Method Article

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor(특수 대형 장기 생물반응기를 이용한 비인간 영장류 폐 탈세포화 및 재세포화)

DOI:

10.3791/50825

⸱

December 15th, 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Stem Cell Research and Regenerative Medicine, Tulane University School of Medicine, 2Division of Regenerative Medicine, Tulane National Primate Research Center, 3Department of Microbiology and Immunology, Tulane University School of Medicine, 4Department of Pharmacology, Tulane University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

전체 장기 탈세포화는 재생 의학에 사용될 수 있는 자연적인 생물학적 골격을 생성합니다. 폐 재생의 비인간 영장류 모델에 대한 설명이 제시되는데, 이는 전체 폐가 탈세포화되고 성체 줄기 세포와 내피 세포를 파종하여 혈관 순환과 액체 매체 환기를 촉진하는 생물 반응기에 파종되는 것입니다.

Abstract

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현재와 미래의 장기 이식 요구를 충족시킬 수 있는 폐의 수가 충분하지 않습니다. 생체 인공 조직 재생은 전통적인 장기 이식에 대한 매력적인 대안입니다. 이 기술은 장기의 자연적인 생물학적 세포외 기질(ECM)을 자가 세포 또는 줄기/전구 세포를 원래 조직의 재생을 촉진하는 방식으로 파종하고 배양할 수 있는 골격으로 활용합니다. 자연적인 ECM은 탈세포화(decellularization)라는 과정에 의해 격리됩니다. 탈세포화는 ECM을 온전하게 유지하면서 세포 물질을 효과적으로 제거하기 위해 일련의 세제, 염 및 효소로 조직을 처리함으로써 이루어집니다. 설치류 폐의 탈세포화(decellularization)와 그에 따른 재세포화(recellularization)를 활용하여 수행된 연구는 생체 내에서 가스 교환이 가능한 폐와 유사한 조직을 생성하는 데 미미한 성공을 거두는 것으로 나타났습니다. 설치류 모델은 필수적인 개념 증명을 제공하지만 인간이 사용할 수 있도록 직접 변환할 수는 없습니다. 비인간 영장류(NHP)는 최종 임상 사용을 위한 생체 인공 장기 생산의 사용을 조사하는 데 더 적합한 모델을 제공합니다.

NHP 붉은털 원숭이에서 얻은 폐의 완전한 탈세포화를 달성하기 위한 프로토콜이 제시됩니다. 생성된 무세포 폐에는 중간엽 줄기 세포 및 내피 세포를 포함한 다양한 세포가 파종될 수 있습니다. 원고는 또한 세포 파종된 원숭이 폐를 음압 환기와 혈관 구조를 통한 박동 관류에 의해 제공되는 기계적 신축성 및 변형 조건에서 배양할 수 있는 생물 반응기 시스템의 개발을 설명합니다. 이러한 힘은 각각 폐 및 내피 계통을 따라 분화를 지시하는 것으로 알려져 있습니다. 탈세포화(decellularization) 및 세포 시딩(cell seeding)의 대표적인 결과를 제공합니다.

Introduction

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조직과 장기의 생명 공학은 재생 의학 분야에 매력적인 추가 기능입니다. 병든 장기의 기능을 대체하기 위해 환자에게 이식하기에 적합한 "실험실에서 성장한" 장기를 만드는 것은 이식 요구에 대한 현재와 미래의 수요를 충족시키기 위해 매우 바람직합니다. 조직 공학의 원리는 원하는 세포 유형 또는 그 전구 세포를 파종하는 것을 중심으로 하며, 이는 발달 또는 재생 과정을 모방하는 데 필요한 적절한 성장 인자와 배양 조건을 제공하면서 공학적 조직의 모양을 지지하는 골격에 주입하는 것입니다. 합성 골격은 조직 공학에 사용되어 왔으며 자연 세포외 기질(ECM)은 이러한 목적을 위한 장기 특이적 골격의 가장 좋은 공급원일 수 있습니다. 전체 장기 탈세포화(whole-organ decellularization)는 네이티브 ECM의 화학적, 구조적 측면은 그대로 유지하면서 세포를 제거할 수 있는 과정입니다. 생성된 무세포 매트릭스 스캐폴드는 재생 세포를 파종하고 in vitro1,2를 배양할 수 있는 플랫폼으로 사용할 수 있습니다.

이 기술의 타당성을 연구하기 위해 폐 탈세포화 및 후속 재세포화에 대한 여러 설치류 모델이 개발되었습니다3-6. 설치류 모델은 필수적인 개념 증명을 제공하지만, 인간의 임상적 ....

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Protocol

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1. 전체 장기 원숭이 폐 탈세포화

  1. 용액 준비
    1. 10-15L의 탈이온수(dH2O)를 1-2L 병에 오토클레이브합니다.
    2. 자석 교반기에서 교반하면서 1ml의 트리톤 X-100을 999ml의 dH2O에 혼합하여 "트리톤 용액"(0.1% 트리톤 X-100 in dH2O)을 준비합니다. 0.22μm 필터 장치를 통해 용액을 여과합니다. 실온에서 보관하십시오.
    3. 교반하면서 ~900ml dH2O에 20g의 디옥시콜레이트(SDC)를 천천히 첨가하여 "SDC 용액"(dH2O의 2% SDC)을 준비합니다. SDC가 용해되면 용액을 눈금이 매겨진 실린더로 옮기고 dH2O를 사용하여 부피를 1ml로 가져옵니다. 0.22μm 필터 장치를 통해 용액을 여과합니다. 실온에서 보관하십시오.
    4. ~ 900ml의 dH2O에 58g의 NaCl을 첨가하여 "NaCl 용액"을 준비하고 완전히 용해 될 때까지 저어줍니다. 최종 부피 1L에 dH2O를 추가하고 여과한 다음 실온에서 보관합니다.
  2. 장기 준비

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Results

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아래 표시된 결과는 기도 또는 혈관 구획에 각각 붉은털 원숭이 골수 유래 중간엽 줄기 세포 또는 붉은털 폐 유래 미세혈관 내피 세포를 파종한 별도의 실험을 나타내며, 앞서 설명한 바와 같이 분리되고 특성화되었습니다.

탈세포화 과정 전반에 걸쳐, 원숭이 폐는 점진적인 미백을 보였고, 과정이 끝날 때 반투명하게 나타나지만, 폐는 그들의 총체적인 해부학적 특징을 유지했고, 대체로 탄력성을 유지하며, 액체로 팽창한 후 자연적인 반동을 일으킬 수 있었다(그림 3A 및 3B). 미시적 수준에서, 조직학적 초미세 구조는 탈세포화 후에도 그대로 유지되었습니다. 즉, 세기관지, 호흡기 세기관지, 폐포낭, 혈관 및 모세혈관은 여전히 저전력 현미경으로 매우 명확하게 구별할 수 있었습니다(그림 3C 및 3D). 그러나 조직학적 미세해부학은 폐의 전체적인 해부학적.......

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Discussion

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조직은 물리적, 화학적, 효소적 제제를 사용하는 여러 가지 방법에 의해 효율적이고 효과적으로 탈세포화될 수 있다12,20. 큰 장기에서 3D 생물학적 매트릭스를 생산하는 데 따른 과제에는 대량의 탈세포화 용액, 고가의 상용 장비(예: 바이오리액터), 최종 조직 유래 제품을 얻는 데 필요한 어지러운 양의 방법론적 교란이 포함됩니다. 우리의 방법은 물리적 조작, 시약 양 및 비용을 최소화하는 간단한 접근 방식을 제공합니다. 붉은털원숭이 폐의 완전한 탈세포화 및 불임에는 3일밖에 걸리지 않습니다. 또한, 당사의 탈세포화 조직은 오염이나 스캐폴드 분해 징후 없이 몇 주 동안 4°C에서 보관할 수 있습니다. 우리는 최근 탈세포화된 원숭이 폐 스캐폴드의 자세한 특성화를 보고했는데, 여기서 Triton X-100/Deoxycholic acid 방법(Price et al.4) 폐 기질에 미치는 영향을 최소화하면서 세포를 효율적으로 제거했습니다4,19.<.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 이 보고서에서 이전 출판물의 이미지를 사용할 수 있도록 허락해 준 Tissue Engineering의 편집자들에게 감사의 뜻을 전합니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
니트로 프루스 산나트륨 시그마 - 알드리치71778-25G
헤파린 나트륨 염피셔BP2425
트리톤 X-100피셔BP151-100
데옥시 콜산 나트륨피셔BP349-100
염화나트륨피셔7647-14-5
소 췌장 DNase시그마 알드리치DN25원료 준비, 분취 및 동결
황산 마그네슘Fisher10034-99-8
염화칼슘FisherC614-500
PBS (no Ca/Mg)Gibco, Life Technologies10010-031
항생제-항진균제Gibco Life Technologies15240062
세포 배양 배지
알파 MEMGibco Life Technologies12561-072
매체 199Gibco Life Technologies11150067
프리미엄 태아 소 혈청Atlanta BiologicalsS11150
L-글루타민 100xGibco Life Technologies25030-081
내피 세포 성장 보조제(ECGS)ScienCell1052
항생제-항진균제Gibco Life Technologies15240062
세포 파스팅 및 생물반응기 배양
체크 밸브Cole-ParmerEW-98553-20
Y-커넥터Cole-ParmerED-30614-08
3-Way stopcocksHarvard Apparatus721664
MasterFlex L/S 14 튜빙Cole-Parmer96420-14
MasterFlex L/S 16 튜빙Cole-Parmer96420-16
수 잠금 Luer 1/8 inCole-ParmerEW-45505-04
암 Luer 1/8 inCole-ParmerSI-45502-04
수 Luer 잠금 플러그Cole-ParmerEW-45505-56
주입 포트Medi-DoseEPS IV2004
라텍스 튜빙세인트루이스 메디컬 서피HN10910
호스 클램프콜 파머EW-06832-02
2L 입이 넓은 항아리피셔05-719-276
60ml주사기 피셔NC9035364

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. 14, 213-221 (2008).
  2. Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue....

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