Method Article

휴대 통신 분석을위한 단일 세포 미세 주입

DOI:

10.3791/50836

⸱

February 26th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Institute Oswaldo Cruz, Laboratory of Cellular Communication, Oswaldo Cruz Foundation

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 살아있는 세포에서 갭 접합을 통해 셀룰러 통신을 시각화 루시퍼 노란색의 단일 세포 미세 주입을 수행하고 몇 가지 유용한 팁을 제공하는 방법을 여기에 대해 설명합니다. 우리는이 논문으로 인해 기능 갭 접합에 세포 결합의 정도를 평가하기 위해 모두 도움이 될 것으로 기대하고있다. 여기에 설명 된 모든 1,000 달톤 이하의 분자량을 가진 다른 형광 염료에 적응 원칙적으로 될 수있다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

간연접은 이웃 세포의 통신을 허용하는 세포 간 채널입니다. 이 통신은 갭 접합을 형성하기 위해 각 인접 세포에 의한 반채널의 기여에 따라 달라집니다. 포유류 세포에서 반채널은 6개의 커넥신(connexin), 4개의 막관통 도메인이 있는 단량체, 세포질 내의 C 및 N 말단에 의해 형성됩니다. 간극연접(gap junctions)은 이온, 2차 전달자(second messenger) 및 작은 대사 산물의 교환을 허용합니다. 또한 시냅스 전달, 심장 수축, 세포 성장 및 분화와 같은 생리학적 과정 내에서 다양한 형태의 세포 통신에서 중요한 역할을 합니다. Lucifer Yellow의 단일 세포 미세 주입을 수행하여 살아있는 세포의 간극 연접을 통한 세포 통신을 시각화하는 방법을 자세히 설명합니다. 기능적 갭 접합에서 염료는 적재된 셀에서 연결된 셀로 확산될 것으로 예상됩니다. 형광의 확산을 실시간으로 평가할 수 있기 때문에 간극연접을 연구하는 데 매우 유용한 기술입니다. 세포와 마이크로피펫을 준비하는 방법, 마이크로매니퓰레이터를 사용하는 방법, 상피 세포주에 저분자량 형광 염료를 주입하는 방법에 대해 논의합니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

갭 접합은 인접 셀 1 사이에서 상호 통신을 허용 간 채널입니다. 이 통신은 각각의 채널 간을 형성 connexon 또는 hemichannel에 기여 둘 이상의 이웃 셀을 연결한다. 포유 동물 세포에서, connexon는 세포질 내에서이 네 개의 경막 도메인 및 C 및 N 단자 여섯 코넥 단량체에 의해 형성된다. 간극 연접 만 이온 초 메신저 작은 대사의 흐름을 허용하지만, 또한 시냅스 전달, 심장 수축, 세포 성장과 분화 3, 4, 5, 6 등의 많은 생리적 과정에 셀룰러 통신의 여러 형태에 기여하지 7,8. 또한 갭 접합이와 관련이있다암 9, 10, 11 근위축증 일부 유전 질환 및 질병 12 탈수 초성 질환을 포함하는 많은.

간 크로스 토크의이 유형은 여러 가지 방법으로 13, 14, 15, 16에 의해 평가 될 수있다. 본 논문에서는, 우리는 살아있는 세포에서 갭 접합을 통해 셀룰러 통신을 시각화 루시퍼 노란색의 단일 세포 미세 주입을 수행하는 방법을 보여줍니다. 우리는 셀과 마이크로 피펫의 미세 조작기의 사용과 흉선 상피 세포 라인에 루시퍼 노란색 염료의 주입을 준비하는 방법에 대해 설명합니다. 일반적으로이 실험 절차는 염료와 함께로드 셀에 연결 셀의 평균에 의해 분석 될 수있다. 또한,이 방법은 갭 아래 분자량을 갖는 다른 형광 염료로 사용될 수있다약 1,000 달톤 인 접합 차단.

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Protocol

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세포의 1. 준비

  1. 흉선 상피 세포 라인 (IT76M1) 또는 셀의 문화를 유지하는 것은 인큐베이터에서 테스트하기 (37 ° C / 5 % CO 2).
  2. PBS 1X와 세포를 씻으 (이 항목에 배를 반복).
  3. 5 분 동안 세포에 트립신을 추가합니다.
  4. 트립신 원심 분리 (5 분, 800 XG)와 함께 세포를 10 % FBS (소 태아 혈청)와 (항목 1.3 첨가 트립신 볼륨 회) 배지를 추가한다.
  5. 혈구의 세포를 계산합니다.
  6. 세포를 결합 할 수 있도록 서로 밀착 될 필요가 같은 세포 유형에 따른 세포의 농도를 조정. 주 : 우리의 경우는 35mm 배양 접시 당 3 × 105 세포를 사용 하였다.

2. 마이크로 피펫 준비

  1. 직경의 최종 0.2 μm의 유리 모세관 마이크로 피펫 (1.5 mm 직경)로 지정된 약 30 MΩ의 최종 저항을 달성하도록 마이크로 피펫을 당겨F "> 17, 18.
    참고 : 또는 주입 피펫을 구입할 수 있습니다. 저항이 셀 크기에 따라, 예를 들어 높은 저항 미세 예 (100-150 MΩ) 19, 췌장 선포 세포에 필요한 것이다. 발생할 수있는 일반적인 문제는 다음 마이크로 피펫을 방해 할 수 있습니다 전에 여과 또는 원심 분리를 요구할 수있다 루시퍼 노란색 용액의 침전이다. 주입 전에, 마이크로 피펫을 방해 또는 중단 (13)의 임의의 유형이 있는지 감지하는 현미경으로 분석한다. 마이크로 피펫을 식염수 내부 마이크로 피펫 팁 LY 주입함으로써 시험 될 수있다.

3. 테스트하기 마이크로 피펫

  1. 150 밀리몰 / L LiCl을에서 루시퍼 노란색 용액 (5 %)을 준비하고 주사기를 사용하여 마이크로 피펫을로드하거나 메우기에 의해 (그것을 LY 솔루션에 넣어).
  2. 마이크로 파이프를 배치마이크로 인젝션 워크 스테이션 IT76M1 세포와 35mm 페트리 접시 위에 TTE 셀 매체에 유리 마이크로 피펫의 팁 잠수함. 마이크로 피펫에 초점 펄스를 적용하여 염료 흐르는 테스트를 수행합니다.

4. 단일 셀 루시퍼 노란색 미세 주입

  1. 천천히 미세 조작기를 이용하여 세포에 피펫을 낮추고, 오른쪽 높은 그니 인터넷 양이온 (40X)을 사용하여 전지 층 위에 초점 현미경.
  2. 선단이 세포막을 터치하기에 충분히 근접 할 때 표적 세포 천공 및 세포 내로 LY 소개 작은 hyperpolarizing 펄스를 적용한다. 염료의 순 비용에 따라 달라집니다인가 전압을 주입한다. 표 1에 나타낸 바와 같이 다르게는, 다른 염료는 이러한 기술과 함께 사용될 수있다.
    참고 : 원칙적으로 MW있는 모든 친수성 염료 이하 1KDa을 사용할 수있는 것보다. 그러나, 전송 속도는 무게와 친수성에 따라 달라질 수있다. 또한, 유를사용되는 염료의 nspecific 전송이 평가되어야한다.
  3. 셀 이미지를 염료 주입 후 3 분을 캡처 또는 시간 경과 현미경 (초당 30 프레임)으로 작은 영화를 만들.
    참고 : 유사한 접근 방식 (2015) 20 히토미 등으로 볼 수있다. 그림 2와 같이 간 교량에 의한 통신 (불완전 유사 분열), 갭 접합을 통과하지만 권장 간 교량 및 nanotubules의 특정 유형을 통과하지 않습니다 rhodamin 덱스 트란 (2에서 10 KDa의에)의 공동 주입을 방지하려면 .

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 세포는 (43) (21) 넥신에 의해 형성 기능 갭 접합을 표현 설명했다으로 흉선 상피 세포주 IT-76MI는 갭 접합에 의해 염료 커플 링을 평가하는 데 사용되었다. 피펫의 팁 아래 하나의 셀에 적용 할 때 그림 1은 루시퍼 노란색의 주입을 보여줍니다. 몇 분 후, 연결된 셀 갭 정션을 통한 형광 염료의 확산을 나타내는 형광체 (별표)가된다. 세포 및 시간 형광되었다 할 수는 직접 이들 세포 간의 셀룰러 통신의 정도와 관련된다. 도 2는 흉선 상피 세포 LY의 주입 및 삽입 (삽입 d)는 LY 로다 민 및 덱스 트란 (10KDa)의 공동 - 주입을 보여 나타낸다. 예상대로 로다 민 덱스 트란 안 때문에 고 분자량의 수행 있지만 LY는, 인접 셀에 전달합니다. 또한, GJ 차단제의 존재 (삽입 F), 옥탄 올, BLO주변 셀들에 대한 염료의 통로 cked. 대안 적으로, 하나의 특정 셀 또는 ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

간 채널에 의해 투과성 16 요구되지만, 기능적 간 간극 결합의 존재, 불 투과성 멤브레인 추적자의 사용을 확인하기 위해. 형광, 제 형광 염료는 세포 간 결합 (22), 비 접합부 (3) 사이의 막 투과성이므로 루시퍼 옐로우 염료 (15)에 의해 치환 된 관찰. 현재, 형광 추적자의 많은 다른 유형 중에서 최선의 선택 범위와 실험의 조건에 따라 달라집니다 찾을 수 있습니다. 형광 염료 셀 로딩의 과정 형태의 평가, 단셀의 기능과 셀 간의 이동의 운동 속도를 허용한다. 또한, 염료는 마이크로 인젝션 C 정도되므로, 셀 (21), (23) 사이의 갭 정션의 생리적 역할에 대한 이해를 허용ellular 통신 연결된 셀의 개수와 관련이있다.

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자에게는 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 브라질에서 간극연접에 의한 세포간 통신에 대한 연구를 소개한 Gilberto Oliveira-Castro 교수를 기리기 위해 이 논문을 헌정합니다. 이 작업은 Capes, CNPQ 및 Faperj의 자금 지원을 받았습니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Lucifer yellowSigmaL0259
리튬 클로라이드SigmaL4408
PBS 정제Sigma P4417
RPMISigmaR4130
소 태아 혈청Cultilab
TrypsinSigmaT4799
진동 절연 테이블 NewportVH3036W-OPT진동으로부터 실험을 보호하고 세포 손상을 방지하기 위해 진동 절연 테이블이 필요합니다
MicromanipulatorNarishigeMMO-203이 장비는 세포 마이크로 주입에 필요한 마이크로 피펫의 정밀 조정을 가능하게 합니다.
전류 발생기 디지타이머DS2마이크로피펫을 통한 염료 흐름을 생성하기 위해 마이크로피펫 내부에 전극이 있는 전류 발생기 또는 커패시턴스 보상 회로(구형 전위계) 또는 새로운 패치 클램프 증폭기의 전류 주입 기능이 있는 증폭기 및 플레이트 접시에 잠긴 접지선을 사용하여 1나노 암페어 미만의 전류를 공급했습니다. 또는 공장 권장 사항에 따라 공압 마이크로 인젝터로 염료를 주입할 수 있습니다.     

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bennett, M. V., et al. Gap junctions: new tools, new answers, new questions. Neuron. 6 (3), 305-320 (1991).
  2. Orellana, J. A., Martinez, A. D., Retamal, M. A. Gap junction channels and hemichannels in the CNS: Regulation by signaling molecules. Neuropharmacology. , (2013).
  3. Peracchia, C. Structural correlates of gap junction permeation. Int Rev Cytol. 66, 81-146 (1980).
  4. Loewenstein, W. R. Junctional intercellular communication and the control of growth. Biochim Biophys Acta. 560 (1), 1-65 (1979).
  5. Alves, L. A., et al. Functional gap junctions in thymic epithelial cells are formed by connexin 43. Eur.J Immunol. 25 (2), 431-437 (1995).
  6. Alves, L. A., et al. Are there functional gap junctions or junctional hemichannels in macrophages? Blood. 88 (1), 328-334 (1996).
  7. Fonseca, P. C., et al. Characterization of connexin 30.3 and 43 in thymocytes. Immunology letters. 94 (1-2), 65-75 (2004).
  8. Nihei, O. K., et al. Modulatory effects of cAMP and PKC activation on gap junctional intercellular communication among thymic epithelial cells. BMC Cell Biol. 11, 3(2010).
  9. Czyz, J., Szpak, K., Madeja, Z. The role of connexins in prostate cancer promotion and progression. Nat Rev Urol. 9 (5), 274-282 (2012).
  10. El-Saghir, J. A., El-Habre, E. T., El-Sabban, M. E., Talhouk, R. S. Connexins: a junctional crossroad to breast cancer. Int J Dev Biol. 55 (7-9), 773-780 (2011).
  11. Cea, L. A., et al. Connexin- and pannexin-based channels in normal skeletal muscles and their possible role in muscle atrophy. J Membr Biol. 245 (8), 423-436 (2012).
  12. Cotrina, M. L., Nedergaard, M. Brain connexins in demyelinating diseases: therapeutic potential of glial targets. Brain Res. 1487, 61-68 (2012).
  13. Park, H. an-A., R, S., Khanna, S. avita, Sen, C. handan K. Current Technologies in Single-Cell Microinjection and Application to Study Signal Transduction. Methods in Redox Signaling. , Chapter 10 (2010).
  14. Abbaci, M., Barberi-Heyob, M., Blondel, W., Guillemin, F., Didelon, J. Advantages and limitations of commonly used methods to assay the molecular permeability of gap junctional intercellular communication. Biotechniques. 45 (1), 33-52 (2008).
  15. Stewart, W. W. Functional connections between cells as revealed by dye-coupling with a highly fluorescent naphthalimide tracer. Cell. 14 (3), 741-759 (1978).
  16. Meda, P. Probing the function of connexin channels in primary tissues. Methods. 20 (2), 232-244 (2000).
  17. Klaunig, J. E., Shi, Y. Assessment of gap junctional intercellular communication. Curr Protoc Toxicol. , Chapter 2 Unit2 17 (2009).
  18. Hanani, M. Lucifer yellow - an angel rather than the devil. J Cell Mol Med. 16 (1), 22-31 (2012).
  19. Orci, L., Biochemistry, C. Blockage of Cell-to-Cell Communication within Pancreatic Acini Is Associated with Increased Basal Release of Amylase Materials and Methods Preparation of Acini. Cell. 103 (August), 475-483 (1986).
  20. Hitomi, M., et al. Differential connexin function enhances self-renewal in glioblastoma. Cell Rep. 11 (7), 1031-1042 (2015).
  21. Nihei, O. K., Campos de Carvalho,, C, A., Spray, D. C., Savino, W., Alves, L. A. A novel form of cellular communication among thymic epithelial cells: intercellular calcium wave propagation. Am J Physiol Cell Physiol. 285 (5), C1304-C1313 (2003).
  22. Kanno, Y., Loewenstein, W. R. Intercellular Diffusion. Science. 143 (3609), 959-960 (1964).
  23. Alves, L. A., Nihei, O. K., Fonseca, P. C., Carvalho, A. C., Savino, W. Gap junction modulation by extracellular signaling molecules: the thymus model. Braz J Med Biol Res. 33 (4), 457-465 (2000).

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