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방법 논문

의 광학 검출 E. 대장균 박테리아

16.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/50805

⸱

2013년 11월 20일

 ,  , 
1Department of Biotechnology and Food Engineering, Technion - Israel Institute of Technology, 2The Inter-Departmental Program of Biotechnology, Technion - Israel Institute of Technology, 3The Russell Berrie Nanotechnology Institute, Technion - Israel Institute of Technology

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

급속한 균 검출 용 라벨없는 광 바이오 센서가 도입된다. 바이오 센서의 표면에 직접 표적 균 세포를 포착하기 위해 디자인 된 나노 다공성 실리콘에 기반하고있다. 우리는 포획 프로브로서, 다공질 변환기에 고정화 된 모노클로 날 항체를 사용한다. 우리의 연구는 (같은 세포 용해와 같은) 더 이전의 샘플 처리와 분 이내에 낮은 세균 농도의 검출에 대해 이러한 바이오 센서의 적용 가능성을 보여줍니다.

초록

나노 다공성 실리콘을 기반으로하는 레이블의 광학 바이오 센서 모델 미생물로, 대장균 K12 박테리아의 빠른 캡처 및 탐지를 위해 설계되었습니다. 연구 시료 (세포 용해에 의해 예)에는 전처리가 필요하지 않습니다 동안 바이오 센서는 표면에 대상 박테리아 세포의 직접 결합에 의존하고있다. 포러스 Si 박막은 바이오 센서의 광 변환 소자로서 사용된다. 백색광 조명 아래에서, 다공성 층은 반사율 스펙트럼에서 잘 해결 페 브리 - 페로 프린지 패턴을 표시합니다. 고속 푸리에 단일 피크의 반사율 데이터 결과로 변환 (FFT)을 적용. FFT 피크의 강도의 변화는 모니터링됩니다. 따라서, 목표 세균은 항체 - 항원 상호 작용을 통해, 바이오 센서의 표면에 포착 박테리아 부속의 '실시간'관측을 허용 FFT 피크의 강도에 측정 가능한 변화를 유발한다. NT "> 전기 화학적 양극 산화 공정에 의해 제조 된 메조 포러스 Si 막는, 목표 세균 특정 단일 클론 항체와 접합된다. 고정화 immunoactivity 및 항체의 특이성은 형광 라벨링 실험에 의해 확인된다. 바이오 센서에 노출되면 타겟 박테리아, 세포를 직접 항체 개질 다공질 실리콘 표면에 포착된다. 이들 특정 캡쳐 이벤트가 바이오 센서의 박막 광학 간섭 스펙트럼의 강도 변화의 원인. 우리는 이러한 바이오 센서 (검출 비교적 낮은 균 농도를 검출 할 수 있음을 입증 시간 미만 10 4 세포 / ml)의 제한입니다.

서론

병원성 세균의 초기 정확한 식별은 음식과 물 안전, 환경 모니터링, 점의 배려 진단 1를 위해 매우 중요하다. 전통적인 미생물학 기술은 시간이 힘들고, 소모적이며, "실시간"또는 실험실 환경 외부 미생물을 감지하는 능력을 결여 같이, 바이오 센서는 이러한 과제 2-5을 충족하도록 진화하고있다.

최근 몇 년 동안, 다공성 실리콘 (PSI)은 센서와 바이오 센서 6-20의 디자인을위한 유망한 플랫폼으로 떠오르고있다. 지난 십 년간 PSI 기반의 광 센서 및 바이오 센서에 관한 많은 연구가 (21, 22)를 발표했다. 나노 PSI 층은 전형적으로, 단결정 실리콘 웨이퍼로부터 전기 화학적 양극 에칭에 의해 제조된다. 그 결과 PSI의 나노는 큰 표면 및 무료 볼륨으로 많은 유리한 특징을 전시, 제어 할 수있는 크기와 조정 가능한 OPTI 기공칼 속성 10,16. 이러한 광 발광 8,11과 흰색 빛의 반사율 기반의 간섭 7,19로 PSI 층의 광학적 특성은, 강력하게 환경 조건에 의해 영향을 받는다. 광 발광 스펙트럼 변조 또는 반사율 스펙트럼 (10)의 파장 변화로 관찰 필름의 평균 굴절률 변화에 다공질 층 결과 사이 숙박객 분자 / 분석 대상 물질의 캡처.

PSI 광 바이오 센서 기술의 광대 한 혁신 있지만, 박테리아 검출 6,8,20,23-29에 대한 PSI 기반 플랫폼에서만 몇 가지보고가있다. 또, 이러한 개념 증명 연구의 대부분은 "간접"균 검출을 증명하고있다. 따라서, 세포의 용해는 일반적으로 선행 연구 균 29 특성상 표적 단백질 / DNA 단편을 추출하는 것이 요구된다. 우리의 접근 방법은 직접적으로 표적 균을 포착하는 것이다PSI 바이오 센서 상에 세포. 따라서 박테리아를 대상으로 특정 단일 클론 항체는, 다공성 표면에 고정되어있다. 항체 - 항원 상호 작용을 통해, 박테리아 세포의 결합은, 바이오 센서의 표면에 반사율 스펙트럼 24-26의 진폭 (강도)의 변화를 유도한다.

이 작품에서 우리는 광학 PSI 기반의 바이오 센서의 구조에보고하고 대장균의 검출 (대장균) (모델 미생물로 사용) K12 박테리아. 모니터의 레이블이없는 바이오 센서 플랫폼으로의 응용을 보여 광 신호로 인해 페 브리 - 페로 박막 간섭 (그림 1A)에 PSI 나노 구조에서 반사 된 빛이다. 빛의 진폭 / 강도의 변화는 빠른 탐지 및 박테리아의 정량화를 허용, 바이오 센서 표면에 대상 박테리아 세포의 특정 고정 상관 관계가있다.

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프로토콜

1. 산화 된 다공성 SiO2로 제조

  1. 일정한 전류에서 30 초 동안 수성 HF과 무수 에탄올의 3:1 (V / V) 용액에 에칭 실리콘 웨이퍼 (단 하나 측이 <100>의 얼굴에 광택과 도핑 된 p 형, 0.0008 Ω · cm) 385mA / cm 2의 밀도. HF는 부식성 액체이며, 그것은 극단적 인주의하여 취급해야한다는 것을주의하시기 바랍니다.
  2. 절대 에탄올을 생성 된 다공성 실리콘 (PSI) 필름의 표면을 여러 번 헹구고, 건조 질소 가스하에 필름을 건조.
  3. 주변 공기에서 1 시간 동안 800 ° C (해제, 1 시간 동안 노에두고, 800 ° C로 가열로 가열, 실내 온도에서 가열로에서 샘플을 장소에서 튜브로에서 갓 에칭 PSI 샘플을 산화 용광로) 만 실온에서로에서 샘플을 제거합니다.

2. PSiO 2 발판의 Biofunctionalization

  1. 산화 된 PSI (PSI를 품어O 2) 메르 캅토에서 1 시간 (톨루엔 트리 메 톡시-3) 95 % (MPTS) 솔루션 (108 MM)에 대한 샘플.
  2. 톨루엔, 메탄올 및 아세톤으로 실란 처리 PSiO이 샘플을 씻어, 건조 건조 질소 가스하에.
  3. 100 ㎜ PEO-요오 비오틴 용액 1 ㎖에 30 분간 실란 변성 PSiO이 시료를 배양한다.
  4. 0.1 M 인산 완충 식염수 (PBS) 용액을 여러 번 비오틴 처리 PSiO 2 샘플을 씻어.
  5. 100 ㎍ / ㎖의 스트렙 타비 딘 (SA) 용액 1 ㎖에 30 분간 비오틴 - 수정 PSiO 2 샘플을 품어.
  6. 0.1 M PBS 용액을 여러 번 SA 처리 PSiO 2 샘플을 씻어.
  7. 100 ㎍ / ㎖의 바이오틴 E. 1 ㎖에 30 분 동안 생성 된 SA-수정 PSiO 2 샘플을 품어 대장균 단일 클론 항체 (면역 글로불린 G, IgG의) 용액 또는 100 ㎍ / ㎖의 바이오틴 - 토끼 IgG를 가진 (단일 클론 항체 모델로).

3. 형광 라벨 및 형광 현미경

  1. 15 ㎍ / ㎖의 형광 (FITC)와 IgG의 수정 표면을 품어 40 분 동안 항 토끼 IgG의 태그 및 15 ㎍ / ㎖의 형광 (FITC)와 컨트롤로 안티 마우스 IgG의 태그.
  2. 0.1 M PBS 용액을 여러 번와 수정 된 샘플을 씻어.
  3. 형광 현미경으로 샘플을 검사합니다.

4. 박테리아의 문화

  1. E.에게 경작 대장균 K12의 루리아 베르 타니 (LB) 배지 (: 염화나트륨, 효모 추출물 5 g의 5 g을, 그리고 트립 톤 10 g의 탈 이온수 1 L 중간 구성) 5 ㎖와 10 ㎖ 튜브에 박테리아. 박테리아가 하룻밤 37 ℃에서 진탕 배양한다
  2. 600 ㎚의 파장에서의 광학 밀도 (OD)를 판독함으로써 박테리아 농도를 모니터링한다. LB 배지에서 밤새 성장 후, 박테리아의 농도를 결정하는 분광 광도계를 사용하여 OD (600)를 읽는다. 세포의 수는이다 디레OD 600 측정 (1 OD 600 = 10 8 세포 / ml)에 ctly 비례.

5. 박테리아 검출

  1. IgG의 수정 PSiO 2 깔끔한 PSiO 2 (제어)을 맞춤 제작 플렉시 유리 흐름 세포의 샘플을 놓습니다. 샘플 반사율이 모든 측정시 같은 장소에서 측정 될 수 있도록 흐름 ​​셀을 수정합니다.
  2. E.와 샘플을 품어 실온에서 30 분 동안 대장균 K12 현탁액 (104 세포 / ㎖). 그런 다음 30 분 동안 V 식염수 / W 0.85 %로 셀을 세척하여 세균 현탁액을 제거합니다.
  3. 실험을하는 동안 반사율 데이터의 변경 사항을 모니터링합니다. 모든 광학 측정은 주변 수계에서 수행 될 필요가있다. 스펙트라는 CCD 분광계를 사용하여 데이터를 수집하고 (25), (26)을 앞서 설명한 바와 같이 고속 푸리에 변환 (FFT)에 변환을 적용함으로써 분석되어야한다.
  4. 에 박테리아의 존재를 확인할바이오 센서의 표면 바로 바이오 센싱 실험 후 수직 광학 현미경으로 시료의 관찰.

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결과

프로토콜 문자 섹션에서 설명한 산화 PSI (PSiO 2) 필름을 제조한다.도 1b는 열 산화 처리 후의 결과 PSI 필름의 고해상도 주사 전자 현미경 사진을 나타낸다. PSiO 2 층은 30 ~ 80 ㎚의 범위의 직경을 갖는 잘 정의 된 원통형 세공에 의해 특징된다.

단일 클론 항체 (IgG의) 분자는 비오틴-SA 시스템과 함께 잘 설립 실란 화 기술을 사용하여 PSiO 2 표면에 이식된다. 자세한 합성 방식은 그림 2에 설명되어 있습니다. 우선, 열 산화막 표면을 티올 - 실란 화 된 표면 (도 2C)의 결과 MPTS하여 실란 화된다. 다음 단계에서, 활성화 된 표면은 비오틴-SA 교량을 통해 비오틴 변성 표면 SA 단백질의 부착 하였다 SH-반응성 비오틴 링커 분자 (도 2D)와 인큐베이션 <...

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토론

PSiO 2 나노 구조체 (페롯 박막)에 근거 라벨없는 광 immunosensor가 제작되고, 균 검출을위한 바이오 센서로서의 적용 가능성이 확인된다.

수정 및 문제 해결

immunosensor을 설계의 주요 관심사 중 하나는 바이오 센서 감도 31,32의 감소로 이어질 수 고체 기판 상에 증착 및 패터닝 중에 바람직하지 않은 형태의 변화를 겪는 항체의 감수성이다. 이 문제를 최소화하기 위해, PSiO 2 표면에 항체의 결합은 비오틴-SA 다리를 통해 수행됩니다. SA와 비오틴은 일반적으로 인해 높은 결합 친 화성 (K의 D ~ 10 -13 M)에 많은 생명 공학 응용 프로그램에 사용됩니다. 비오틴-SA 링크는 바이오 센서 개발 10,32,33,34에서 실시 수용체 고정화를위한 가장 흔한 화학 물질 중 하나이다. ...

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공개 사항

저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

감사의 글

이 작품은 이스라엘 과학 재단 (부여 번호 1118년에서 1108년까지 및 승인 번호 12분의 1,146)와 미나 크롤 기념 연구 기금에 의해 지원되었다. ES는 기꺼이 러셀 Berrie 나노 기술 연구소의 재정 지원을 인정합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Si 웨이퍼Siltronix Corp.높은-B-도핑, p-type, 0.0008 Ω-cm 저항률, < 100> 배향
수성 HF(48%)Merck101513
에탄올 앱솔루트Merck818760
PBS 완충 용액(pH 7.4)50mM Na2HPO4, 17mM NaH2PO4 및 68mM NaCl을 Milli-Q 물(18.2MΩ)에 용해하여 준비합니다.
0.85g NaCl을 100ml Milli-Q 물(18.2M&Omega)에 용해하여 제조한식염수 0.85% w/v
95% (3-메르캅토프로필)트리메톡시실란(MPTS)시그마 알드리치 화학 물질175617
PEO-요오도아세틸 비오틴시그마 알드리치 화학물질 B2059
스트렙타비딘(SA)잭슨 면역 연구소 Inc.016-000-114
플루오레세인(DTAF)-스트렙타비딘잭슨 이뮤노리서치 랩스016-010-084
비오틴화 토끼 IgGJackson ImmunoResearch Labs Inc.011-060-003
형광 태그 토끼 방지 IgGJackson ImmunoResearch Labs Inc.111-095-003
형광 태그 안티 마우스 IgGJackson ImmunoResearch Labs Inc.115-095-003
비오틴화E. coli 항체Jackson ImmunoResearch Labs Inc.1007
E. coli (K-12)는 Technion의 Sima Yaron 교수에 의해 아낌없이 공급되었습니다.

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