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방법 논문

무 혈청 전체 배아 배양 시스템에서 마우스 배아 개발

26.3K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/50803

⸱

2014년 3월 1일

 , 
1Neuroscience Division of the Biomedical & Health Sciences Institute, University of Georgia, 2Department of Cellular Biology, University of Georgia

이 논문에서

요약

배아 배양에 활용 혈청 특히 신호의 상호 작용을 포함하는 연구 실험의 결과에 영향을 미칠 수있는 알 수없는 구성 요소가 포함되어 있습니다. 여기서 우리는 혈청 산소 배양 시스템을 활용하고 16-40 시간 동안 배양 한 중간 회임 마우스 배아가 자궁에서 개발 태아에 비해 형태 개발을 전시 것을 보여줍니다.

초록

중간 회임 스테이지 마우스 배아 산소화 롤링 병 배양 시스템에서 시판 줄기 세포 미디어 보조제로부터 제조 무 혈청 배지를 이용하여 배양 하였다. E10.5에서 마우스 배아는 신중 그대로 난황과 자궁에서 분리하고, 난황과 태아의 혈관 연속성을 유지하면서 정확한 수술 기동을 포함하는 과정에서 배아는 부드럽게 난황에서 exteriorized했다. 그대로 난황 또는 제거 난황을 준비 배아에 비해,이 배아는 우수한 생존율과 유사한 조건에서 배양 개발 진행을 보였다. 우리는이 마우스 배아 때 16-40 시간 동안 37 ° C에서 95 % O 롤링 병 배양 장치의 2 / 5 % CO 2의 분위기에 정의 된 배지에서 배양, 비교 형태의 성장과 발전을 전시 것을 보여 배아는 자궁에 개발. 우리는 토륨 생각방법은 배아의 기관 형성에 중요한 신호의 상호 작용을 연구하기 위해 전체 배아 문화를 활용할 필요가 조사에 유용 할 것입니다.

서론

체외에서 전체 배아를 이용한 배양 방법은 자궁에 접근하기 어려운 배아의 기관 형성에 관여 메커니즘을 신호 공부하기에 적합합니다. 전체 배아 조직의 무결성을 제공하고 필수적인 메커니즘을 신호의 적시 발생에 매우 중요한 조직의 상호 작용에 대한 적절한 지원 기관 형성 기간 동안 다른 세포 과정에 대한. 전체 배아 문화는 등 이식 연구, 유전자 및 조직 조작 구슬 주입 연구, 독성 연구, 같은 응용 프로그램의 과다를위한 플랫폼을 제공하는 반면., 현재 사용 배아 배양 시스템은 태아의 적절한 성장과 유지 보수를위한 혈청에 주로 의존 문화 1-9.

혈청 배양 배지 6 ~ 8, 10, 11의 10-100%에 이르기까지의 주요 구성 요소의 하나로서 활용되고 있습니다.하지만, 혈청의 조성물은 잘 정의되지 않은 동물 및 동물에 따라 다를 수 있고, 각 시간은 혈청을 수집한다. 혈청 실험 준비 시간을 소모하고 엄격한 절차를 포함하는 동안, 조달 혈청 상업적으로 다른 많은 사이에 상당한 변화를 전시 및 실험 비용을 발생시킵니다. 이러한 추가, 혈청은 잠재적으로 특정 실험의 결과에 영향을 미칠 수있는 성장 인자, 호르몬, 또는 다른 단백질, 조직의 상호 작용에 중요한 신호 분자의 연구를 포함하는 특히 알 수없는 요소를 포함 할 수있다. 연구는 문화 혈청의 첨가가 잠재적으로 순환 아데노신 monophosphate (캠프) 및 세포 분열 신호 및 phosphoinositide 3에 관련된 단백질 (PI 3) - 키나제 경로 12-14 신호와 같은 특정 신호 전달 분자의 세포 내 수준을 변경할 수있는 것으로 나타났습니다. 이들과는 반대로, 무 혈청 배양 시스템은 항원이없는 환경의 이점을 제공한다세포 프로세스를 변경할 수 생물학적 활성 효소 절제 실험 사이의 일관성을 가능하게합니다.

본 연구에서는 37에서 95 % O 롤링 병 배양 장치의 2 / 5 % CO 2의 분위기에서 문화 중반 태동 단계 전체 배아에 상업적으로 이용 가능한 줄기 세포 미디어 보충제 제조 된 무 혈청 배지를 이용 C 15, 16 °. 이러한 정의 된 조건에서 16-40 시간 동안 배양 한 쥐의 배아 세포의 증식, 이동, 분화 및 조직 상호 작용의 적절한 수준을 나타내는 등의 심장, 사지, 뇌, 눈 등 전체 배아 몸과 다른 구조의 형태 개발 진행을 보였다. 같은 눈과 같은 복잡한 장기 시스템 중 하나에 대한 문화의 배아 발달의 분자 분석은 EMBR에 안구 조직의 관찰과 일치하는 눈 개발을 발표YOS는 (준비, Kalaskar과 로더데일) 자궁에서 개발. 따라서 우리는 중앙 임신 단계에서 배양 한 쥐의 배아가 자궁에서 개발 태아에서 관찰 된 것과 유사한 진보적 인 성장과 형태 개발을 전시 것을 보여줍니다.

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프로토콜

마우스 배아 문화 :

모든 실험 절차를 검토하고 지속적으로 규제 감독을 유지 조지아 기관 동물 관리 및 사용위원회의 대학에 의해 승인 된 프로토콜 번호의 A2010 07-119, 다음의 건강 지침의 국립 연구소와 엄격한에 따라 실시되었다.

1. 문화 미디어의 준비

  1. 녹아웃 DMEM 녹아웃 혈청 교체 (KSR) (10 %), N-2 보충 (1X), 알부민, 소 혈청에서 (2 %), 페니실린 (다음 금액에 시판 줄기 세포 미디어와 보충 교재를 사용하여 배지를 준비 50 IU / ㎖), 스트렙토 마이신 (50 ㎍ / ㎖) 및 암포 테리 신-B (1.25 ㎍ / ㎖). 제조 된 배양 배지는 이전에 다음과 같은 변경으로 15 기술과 유사하다 : 안티 mycotics의 추가 및 특정 시약 및 장비의 세부 사항에 대한 항생제의 두 배 농도 (리에게 참조를 사용하여재료의 성).
    참고 : 이전에 사용 (. 무어 - 스콧 등 15) 등의 항생제 농도는 배아 문화가 24 시간 기간까지 실시에 충분했다. 문화가 24 시간 이상 지속 된 경우에는, 우리는 문화의 오염을 경험하고이 성공적으로 항생제 농도를 두 배로에 의해 제어되었다.
  2. 4 ° C에서 나 제조업체의 권장 사항에 따라 -20 ° C에서 미디어 구성 요소를 저장합니다. KSR 및 N-2 보충을 반복 동결 융해를 방지하기 위해 -20 ° C에서 분주에 보관해야합니다. 한 번 개봉 녹아웃 DMEM 제조 업체의 권고에 따라 30 일 이내에 사용하여야한다. 사용하기 전에, 37 ° C의 물을 욕조에있는 구성 요소를 따뜻하게
  3. 멸균 조건에서 미디어를 준비합니다. 모든 장비와 문화 후드에 배치하기 전에 70 % 알코올 스프레이와 미디어 구성 요소를 포함하는 병의 표면을 소독.
  4. 미디어 구성 요소는 무균 비이커에 직접 필터 시스템 (코닝)에서 하나를 혼합 할 수있다. 먼저 녹아웃 DMEM에 알부민 분말을 추가합니다. 알부민이 완전히 용해 될 때까지 부드럽게 흔들어 잘 섞는다. 그런 다음 N-2 보충, KSR 및 항생제를 추가하고 피펫을 사용하여 잘 혼합. 그 후 진공 흡인으로 0.22 ㎛의 공극 크기의 필터를 사용하여 미디어를 살균 고를. 사용할 때까지 4 ° C에서 50 ML 원뿔 튜브 및 저장소에 미디어를 분배. 일단 제조 된 미디어 문화 4 ~ 5 일 이내에 사용해야합니다.

2. 문화 장비의 제조

  1. 유리 배양 병 및 고무 마개를 소독. 알루미늄 호일의 문화 병을 감싸고 물을 비이커에 고무 병 코르크를 배치하고 고압 증기 멸균에 의해 소독.
  2. 문화를 시작하기 전에 70 % 알코올 스프레이 따뜻한 37 ° C에와 문화 실 (정밀 보육 단위)를 소독. 문화 챔버는 전자입니다문화 병을 보유하고있는 중앙에 회전 디스크를 보이지 않네요. 챔버로 가스 흐름은 압력계에 의해 규제되고 유량 끝에 유리관에서 물을 통해 공기 방울의 유출을 관찰함으로써 조정될 수있다. 이 롤링 병 배양 장치는 새로운 Cockroft (17)에 의해 도입 된 원래 장치의 수정 된 버전입니다.
  3. 배양 챔버에 95 %, O2 / 5 % CO 2의 혼합 가스를 함유하는 가스 실린더를 연결하고 50 CC / 분의 유량을 제공하고 충분한 산소 공급을 보장 "초당 하나의 기포"에 가스 흐름을 조절 문화 배아.

3. 마우스 배아 수집 및 문화를위한 준비

  1. 야생형 마우스 배아를 얻으려면, 우리는 C57BL/6J 및 CD-1 (찰스 리버 연구소) 유전 적 배경 계통의 마우스를 이용했다.
  2. 매일 아침 질 플러그의 암컷 생쥐를 확인합니다. 일을 찾는 일에 정오전자 질 플러그 E0.5 DPC (일 성교를 게시)로 간주되어야한다.
  3. 표준 프로토콜 다음 임신 쥐를 안락사에 의해 E10.5 DPC에 마우스 배아를 수집합니다. 마우스는 미국의 의학 협회 (AVMA) 동물의 안락사 (2013)에 대한 지침에 지정된대로 CO 2 흡입 장치를 이용하여 안락사했다. 죽음을 보장하기 위해, 자궁 경부 전위는 CO 2에 노출 된 후 실시 하였다.
  4. 악기에 복부 머리의 고착을 방지하기 위해 복부 복부 표면에 70 % 에탄올 스프레이. 그런 다음 날카로운 무딘 운영 가위와 자궁의 위치를​​ 집게를 microdissecting에서 4-3/4의 쌍을 사용하여 배쪽으로 복강을 엽니 다. microdissecting 집게에 4를 사용하면 전체 자궁을 들어 올려 자궁 몸에와 자궁 뿔의 끝에서 빛을 운영 가위로 절단하여 몸에서 분리.
  5. 빨리 씻어 1X PBS에서 전체 자궁은 37 ° C로 가열자궁에있는 혈액의 고집을 제거하고 즉시 DMEM에 배치하는 페트리 접시에 37 ° C로 가열. 더 사용하기 전에 70 %의 에탄올 스프레이기구를 소독.
    참고 : PBS, DMEM과 문화 매체를 포함하고, 전체 과정 동안 37 ° C에서 그들을 유지하는 솔루션을 예열하는 것은 좋습니다.
  6. 해부 현미경, 자궁 준하는 빛 운영 가위로 해부한다. 이것은 (무딘 단부) 변경됨 microdissecting 용 핀셋 부드럽게 개구를 넓히기 위해 삽입 될 수있는 분할 된 자궁의 양쪽에 작은 개구 초래한다. 이것은 조심스럽게 레이 처트의 막을 정수리 난황 (PYS)를 노출 microdissecting 핀셋 한 쌍의 찢어에 의해 제거 될 수있다 태반 탈락의 노출을 허용합니다. 핀셋의 한쪽 가장자리를 사용하여 부드럽게 PYS와 함께 레이 처트의 막을 뚫고 일부터 분리전자 난황 (VYS를) 기본은 그대로 VYS으로 배아를 노출 층. ectoplacental 콘과 trophoectoderm 유도체는 태반의 탈락 또는 레이 처트의 막으로도 제거 할 수 있습니다. 치료는 태아가 즉시 팝업으로 VYS의 파열을 방지하기 위해주의해야합니다.
  7. 그대로 VYS와 배아는 배양 배지는 플라스틱 전송 피펫을 사용하여 37 ° C로 가열이 들어있는 페트리 접시에 전송해야합니다.
    참고 : 바로 자궁에서 분리 한 후 배양 배지에 전송 문화 배아의 더 나은 발전을 위해 도움이됩니다.
  8. 작은 구멍은 주요 혈관을 피하는 microdissecting 핀셋 한 쌍의 난황에서해야한다. 핀셋 샤프한 쌍 부드럽게 머리 영역에 인접 영역에 관통하여 개구부를 만들기 위해 사용될 수있다. 또는 무딘 핀셋 두 쌍의 난황을 잡고 조심스럽게 작은 구멍을 만들기 위해 눈물을 사용할 수 있습니다.그런 다음 부드럽게 배아의 머리에 맞게 충분한 크기로 족집게로 확장하여 개방을 확대. 밀접하게 배아를 포장하는 양막 부드럽게 떨어져 몸에서 개최 핀셋을 사용하여 찢어해야합니다. 15 주머니 노른자의와 배아 혈관의 무결성을 유지하면서 배아 머리 이후 전체 배아 부드럽게 난황에서 exteriorized해야한다.
    참고 : 난황 혈관에 어떤 손상이 잠재적으로 문화 태아의 발달에 영향을 미칠 수있다. 손상된 혈관과 같은 배아는 배양을 위해 사용해서는 안되며 나중에 폐기 할 수있는 배아를 준비 사용할 수 있습니다.
  9. 배아 준비 기준 : 몸과 머리의 크기, 사지 각 그룹에서 두 개 이상의 배아를위한 체절의 수 (들)을 계산하여 눈의 형태와 단계 등의 형태 학적 기준에 따라 해부 현미경 및 그룹에서 배아를 검사합니다.
    <강한> 참고 : 보통 자궁 내 발달에있는 같은 쓰레기의 차이에서 얻은 몸의 크기, 형태 학적 특징과 somites의 수에 차이가 배아. 그러나, 우리는 우리의 형태 학적 기준에 따라 분류 된 배아는 보통 비슷한 체절 번호 (± 1) 전시 것으로 나타났습니다. 이러한 이유로, 본 배양을 시작하는 시간을 지연하는 것처럼 각각의 배아위한 somites를 카운트 할 필요가 없다.
    참고 : 문화 somites를 계산하는 데 사용 된 배아를 사용하지 마십시오. 배양 개시까지의 시간 지연을 방지하기 위해 다른 배아위한 배양을 시작한 후 somites 횟수. 자궁에서 분리 한 후 배양 연기 된 배아는 보통 가난한 개발을 나타낸다.
  10. 매체는 37 ° C로 가열 신선한 문화를 페트리 접시에 즉시 배아를 전송하고 배아를 다시 멸균의 cultur와 페트리 접시에 전송해야하는 문화 후드로 가져전자 매체는 매체와 문화 병에 넣어 전에 문화를 시작합니다.
    참고 : 배아에 대한 다수의 미디어 전송을 문화 배아 수집 및 해부의 여러 단계가 문화 후드에 설치되지 않은 해부 현미경을 수행 하였다으로 오염을 방지하는 데 도움이되기 전에.
    참고 : 쓰레기의 크기 (> 12 배아), 공정의 절반 배아 크고 문화를 시작하거나 배지와 함께 접시에 넣어 37 ℃에서 CO 2 배양기에 배치하는 경우 배아는 더 긴 기간 (> 35 ~ 40 분) 밖에 서 왼쪽 때 우리는 천천히 그리고이 문화에 나중에 개발에 영향을 미칠 것입니다 심장 박동을 관찰했다.

4. 마우스 배아를 배양

  1. 문화 후드에서 멸균 배양 병을 열고 적절하게 레이블을 붙입니다. 문화 매체의 이동 3 ㎖를 t에 각각 37 ° C로 가열그 병 후 마우스 배아 멸균 플라스틱 이전 피펫을 사용하여 배양 병으로 부드럽게 이송한다. 문화 병은 배양 장치의 회전 디스크에 문화 병을 유지하는 데 도움이 고무 병 코르크 덮인해야합니다.
    참고 : 미디어와 문화 병 쥐를 안락사 전에 준비 및 배양 장치의 회전 디스크에 배치 할 수 있습니다. 이것은 배양 병에 배아의 전송 시간을 단축시킨다.
    참고 : 마우스 배아는 개별적으로 또는 같은 문화 병 두 개 또는 세 개의 배아와 공 배양으로 배양 될 수있다.
  2. 문화 병은 무균 적으로 37 ° C에서 배양 장치에 실시 단단히 고무 코르크 회전 디스크의 구멍에 후크해야합니다. EMBR의 무료 부상을 수 분 (RPM) 당 35 회전의 일정한 속도로 회전하는 회전 디스크를 켭니다또한 언론과의 YOS은 배아 조직으로 무료 가스 교환에 도움이됩니다. 문화 실에 연결된 실린더에서 가스는 문화 병에 회전 디스크와 고무 마개를 통해 흐른다.
  3. 정기적으로 문화 16-40 시간 동안 배아 및 가스 유출 및 문화 챔버 온도를 확인합니다.
    참고 : 마우스 배아의 조작을 문화 : 배아가 적어도 30 분 동안 배양 조건에 적응하자. 그런 저조한 수행 미약 하트 비트를 나타내는 배아는 폐기 될 수 있고, 나머지는 상기 배아 조작 연구에 이용 될 수있다. 이러한 일렉트로의 5,9,16, microinjections 18, 구슬 주입 16, 약물 치료 및 기타 절차 등의 배아 조작은이 시간에 수행 할 수 있습니다. 우리는 성공적으로 초기 눈 개발에 자신의 역할을 연구하는 특정 신호 전달 분자로 취급 아피 - 겔 아가로 오스 비즈의 주입을 수행 하였다. 배아 후조작은 새로운 매체에 다시 반환과 문화에 계속 될 수있다.
  4. 9 ~ 10 시간과 문화의 18 ~ 19 시간 배양 40 시간 동안 계속 된 후 특정 간격으로 완전히 새로운 미디어와 문화 매체를 교체합니다.
    참고 : 문화가 16 ~ 18 시간에 의해 정지되는 경우 문화 미디어 교체가 필요하지 않을 수 있습니다.
  5. 문화의 성공의 측정 : 문화의 배아 성장이 신체 크기의 증가, 체절 번호와 머리, 사지, 심장, 눈의 형태 개발에 의해 평가되어야한다 동안 문화 배아의 생존이 몸에 볼 심장 박동과 혈액 순환에 의해 결정되어야한다.
  6. E11.0 DPC (~ 40-41들)과 E12.0 DPC (~ 49 ~ 50 초)에서 자궁 개발 배아에서 각각 16 ~ 18 시간과 38 ~ 40 시간, 배양 한 배아를 비교하기위한 대조군으로 사용되어야한다.
  7. 문화 동안과 자궁의 단계에 대해 서로 다른 시점에서 배아 발달은 존을 할 수 있습니다해부 현미경 하에서이라는 군. 스팟 이미징 소프트웨어는 이미지를 캡처하기 위해 이용 이상 화상 처리 소프트웨어를 사용하여 처리 하였다.

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결과

마우스 배아의 개발은 전 자궁 자궁이 배아는 배양 시간에 몸에서 분리 될 때부터 여러 요인에 따라 달라집니다. 그림 1에 도시 된 바와 같이, 절차는 몸에서 임신하는 자궁의 분리 (그림 1A), 그대로 난황 (그림 1B)와 배아의 분리를 포함하여 일련의 단계를 포함, 난황에서 배아의 exteriorization ( 그림 1C), 37 ° C에서 95 % O 롤링 병 배양 장치의 2 / 5 % CO 2의 분위기에 혈청이없는 배지에서 배아를 배양 바로 자궁에서 분리 한 후 배양 배지로 전송하면 태아는 100 % 생존을 전시. 이러한 배양 조건, 마우스 배아에서 경우에 해당하는 개발 단계의 배아에서 관찰에 16-40 시간 전시의 성장과 형태 학적 개발을위한 배양 비교자궁 (그림 2).

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토론

중간 임신 단계 마우스 배아는 37 ° C에서 95 % O 2 / 5 더 롤링 병 배양 장치에서 %의 CO 2의 분위기에 혈청이없는 배지에서 배양 하였다 배아 개발 EX의 자궁은 자궁이 문화의 완성 (그림 1)에 안락사 생쥐에서 분리되는 순간부터 절차를 수행하는 동안 각 단계에서 여러 요인에 결정적으로 의존했다. 발전을 좌우하는 가장 중요한 요소는 배양을 시작하는 데 걸리는 시간이었다. 대부분의 치료를 필요로하는 절차를 수행하는 동안 다른 중요한 점은 그대로 노른자 자궁에서 골목과 난황에서 배아의 exteriorization와 배아의 분리 등의 단계를 포함한다. 설치류 원반 태반이 때, 자궁 분절 해부 태반 탈락이 약간 모서리 파손 되더라도 배아에 혈액 공급을 손상하지 않았다. 사실이 에이에 작은 구멍을 왼쪽으로무딘 포셉 한 쌍의 부드럽게 열고 자궁 그대로 난황을 가진 배아 쉽게 격리를 가능하게하는 태반의 탈락을 찢어 삽입...

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공개 사항

우리는 어떤 경쟁하는 금융 이익이 없습니다.

감사의 글

우리는 문화 기술과의 도움이 조언을 쥴리 고든 박사 낸시 맨리에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 어린이 녹내장 재단과 샤론 - 스튜어트 무 홍채 증 연구들에 의해지지를 받고 있습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
KnockOut DMEMInvitrogen10829-018
KnockOut Serum ReplacementInvitrogen10828-028
N-2 보충제Invitrogen17502-048재고: 100x
알부민, 소 혈청SigmaA9418-50G재고: 100%
항생제 - 항진균 용액Cellgro30-004-Cl스톡: 페니실린(10,000IU/ml); 스트렙토마이신(10,000 &마이크로; g/ml; 암포테리신(250 µ g/ml) 
DMEM   Cellgro15-013-CV
정밀 인큐베이터 유닛B.T.C. ENGINEERING Milton Cambridge EnglandId.No. 840-374
회전 장치용 유리병B.T.C. 엔지니어링
실리콘 고무 코르크B.T.C. Engineering
95% O2/5% CO2 실린더AirGas Inc.
Stemi SV11 Apo 해부 현미경Zeiss
Stemi SV6 현미경Zeiss
CO2 워터 재킷 인큐베이터Forma Scientific모델: 3110
Culture HoodNuaire 생물학적 안전 캐비닛 클래스 II TypeA2모델: Nu-425-600
수조Fisher ScientificIsoTemp205
무게 저울Mettler ToledoAG285
원심분리기 튜브, 50 mlCorning430291
Light 작동 가위RobozRS-6702
작동 날-둔탁한 가위 RobozRS-6812
미세해부 집게, 4인치RobozRS-5211
미세해부 집게 - Hudson (cWALD), 4-3/4 inRobozRS-5237
미세해부 핀셋 (5/45)RobozRS-5005수정됨 - 날카로운 끝이 뭉툭하게 만들어졌습니다
(5)RobozRS-5060수정됨 - 날카로운 끝이 뭉툭하게 만들어졌습니다.
미세 해부 핀셋 (55)RobozRS-5063수정 - 날카로운 끝이 무딘
악기 트레이RobozRT-1401S
악기 트레이 뚜껑RobozRT-1401L
페트리 접시 - 100mmFisher Scientific087571Z
페트리 접시 - 60mmFisher Scientific0875713A
페트리 디쉬-35 mm피셔 사이언티픽0875711YZ
필터 시스템 ( 0.22 &마이크로; m 셀룰로오스 아세테이트)-150 ml코닝431153
필터 시스템 (0.22 µ m 셀룰로오스 아세테이트)-250 ml코닝430756
필터 시스템 (0.22 µ m 셀룰로오스 아세테이트) - 500mlCorning430758
Pipet-aid PipettorDrummond Scientific Co.D57849
혈청학적 피펫-10 mlVWR89130-898
일회용 혈청학적 피펫-25 mlCorning4251
이송 피펫 - 7.7 mlThermo Scientific202-20S

참고문헌

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