Bluetongue 바이러스에 대한 항 바이러스제 소설의 식별에 대한 분석

요약

세포 변성 효과 (CPE) 기반의 분석, 용량 - 반응 분석 및 시간 - 중 - 추가 TOA () 분석 등의 세 가지 분석은 물론, 개발, 최적화, 검증 및 Bluetongue 바이러스에 대한 새로운 항 바이러스제 (BTV)를 식별하기 위해 사용 된 새로 확인 된 항 바이러스제에 사용할 수있는 기계 장치의 액션 (대학교 미술관)을 결정하기로.

초록

BTV에 대한 잠재적 인 항 바이러스제를 확인하기 위해, 우리는 개발, 최적화 및 여기에 제시된 세 가지 분석을 확인했다. CPE 기반의 분석은 화합물은 항 바이러스 효능을 보여 큰 화합물 라이브러리를 화면으로 사용되었는지 여부를 평가하기 위해 개발 된 최초의 분석이었다. 한편, 항 바이러스의 세포 독성은 CPE 기반 분석을 사용하여 평가 될 수있다. 용량 - 반응 분석을 선택된 바이러스에 대한 효능의 범위를 결정하기 위해 디자인 된, 50 % 억제 농도 (IC _50)이나 유효 농도 (EC _50)뿐만 아니라 세포 독성의 범위 (CC ₅₀₎ 즉. 토아 분석은 BTV 바이러스 라이프 사이클 또는 호스트 세포 기계에 대한 가능한 영향 동안 새로운 항 바이러스제의 기본 메커니즘을 결정하는 최초의 대학교 미술관의 연구에 사용 하였다. 이러한 분석은 세포 배양 시스템의 항 바이러스 효능을 평가하는데 매우 중요합니다, 우리의 최근의 연구지도를 위해 사용되어왔다BTV에 대한 새로운 항 바이러스제의 숫자의 식별을 보내고.

서론

BTV는 속 Orbivirus, 가족 Reoviridae에 프로토 타입 이중 가닥 RNA 바이러스이다. BTV는 세계 ^1,2 30억달러 / 년 손실, 양, 염소, 소와 다른 가축 등 국내 가축의 가장 중요한 질병 중 하나입니다. 이국적인 BTV의 혈청 형에 나열된 중요한 동물 병원체는 "USDA 높은 위험성 평가 가축 병원체." 최근 다시 부상 BTV의 북부 유럽 ^3,4에 걸쳐 여러 국가의 주요 가축 질병의 발생과 양을 발생했습니다. 경제적으로 중요한 결과 및 모델 시스템으로서, BTV는 유용한, 분자 유전 학적 및 구조적 연구의 대상이되어 왔으며, 몇몇 백신이 개발되었다. 그러나, 항 바이러스 약물 발견을위한 적합한 분석법의 부족 때문에, BTV 대에는 항 바이러스제는 없다.

모델 시스템으로 BTV를 사용하여 최근의 높은 처리량 검사 (HTS) 캠페인, 우리는 거라고, eveloped 최적화 아르보 바이러스 ^5에 대한 잠재적 인 광범위한 스펙트럼 항 바이러스를 식별 할 수있는 CPE 기반의 분석을 확인. CPE 기반의 분석은 신속하고 관찰 할 수있는 CPE / 세포 사멸 ^5-7을 유발 바이러스의 숫자에 대한 항 바이러스 약물 발....

프로토콜

1. 셀, 바이러스 및 항 바이러스 화합물

1. BSR 세포, 5 % 소 태아 혈청 (FCS)를 포함하는 아기 햄스터 신장의 파생 둘 베코의 변형 이글 배지 (BHK) 세포를 ^{10 일} (DMEM)을 유지, 100U/ml 페니실린 및 100 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신.
2. 세 가지 분석을 위해, 1 % FCS, 100U/ml 페니실린 및 100 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신과 DMEM에 플레이트 세포, ^5는 이전 최적화로. 이 매체는 세 가지 분석을위한 분석 매체로 언급된다.
3. 5 % CO _2와 80~95%의 습도, 37 ° C에서 인큐베이터에있는 모든 세포를 품어.
4. 패 정화 이전에 ⁸ 바와 같이 유형 10 BTV (BTV-10)를 전파. 지정된 각 분석에 대한 분석 매체에 BTV-10을 희석.
5. 10 mM의 농도에서 주식을 형성하기 위해 DMSO의 모든 테스트 화합물을 용해. -20 ° C에서 주식을 저장
6. 를 지정 대한 분석 배지를 사용하여 원하는 농도로 화합물을 희석D의 분석 ^2.

2. CTG 키트를 사용하여 CPE 기반 분석

....

결과

1. 화합물의 항 바이러스 효능

세포 기반 분석 CPE는, 개발 및 최적화 이전 ^2,5 바와 같이 BTV 대해 신규 바이러스제를 식별하는 발광 기반 CTG 키트를 사용하여 시험 관내에서 입증되었다. 열 - 투여 량 반응 분석은 살아있는 세포 ^5,11 제시 세포 ATP의 정량에 기초 문화 대사 생존 세포의 수를 측정함으로써 확인 된 리드 화합물의 항 바이러스 효능 및 독성을 반영하기 위해 사용 하였다. 우리의 이전 보고서에서 잠재적 인 항 바이러스 화합물의 수는 BTV ^5에 대한 HTS를 통해 식별 된 각 클러스터에서 화합물을 포함하여, 평가, 및 그 유도체를 통해 새로이 합성 ^2했다. 해당 EC _(50)에 기초하여, CC ₍₅₀₎ 및 SI _(50)는 여러 가지 유망한 납 화합물은 강력한 항 바이러스 효능, 낮은 독.......

토론

바이러스 히트 초기 식별, 항 바이러스 약물 발견과 개발을위한 중요한 단계 중 하나는, 정량 가능한 마커를 선택하는 간단한 프로토콜을 개발, 충분한 신호와 10 % 미만의 CV를 획득 포함하는 견고한 분석법을 개발하는 것이다. 대부분의 생화학 적 또는 세포 - 기반 화면 인해 선별 과정에서 필요한 재현성 및 스크리닝하는 분자의 잠재적으로 많은 수의 가장 강력한, 간단하고 저렴한 분석, 기초 화학 시작점을 제공하도록 설계된다. CPE 기반 분석은 큰 화합물 라이브러리에서 효과적인 히트를 식별하기 위해 이러한 요구 사항을 충족하도록 지정되었다. CPE는 바이러스의 증식과 관련된 배양 된 세포에 악영향을 의미한다. 다양한 분석법기구에게 사균의 수 (세포 독성), 생균 수 (생존)를 나타내는 다른 마커의 다양한 측정을 통해 CPE 표시기를 사용 가능하고,세포 사멸 (아폽토시스). CPE 기반 분석 용 상용 시약은 간단한 분석 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 예를 들어, CTG 키트는 하나의 "혼합 및 측정"단계를 포.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DMEM 매체	Gibco	1134218	세포 배양용
FBS	Gibco	16000044	세포 배양용
0.05% 트립신-EDTA	Gibco	1000185	세포 배양용
DPBS	Gbico	1049769	세포 배양용
CellTiter-Glo(CTG) 키트	Promega	TB288	세포 생존율 측정용
70% 에탄올	피셔	S25309B	95%
항바이러스 화실화합물	NIH MLSMR 및 de novo 합성
BTV-10	ATCC	VR-187
BSR 셀	에서
Synergy-II 다중 모드 마이크로플레이트 리더	BioTek		광 신호 판독용
MicroFlo 선택 디스펜서	BioTek		세포, 바이러스 및 시약 추가
384웰 평면 바닥 마이크로플레이트	CORNING	28908031	세포 배양용
Gen. 5 소프트웨어	BioTek		Synergy-II 다중 모드 마이크로플레이트 리더의 판독 출력 분석용
GraphPad Prism 5 GraphPad		버전 5	생물 정적 분석 및 플롯용

희석 자체 개발 발