한입니다.

둘째, LED는 심지어 번째 아래에 조명을 일정하게 만드는 역할을하는 유리 확산 판을 조명전자 아크릴 실. 충분히도, 상수, 밝은 조명은 파리의 움직임을 자동...

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 더 경쟁 금융이자를 선언하지 않습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 국립 보건 연구소 (R01DK092640)과 국립 과학 재단 (National Science Foundation) (0,920,668)에서 JWW에 연구 보조금에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Apple Cider VinegarSpectrum시판되는
Agarose, Type VIISigma-AldrichA0701저겔화 온도 Agarose
아크릴 테스트 플레이트사용자 정의플레이트에는 6 개의 경기장이 포함되어 있습니다. 각 경기장은 직경 60mm, 높이 6mm입니다. 구체적인 측정은 테스트 플레이트 다이어그램을 참조하십시오.
LabVIEW V.8.5National Instruments776670-09플랫폼: PositioningTool.vi, FlyTracking--Six Zones.vi 참고: "경과 time.vi", "file.vi 까지의 시간" 및 "두 개의 객체 detect.vi"는 주요 데이터 수집 프로그램인 "FlyTracking--Six zones.vi"을 실행하기 위해 사용 가능해야 하는 서브루틴이 포함되어 있습니다.
LabVIEW Vision 8.5
LabVIEW Vision Acquisition 소프트웨어 8.5
LabVIEW Vision Builder AI 3.5
Igor Pro V.6Wavemetric, Inc.매크로를 위한 플랫폼: 플라이 트래킹을 위한 데이터 분석--Six Zones
Basler scA1390-17fmNational Instruments779980-01디지털 카메라 참고: Baslerweb.com 8 mm 렌즈에서 사용 가능한 카메라용
드라이버 National Instruments780024-01Basler 디지털 카메라용 렌즈
그라운드 글라스 디퓨저 플레이트Edmund Optics맞춤형확산광, 25 cm x 30 cm
US Std. No. 100Fischer Scientific04-881X체, 공칭 개구부 150 μ m
조명 옵션 1
LED 백라이트 660nm(20cm x 20cm)Spectra WestBL47192더 간단하지만 더 비싼 조명 옵션입니다.
LED 백라이트 용 전원 공급 장치Spectra West
Lighting Option 2< / strong>
660 nm LEDSuperbrightledsRL5R1330파장 660nm (14.7 인치 x 9.75 인치 패널 용 약 7 x 7 LED 어레이)
선형 DC 전원 공급 장치GW InstekGPS-1830DLED 패널 용 전원 공급 장치
무납땜 브레드 보드Digikey922354-NDLED용 브레드 기판

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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  2. Root, C. M., Ko, K. I., Jafari, A., Wang, J. W. Presynaptic facilitation by neuropeptide signaling mediates odor-driven food search. Cell. 145, 133-144 (2011).
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  7. Fishilevich, E., Domingos, A. I., Asahina, K., Naef, F., Vosshall, L. B., Louis, M. Chemotaxis behavior mediated by single larval olfactory neurons in Drosophila. Curr. Biol. 15, 2086-2096 (2005).
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  10. Kitamoto, T. Conditional modification of behavior in Drosophila by targeted expression of a temperature-sensitive shibire allele in defined neurons. J. Neurobiol. 47, 81-92 (2001).
  11. Sweeney, S. T., Broadie, K., Keane, J., Niemann, H., O'Kane, C. J. Targeted expression of tetanus toxin light chain in Drosophila specifically eliminates synaptic transmission and causes behavioral defects. Neuron. 14, 341-351 (1995).
  12. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).

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