휴대 통신 분석을위한 단일 세포 미세 주입

Summary

우리는 살아있는 세포에서 갭 접합을 통해 셀룰러 통신을 시각화 루시퍼 노란색의 단일 세포 미세 주입을 수행하고 몇 가지 유용한 팁을 제공하는 방법을 여기에 대해 설명합니다. 우리는이 논문으로 인해 기능 갭 접합에 세포 결합의 정도를 평가하기 위해 모두 도움이 될 것으로 기대하고있다. 여기에 설명 된 모든 1,000 달톤 이하의 분자량을 가진 다른 형광 염료에 적응 원칙적으로 될 수있다.

Abstract

간연접은 이웃 세포의 통신을 허용하는 세포 간 채널입니다. 이 통신은 갭 접합을 형성하기 위해 각 인접 세포에 의한 반채널의 기여에 따라 달라집니다. 포유류 세포에서 반채널은 6개의 커넥신(connexin), 4개의 막관통 도메인이 있는 단량체, 세포질 내의 C 및 N 말단에 의해 형성됩니다. 간극연접(gap junctions)은 이온, 2차 전달자(second messenger) 및 작은 대사 산물의 교환을 허용합니다. 또한 시냅스 전달, 심장 수축, 세포 성장 및 분화와 같은 생리학적 과정 내에서 다양한 형태의 세포 통신에서 중요한 역할을 합니다. Lucifer Yellow의 단일 세포 미세 주입을 수행하여 살아있는 세포의 간극 연접을 통한 세포 통신을 시각화하는 방법을 자세히 설명합니다. 기능적 갭 접합에서 염료는 적재된 셀에서 연결된 셀로 확산될 것으로 예상됩니다. 형광의 확산을 실시간으로 평가할 수 있기 때문에 간극연접을 연구하는 데 매우 유용한 기술입니다. 세포와 마이크로피펫을 준비하는 방법, 마이크로매니퓰레이터를 사용하는 방법, 상피 세포주에 저분자량 형광 염료를 주입하는 방법에 대해 논의합니다.

Introduction

갭 접합은 인접 셀 ¹ 사이에서 상호 통신을 허용 간 채널입니다. 이 통신은 각각의 채널 간을 형성 connexon 또는 hemichannel에 기여 둘 이상의 이웃 셀을 연결한다. 포유 동물 세포에서, connexon는 세포질 ^내에서이 네 개의 경막 도메인 및 C 및 N 단자 여섯 코넥 단량체에 의해 형성된다. 간극 연접 ^만 이온 초 메신저 작은 대사의 흐름을 허용하지만, 또한 시냅스 전달, 심장 수축, 세포 성장과 분화 ^{3, 4, 5, 6} 등의 많은 생리적 과정에 셀룰러 통신의 여러 형태에 기여하지 ^7,8. 또한 갭 접합이와 관련이있다암 ^{9, 10, 11} 근위축증 일부 유전 질환 및 질병

Protocol

세포의 1. 준비

1. 흉선 상피 세포 라인 (IT76M1) 또는 셀의 문화를 유지하는 것은 인큐베이터에서 테스트하기 (37 ° C / 5 % CO _2).
2. PBS 1X와 세포를 씻으 (이 항목에 배를 반복).
3. 5 분 동안 세포에 트립신을 추가합니다.
4. 트립신 원심 분리 (5 분, 800 XG)와 함께 세포를 10 % FBS (소 태아 혈청)와 (항목 1.3 첨가 트립신 볼륨 회) 배지를 추가한다.
5. 혈구의 세포를 계산합니다.
6. 세포를 결합 할 수 있도록 서로 밀착 될 필요가 같은 세포 유형에 따른 세포의 농도를 조정. 주 : 우리의 경우는 35mm 배양 접시 당 3 × ¹⁰⁵ 세포를 사용 하였다.

2. 마이크로 피펫 준비

1. 직경의 최종 0.2 μm의 유리 모세관 마이크로 피펫 (1.5 mm 직경)로 지정된 약 30 MΩ의 최종 저항을 달성하도록 마이크로 피펫을 당겨F "> ^{17, 18.}
   참고 : 또는 주입 피펫을 구입할 수 있습니다. 저항이 셀 크기에 따라, 예를 들어 높은 저항 미세 예 (....

Results

이 세포는 (43) ⁽²¹⁾ 넥신에 의해 형성 기능 갭 접합을 표현 설명했다으로 흉선 상피 세포주 IT-76MI는 갭 접합에 의해 염료 커플 링을 평가하는 데 사용되었다. 피펫의 팁 아래 하나의 셀에 적용 할 때 그림 1은 루시퍼 노란색의 주입을 보여줍니다. 몇 분 후, 연결된 셀 갭 정션을 통한 형광 염료의 확산을 나타내는 형광체 (별표)가된다. 세포 및 시간 형광되었다 할 수는 직접 이들 세포 간의 셀룰러 통신의 정도와 관련된다. 도 2는 흉선 상피 세포 LY의 주입 및 삽입 (삽입 d)는 LY 로다 민 및 덱스 트란 (10KDa)의 공동 - 주입을 보여 나타낸다. 예상대로 로다 민 덱스 트란 안 때문에 고 분자량의 수행 있지만 LY는, 인접 셀에 전달합니다. 또한, GJ 차단제의 존재 (삽입 F), 옥탄 올, BLO주변 셀들에 대한 염료의 통로 cked. 대안 적으로, 하나의 특정 셀 또는 .......

Discussion

간 채널에 의해 투과성 ¹⁶ 요구되지만, 기능적 간 간극 결합의 존재, 불 투과성 멤브레인 추적자의 사용을 확인하기 위해. 형광, 제 형광 염료는 세포 간 결합 ^(22), 비 접합부 ^{(3) 사이의} 막 투과성이므로 루시퍼 옐로우 염료 ^(15)에 의해 치환 된 관찰. 현재, 형광 추적자의 많은 다른 유형 중에서 최선의 선택 범위와 실험의 조건에 따라 달라집니다 찾을 수 있습니다. 형광 염료 셀 로딩의 과정 형태의 평가, 단셀의 기능과 셀 간의 이동의 운동 속도를 허용한다. 또한, 염료는 마이크로 인젝션 C 정도되므로, 셀 ^{(21), (23)} 사이의 갭 정션의 생리적 역할에 대한 이해를 허용ellular 통신 연결된 셀의 개수와 관련이있다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lucifer yellow	Sigma	L0259
리튬 클로라이드	Sigma	L4408
PBS 정제	Sigma	P4417
RPMI	Sigma	R4130
소 태아 혈청	Cultilab
Trypsin	Sigma	T4799
진동 절연 테이블	Newport	VH3036W-OPT	진동으로부터 실험을 보호하고 세포 손상을 방지하기 위해 진동 절연 테이블이 필요합니다
Micromanipulator	Narishige	MMO-203	이 장비는 세포 마이크로 주입에 필요한 마이크로 피펫의 정밀 조정을 가능하게 합니다.
전류 발생기	디지타이머	DS2	마이크로피펫을 통한 염료 흐름을 생성하기 위해 마이크로피펫 내부에 전극이 있는 전류 발생기 또는 커패시턴스 보상 회로(구형 전위계) 또는 새로운 패치 클램프 증폭기의 전류 주입 기능이 있는 증폭기 및 플레이트 접시에 잠긴 접지선을 사용하여 1나노 암페어 미만의 전류를 공급했습니다. 또는 공장 권장 사항에 따라 공압 마이크로 인젝터로 염료를 주입할 수 있습니다.