막 척추 : 막 단백질의 단백질 - 단백질 상호 작용을 식별 할 수있는 생화학 적 도구 생체

요약

생화학 적 방법은 막 단백질의 생체 내 단백질 - 단백질 상호 작용 (PPI)를 식별하기 위해 설명된다. 이 방법은 단백질 교차 결합, 친화력 정화 및 질량 분석을 결합하여 거의 모든 세포 유형이나 유기체에 적응할 수있다. 이 방법을 과도 프로톤 펌프 억제제의도 식별이 가능하게된다.

초록

막 단백질은 세포 생존에 필수적이며, 따라서 중요한 치료 표적 ^1-3이다. 그들은 단지 ^4에서 작동하기 때문에, 상호 작용을 파악하고 특징 짓는 방법은 ⁵ 필요합니다. 이를 위해, 우리는 막 척추 ^6라고 불리는 막 연쇄상 구균 단백질 상호 작용의 실험을 개발했다. 이 기술은 연쇄상 태깅 막 미끼 단백질의 친화도 정제하여 리버시블 가교제 포름 알데히드를 사용하여 가교 생체 내에서 결합한다. 절차 중에 가교 먹이 단백질은 막 단백질을 미끼로 공동 정제이어서 비등에 의해 분리된다. 막 등뼈를 사용하여 막 단백질의 단백질 - 단백질 상호 작용 (프로톤 펌프 억제제)를 분석 할 때 따라서, 두 가지 주요 작업을 실행할 수 있습니다 : 첫 번째, 면역 블, 그리고에 의해 제안 된 상호 작용 파트너의 확인 번째, 질량 분석 분석에 의해 새로운 상호 작용 파트너의 식별 . 또한,도 L친화력 아야, 과도 프로톤 펌프 억제제는이 기술에 의해 감지됩니다. 마지막으로, 막 척추는 막 단백질의 프로톤 펌프 억제제를 식별 할 수있는 강력한 검사 도구로 적용하고, 거의 모든 세포 유형에 적응할 수있다.

서론

단백질의 기능을 이해하기 위해 그것의 파트너 상호 작용을 아​​는 것이 필수적이다. 여러 고전적인 기술은 수용성 단백질의 상호 작용 파트너의 ID를 사용할 수 있습니다. 그러나, 이러한 기술은 소수성 ^4에 의한 막 단백질을 쉽게 양도 할 수 없습니다. 이 한계를 극복하기 위해, 우리는 막 연쇄상 구균 단백질 상호 작용 실험 (막 척추) ^6을 개발했습니다. 그것은 수용성 단백질 ⁷ 만 적합한 척추 방법을 기반으로합니다.

가교제의 포름 알데히드의 두 가지 장점에서 막 척추의 장점은 첫째, 포름 알데히드는 쉽게 세포막을 통과하기 때문에 살아있는 세포 ⁸ interactome의 정확한 스냅 샷을 생성 할 수 있습니다. 둘째, 포름 알데히드 상호 링크는 ^{9 끓는으로} 되돌릴 수 있습니다. 여기서, 이러한 두 가지 이점은 멤브레인 PROTE 영구 아니라 과도 프로톤 펌프 억제제뿐만를 식별하는 데 사용기능 ^6.

요컨데, 패 혈성-태그가 일체형 멤브레인 미끼 단백질의 C-말단에 융합된다. 막 미끼 단백질을 발현하는 세포는 간 링크가 막 미끼 단백질로 단백질을 먹이로 포름 알데히드

프로토콜

참고 : 프로토콜에 표시된 버퍼에 대한 자세한 정보는 표 1에서 사용할 수 있습니다.

1. 포름 알데히드는 살아있는 세포 간 연결하여 단백질 - 단백질 상호 작용의 고정

1. 성장 미디어, 주식 솔루션 및 버퍼 P1을 준비 시작하려면
   1. 500 ㎖의 배지를 준비 매체 막 미끼 단백질과 먹이 단백질 간의 상호 작용을 지원하는 조건을 제공한다. 또, 하나의 실험에서는 어떠한 상호 작용 (가교없이 예) 예상되는 조건 하에서 수행되어야한다.
      참고 : 우리는 스트레스가 아닌 스트레스를 박테리아의 단백질 - 단백질 상호 작용을 비교합니다. 따라서, 우리는 우리가 2 L 삼각 플라스크에 스트레스 유도제 (예를 들어, 0.5 M의 NaCl)으로 보완 500 ㎖의 루리아 베르 타니 (LB) 배지 (표 1)를 준비하고 있습니다. 제어를 위해, 우리는 0.17 M 염화나트륨 (산도 7.0)와 일반 LB 매체를 사용합니다.
   2. 트리스 버퍼를 준비합니다 (20 mM 트리스-HCL;의 pH 8.0) 및 0.1 M 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA), pH를 8.0 원액 (표 1). ....

결과

멤브레인 척추 분석은 막 단백질의 공동 정화 및 일시적으로 상호 작용 단백질 파트너를 허용한다. 공동 정제는 가교제 포름 알데히드를 사용함으로써 달성된다. 포름 알데히드 농도 및 가교 시간 : 두 매개 변수는 비특이적 교차 결합을 방지하기 위해 중요하다. 포름 알데히드의 과도한 충분하지만, 사용하지 않는 간단 면역 블 롯팅에 의해 제어 될 수있다. 포름 알데히드 가교 결합 된 단백질 복합체는 SDS 처리에 의해 보일 수 있지만 의해 분리 될 수있다. 따라서, 그들은 unboiled 샘플의 면역 블롯의 상단에있는 얼룩과 패 혈성 - 태그 막 미끼 단백질의 블로 팅 후 시각화 할 수 있습니다.

필요한 모든 컨트롤을 포함 멤브레인 척추 분석의 대표적인 결과는 그림 2에 표시됩니다. 미끼 단백질로서 대장균의 적분 막 단백질 CpxA는 ^6,11를 사용 하였다. CpxA는 센서 키나아제이며 이루어져큰 extracytopl.......

토론

막 척추 분석을 확인하고 막 단백질의이 시점 알 수없는 상호 작용 파트너 식별을 가능하게하는 생화학 적 방법입니다. 막 척추 연쇄상 구균 태그가 막 미끼 단백질의 정제와 포름 알데히드에 의해 생체 내 가교에 결합한다. 면역 블로와의 조합은 예상 상호 작용 파트너의 확인 (그림 2)을 용이하게한다. 또한, MS의 분석과 함께 알 수없는 상호 작용 파트너의 식별 (그림 3)을 허용합니다. 두 애플리케이션은 해당 단백질의 먹이를 수정하기위한 요구 사항이 없다. 또한, 막 척추 내생 먹이 단백질 ^(6)의 검출을 허용 할 수있을만큼 충분히 민감하다.

여기, 우리는 그람 음성 세균의 막 단백질에 최적화 된 프로토콜을 제시한다. 그람 음성 박테리아의 봉투 외에도 환경이나 민병대으로부터 세포질을 분리세포질 막, 외막과 murein의 sacculus. 따라서, 우리의 프로토콜은 소위 spherop.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
37% 포름알데히드	Roth	4979.1	1년 이상 오래되어서는 안 됨
DNaseI	Sigma	DN25
BCA 단백질 분석 키트	Pierce	23225
Micromagnetic rod	Roth	0955.2	길이 5mm, 직경 2mm
Triton X-100	Roth	6683.1	가용화를
위한 표준 세제n-Dodecyl-β-maltoside	Glycon	D97002-C	, CpxA
1 ml Strep-Tactin superflow gravity flow column	IBA	2-1207-050
Strep-tag 단백질 정제 버퍼 세트	IBA	2-1002-001	버퍼 W와 버퍼 E
포함 Amicon Ultra-4 원심 필터	Millipore	UFC803024
SuperSignal West Pico 화학발광 기판	Pierce	34080
SilverQuest Silverstaining kit	Invitrogen	LC6070
FireSilver Staining Kit	Proteome Factory	P-S-2001
Ultracentrifuge