뉴캐슬 질병 바이러스 (NDV)는 광범위 중에서도, 백신 및 치료를위한 새로운 벡터를 개발하기 위해 지난 몇 년 동안 연구되어왔다. 이 연구로 인해 이러한 우리가 여기에서 설명하는 것과의 cDNA에서 재조합 바이러스를 구출하는 기술로 가능했습니다.
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이 논문에서
요약
초록
뉴캐슬 질병 바이러스 (NDV), 가족 Paramyxoviridae 1의 Avulavirus 속의 프로토 타입 멤버가 아닌 분할, 음의 의미는 단일 가닥, 예방 접종에 대한 벡터 잠재적 인 응용 프로그램과 RNA 바이러스 (그림 1)을 포위하고있다 인간의 질병의 치료. 이러한 응용 프로그램의 심층 탐사는 cDNA를 2-5로 자신의 완전한 게놈을 암호화하는 플라스미드로부터 재조합 바이러스를 구출하는 역 유전학 기술의 설립 후 수있게되었다. 바이러스 cDNA를 편리 바이러스의 유전자형을 변경 및 / 또는 새로운 전사 단위를 포함하는 표준 클로닝 절차를 사용하여 시험 관내에서 수정 될 수있다. 이러한 유 전적으로 변형 된 바이러스의 구조는 인자 감염의 여러 단계에 영향을 미치는뿐만 아니라 항원의 발현 및 전달을위한 벡터의 개발 및 개선을 허용을 이해하기 위해 유용한 도구를 제공한다예방 접종 및 치료를위한. 여기에서 우리는 재조합 NDVs의 구조에 대한 프로토콜을 설명합니다.
서론
뉴캐슬 질병 바이러스 (NDV)는 Avulavirus 속 1에 속하는 조류 paramyxovirus은 심각하게 전 세계의 가금류에 영향을 미칠 수있는 경제 관련 때문에 널리 연구되고 감시를 받고 인수 공통 에이전트입니다. 아니 인간의 병원체이지만, NDV는 철저 모델 paramyxovirus로 인해 고도의 흥미, 자연, 온 콜리 틱 속성 6 모두 수의사 필드 이상으로 연구되고있다. NDV에 대한 연구는 크게 첫 번째 Conzelmann 및 coleagues 2로 광견병 바이러스에 대한 설명 단일 가닥이 아닌 분할 된 음의 센스 RNA 바이러스에 대한 역 유전학 기술의 개발 혜택. 외국 유전자 또는 야생형 유전자의 변형을 운반 유전자 변형 NDVs의 다양한 널리 그 이후로 연구되고있다. 이러한 재조합 바이러스로 작업은 NDV의뿐만 아니라 관련 구호 물자의뿐만 아니라 다른 독성 요소를 특성화하는 것이 중요했습니다N 인플루엔자 바이러스와 같은 병원체 7 - 나 응급 니파 바이러스 8. 또한, 서로 다른 다수의 연구는 주로 바이러스의 면역 자극 특성을 향상시킴으로써, NDV 6,9,10의 타고난 항 종양 활성을 개선하기 위해 이러한 기술을 사용하는 방법을 살펴 보았....
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프로토콜
1. 포유 동물 세포의 준비 (그림 4A, 1 일)
분할 HEP-2 또는 A549 세포를 6 - 웰 플레이트에 형질 전날. 세포의 밀도는 다음 날 80-90% 합류에 도달해야합니다. 일반적으로 합류 100mm 요리 8 우물에 (물론 당 6 ~ 10 x 1 주위 세포)를 분할 할 수 있습니다. 각각의 바이러스가 구출 될 때까지, 2-4 다른 우물이 포함되어야한다,뿐만 아니라 각각 형질 전환 및 MVA-T7 감염의 효율성을 모니터링하기위한 제어는 pCAGGS-GFP 및 pCITE-GFP 18 2 여분의 우물,,.
2. 박테리오파지 T7 RNA 중합 효소 (MVA-T7)를 발현하는 재조합 수정 된 우두 앙카라 바이러스와 포유 동물 세포의 감염 (그림 4A, 2 일)
- 37 ° C에서 PBS 1x/BA/PS와 미디어를 따뜻하게
- PBS 1x/BA/PS 1 ㎖로 두 번 세포를 씻으십시오.
- 감염의 다중성 (AT MVA-T7 바이러스로 배양 된 포유 동물 세포를 감염 모이1) 실온에서 1 시간 동안 PBS / BA / PS 200 μL의 최종 볼륨 PFU / 셀.
- 3....
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결과
NDV의 구조는 정기적으로 바이러스의 전체 cDNA를 액세스 할 수있는 실험실에서 수행 잘 설립 절차입니다. 그러나, 본 방법의 본질적인 스토캐스틱 자연 어려운 100 % 복구 효율을 달성 할 수있다. 프로세스의 초기 단계, MVA-T7과 특수 형질 전환 효율과 감염을 모니터링 가능한 문제. 그림 5A 표준 형질 성공적인 NDV 구조에 대한 충분한 형질 전환 / 감염의 효율을 보여줍니다를 식별하는 데 도움이됩니다. 조류 - 포유류의 공동 문화와 유정란 증폭 라운드 후, 구조 바이러스의 존재는 HA 분석에서 긍정적 인 우물에 의해 검출된다. NDV는 적혈구를 연결하여 혈구 응집을 유도하고, 따라서 잘 V 자형의 하부에 그 침강을 방지한다. 따라서 HA 활성의 결여는 쉽게 RBC의 빨강, 둥근 펠릿 (도 5b)의 형성에 의해 구별 될 수있다. 부정적인 결과HA 분석에 의한 막액에있는 바이러스의 부족 역가에 할 수있다 : 약 10 6 PFU / ㎖의 최.......
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토론
몇몇 요인 NDV 구출하면서 좋은 결과를 달성하기 위해 고려되어야한다. 첫째, 사용되는 전장 cDNA 구조체는 NDV 게놈에 트랜스 진 새로운 / 수정 기능 내장 할 수 있도록 설계 될 필요가있다. (II)에는 추정 GE 또는 GS 시퀀스가 외국에없는, 위에서 언급 한 바와 같이이 (I) 해당 유전자의 끝 (GE), intergenic (IG) 유전자의 시작 (GS) 시퀀스가 필요한 경우 추가 할 수 있다는 것을, 의미 유전자, 그리고 (iii) 전체 재조합 게놈은 "6의 규정"을 다음과 같습니다.
구조 과정으로, 플라스미드 준비의 품질, MVA-T7 주식뿐만 아니라 세포의 적절한 유지 관리가 중요합니다. 도입 유전자의 크기 또는 특성상 어렵다 복제 및 복구 프로세스, CSCL 밀도 구배 원심 분리를 통해 DNA를 정제함으로써 개선 될 수 있지만, 대부분의 경우를 들어, 플라스미드 DNA의 표준 maxiprep 정화는 충분하다. 리를 사용하여 형질 전.......
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공개 사항
아돌 포 가르시아 - 사스 트레는 시나이 산에서 의학의 아이칸 학교가 소유하고 재조합 뉴캐슬 질병 바이러스에 대한 특허의 발명가이다.
감사의 글
저자는 박사 부부의 실험실에서 과거와 현재 회원에게 감사의 말씀을 전합니다. 피터 Palese의와 NDV의 개발을위한 아돌 포 가르시아 - 사스 트레는 유전학 기술과 기술 지원을 역방향. NIAD이 R01AI088770를 부여하고 우수의 국토 안보부 과학 기술 센터의 부서에 의해 의해 AG-S 실험실에서 뉴캐슬 질병 바이러스의 연구는 부분적으로 재정 지원 신흥 및 동물 매개 동물의 질병 (CEEZAD, 보너스 번호 2010-ST-061-AG001). LM-S 실험실에서 연구는 NIH 보조금 RO1 AI077719, R21NS075611-01, R03AI099681-01A1, 인플루엔자 연구 및 감시 (HHSN266200700008C)에 대한 우수의 NIAID 센터, Biodefense에 면역 모델링을위한 로체스터 센터의 대학 (HHSN272201000055C)에 의해 자금 지원 .
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| DMEM | CORNING Cellgro | 10-013-CV | 모든 공급업체 |
| OptiMEM | GIBCO | 31985-070 | |
| Lipofectamine 2000 (LPF2000) | Invitrogen | 11668-019 | |
| 35% 소 알부민(BA) | Sigma | 232-936-2 | 모든 공급업체 |
| Trypsin-EDTA | CORNING Cellgro | 25-052-CI | 모든 공급업체 |
| 페니실린/스트렙토마이신(PS) 100x | CORNING Cellgro | 30-002-CI | 모든 공급업체 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30070.03 | 모든 공급업체 |
| Cell lines |
참고문헌
- Lamb, R. A., Parks, G. D. Fields Virology. Howley, P. H., Knipe, D. M. , Lippincott Williams & Wilkins. 1647-1689 (2007).
- Schnell, M. J., Mebatsion, T., Conzelmann, K. K. Infectious rabies viruses from cloned cDNA. EMBO J. 13, 4195-4203 (1994).
- Peeters, B. P., de Leeuw, O. S., Koch, G., Gielkens, A. L.
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재인쇄 및 허가
