성게 접합자의 높은 처리량 Microinjections

요약

미세 주입 계란, 배아, 다양한 종류의 세포로 DNA의 구조, mRNA를, 모르 폴리 노의 안티센스 올리고 뉴클레오티드 또는 다른 치료를 제공하는 데 사용되는 일반적인 기술입니다.

초록

세포 및 배아로 마이크로 인젝션은 생물학적 과정의 광범위한 연구하는 데 사용되는 일반적인 기술이다. 이 방법에서는 처리 액의 소량의 개별 물리적 고정화 세포 또는 배아를 주입하는 데 사용되는 마이크로 인젝션 니들에로드된다. 높은 처리량 전달을 위해이 절차를 수행하려면 초기 교육의 필요성에도 불구하고, 미세 주입은 최대의 효율성과 세포, 계란 또는 태아에 (샘플의 복잡한 혼합물을 포함한다) 치료 솔루션의 다양한 재현 배달을 제공합니다. microinjections에 응용 프로그램은 DNA의 구조, mRNA를, 재조합 단백질, 기능의 증가, 기능 시약의 손실 전달 있습니다. 형광 또는 비색 염료 인스턴트 효율적인 전달 시각화뿐만 아니라 전달되는 용액의 양의 신뢰성 정상화하기위한 도구를 사용하는 주입 용액에 첨가된다. 한 방법은 100 ~ 400 성게 Z의 미세 주입을 가능하게10 ~ 15 분 이내 ygotes.

서론

효율적이고 재생 가능한 치료 배달 연구원의 주요 방법론적인 문제 중 하나입니다. 여러 가지 방법이 일시적으로 계란, 배아 세포로 치료 솔루션을 제공하기 위해 설립되었습니다. 이러한 방법은 ^{1, 2,} 리포 펙 (막 치료 함유 리포좀의 융합을 통해 배달) ^1, 미세 충격 ¹ (DNA가 마이크론에 침전 (짧은 전기 펄스를 사용하여 막에서 생성 과도 모공 기준) 일렉트로 포함 크기의 금속 후 고속으로 세포에 침투하는 데 사용되는 입자) 및 전달 (바이러스가 도입 유전자의 전달 수단으로 사용된다.) 이때, 마이크로 인젝션 시약은 최소한 100 %의 효율로 임의의 솔루션을 제공하는 장점을 보유하는 유일한 방법이다. 또한, 단일 주입 용액 처리의 복잡한 칵테일로 구성 될 수있다. 이 방법은 성공적으로 사용되어왔다LY는 성게 ^3,4, 얼룩말 물고기 ^5, 마우스, ^{6, 7,} 개구리, 소 ^8뿐만 아니라 조직 배양 ⁹ 단일 세포와 같은 많은 종에서 계란과 배아를 microinject. 나중에 발달 단계에서 단일 할구 주사는 ^10-12를 실시하고 있습니다.

microinjections의....

프로토콜

1. 프로타민 황산염의 제조 (PS) 요리를 코팅

1. 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 탈 이온수, 증류수 (DDH ₂ O) 50 ㎖에 PS 0.5 g을 첨가하여 프로타민 설페이트 (PS)의 1 % 용액을 제조 하였다. PS의 완전한 해체를 확인하기 위해 1 ~ 2 시간 동안 실온에서 벤치 통에 빠른 속도로 잘 흔들어. 이 솔루션은 (완전히 각 사용하기 전에 젤 같은 침전물을 분해해야합니다) ³ 최소한 3 개월 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
2. 60mm X 15mm의 폴리스티렌 페트리 접시의 소매를 가지고 벤치에 모두 뚜껑과 바닥을 배치.
3. 최소 2 분 동안두고, 표면을 커버하기에 충분한 각 접시에 1 %의 PS 솔루션을 (모두 바닥과 뚜껑을 사용할 수 있습니다) 붓는다. 4 ℃에서 저장 될 때 나머지의 PS 솔루션을 3 개월 이내에 여러 번 재사용 할 수 있습니다
4. 장소 증류수 DH ₍₂ O)로 가득 비커에 요리를 PS 처리. 에 dH보다 ₂ O를 실행에서 비커를 남겨 이상10 분.
5. PS-코팅 된 요리는 저장을 위해 즉시 또는 건조한 공기 사용할 수 있습니다. 먼지 축적을 방지하기 위해 그들을 커버. 그들은 1 달 ³

결과

GFP 및 mCherry 기자의 구조는 전사 새로 수정란에 미세 주입 체외에 있었다. 배아는 (blastula 단계까지) 24 시간 동안 15 ° C에서 배양 및 혈구 관찰자 Z1 현미경을 사용하여 몇 군데 있었다. 기자 구조의 주입은 발달 결함으로 (그림 6)를지도하지 않았다. 형광 신호의 정량화를 들어, 이미지 수집은 최대한 형광 픽셀 (그림 6D-F)를 캡처하는 낮은 배율 (100X)에서 수행 하였다. 형광 신호는 AxioVision의 4.8.2.0을 사용하여 정량 하였다. 100-200 blastulae의 모집단 내의 형광 신호의 강도에 대한 표준 오차 (데이터 미도시) 1.5 %를 초과하지 않았다.

토론

미세 주입은 DNA, mRNA의, 재조합 단백질, 기능의 손실, 계란, 배아, 다양한 생물 ^1-7의 세포로 기능 시약, 염료 및 그 조합의 이득 등의 다양한 트리트먼트를 제공하는 강력한 기술이다. 미세 주입 실험을 설계 할 경우에는 몇 가지 고려 사항을 염두에 보관해야합니다.

그것은 전달 처리 및 주입량의 용해성을 고려하는 것이 중요하다. 미세 주입 용액은 심지어 약간 침전물을 형성하는 경향이있는 경우, 마이크로 인젝션 용 바늘이 막히는 것. 일반적으로는 어떤 침전물 솔루션 ^3에서 제거되었는지 확인하기 위해 바늘에로드하기 전에 이상 15 분의 솔루션을 원심 분리하는 것이 좋습니다. 다른 방법은 밀리 포아 스핀 컬럼을 통해 솔루션을 전달하는 것입니다. 이 막힘을 회피 할 수없는 경우라면 다시 팁을 깨는 완만 의해 바늘 뚫어진 가능할 수도그러나 첨단이 너무 넓 으면 용액의 흐름을 제어하기 어렵게되어 있습니다. 주입 된 용액의 많은 양의 태아.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
유리 파스퇴르 피펫	VWR	14673-043
도립 현미경  공리(酒州) 40 ° C	Zeiss	4109431007990000	주입 현미경
마이크로로더 팁	Eppendorf	5242 956.003	하중 주입 솔루션
나일론 필터 메시 80  &뮤; m	Amazon.com	03-80-37	파편을 제거하기위한 필터 달걀
P20 또는 P200 에어로졸 장벽 피펫 팁	Fisher Scientific	02707432 또는 02707430	구강 피펫의 일부
Parafilm Fisher	Scientific	13 374 12	구강 피펫의 일부
폴리에틸렌 튜브	Intramedic	PE-160	구강 피펫의 일부
프로타민 설페이트	MP Biomedicals, LLC	194729	주사 접시에 젤리 제거 알을 부착
성게 S. purpuratus	Pt. Loma Marine Invertebrate Lab	N/A
바다 물	모든 애완 동물 가게	인스턴트 오션
멸균 60mm x 15mm 폴리스티렌 페트리 접시	Fisher Scientific	0875713A	주입 접시
3축 거친 포지셔닝 미세 조작기 MMN-1	Narishige	9124	주입 바늘 조작
3축 조이스틱 유형 오일 유압 미세 미세 조작기 MMO-202ND	Narishige	9212	주입 바늘
조작 이송 피	펫 Fisher Scientific	오전 13시 711분 9시
수직  바늘 끌어당기는 사람	나리시게	PC-10	풀 주사 바늘

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