Stentor coeruleus에서 단세포 상처 치유 중 세포질 흐름 시각화

요약

거대 섬모충인 Stentor coeruleus는 단일 세포의 재생과 상처 치유를 연구하는 고전적인 시스템입니다. 저배율과 고배율에서 Stentor 세포를 동시에 이미징함으로써 상처 전, 상처 중, 상처 후의 세포질 흐름을 측정할 수 있습니다.

초록

상처 치유는 종종 전체 조직 수준에서 다루어지지만, 많은 경우 개별 세포는 세포 내용물이 누출되기 전에 부서진 세포막을 복구하여 자체 내부의 상처를 치유할 수 있습니다. 세포 크기가 1mm가 넘을 수 있는 거대 단세포 유기체인 스텐터 코에룰루스(Stentor coeruleus)는 단세포의 상처 치유를 연구하기 위한 고전적인 모델 유기체였습니다. 스텐터 세포는 생존력을 잃지 않고 반으로 절단할 수 있으며, 함께 절단하고 이식할 수도 있습니다. 그러나 절단에 대한 이러한 높은 내성은 왜 세포질이 절단의 크기에서 단순히 흘러나오지 않는지에 대한 의문을 제기합니다. 여기에서는 Stentor 세포를 절단하는 동시에 절단 부근의 세포질의 움직임을 높은 공간 및 시간 해상도로 이미징하는 방법을 제시합니다. 이 방법의 핵심은 개구수가 높은 도립 현미경을 사용하여 고해상도로 아래에서 동시에 볼 수 있는 챔버에 초점을 맞춘 해부 현미경 아래에서 수술을 수행하는 "이층" 현미경 구성을 사용하는 것입니다. 이 설정을 통해 수술 절차를 높은 수준으로 제어할 수 있는 동시에 세포질의 고해상도 추적을 허용할 수 있습니다.

서론

재생과 상처 치유는 중요한 생물학적 과정이며, 그 메커니즘은 활발한 연구 영역으로 남아 있습니다. 사실, 상처를 치료하고 손상된 부분을 재생하는 능력은 생물을 무생물과 구별하는 특징 중 하나입니다. 일반적으로 재생은 줄기세포를 손상되거나 절단된 동물의 부위를 재건하는 데 필요한 다양한 세포 유형으로 분화함으로써 매개되는 것으로 생각되는 반면, 상처 치유는 새로운 세포가 상처에 침입하여 손상되지 않은 상피를 재건하는 것으로 간주됩니다. 따라서 두 과정 모두 개별 세포의 집합체에 의해 매개되는 것으로 보이며, 따라서 본질적으로 다세포 과정으로 보입니다. 따라서 개별 세포가 어떤 경우에는 상처를 치료하고 잃어버린 구성 요소를 재생할 수 있다는 것은 잠재적으로 놀라운 일입니다¹. 단세포 내 상처 치유는 액틴-미오신 지갑, 상처 주위의 끈 수축, 외세포성 소포의 빠른 융합에 의한 막 패치 등 여러 경로를 포함할 수 있습니다^1-3. 많은 세포 유형이 어느 정도의 상처 치유 능력이 있지만^4-6 아마도 가장 극적인 예는 그림 1에 표시된 거대 섬모 Stentor coeruelus⁷일 것입니다. 개별 스텐터 세포는 길이가 1mm이며 섬모 열로 덮여 있습니다. 스텐터 세포는 원뿔 모양으로 한쪽 끝에는 수천 개의 섬모로 구성된 구강 장치가 있고 다른 쪽 끝에는 좁은 고정 구조가 있습니다. 스텐터(Stentor)는 재생을 연구하기 위한 고전적인 모델 유기체였는데, 그 이유는 세포의 어느 부분이라도 잘려나가면 재생될 수 있기 때문이다⁷. 예를 들어, 토마스 헌트 모건(Thomas Hunt Morgan)⁸은 스텐터 세포를 반으로 자르고 각 절반은 몇 시간 만에 정상적인 비율의 세포를 재생한다는 것을 보여주었습니다⁸. 스텐터에서 재생을 담당하는 분자 경로는 완전히 알려지지 않았습니다.

스텐터 세포가 재생 모델 시스템 역할을 하는 능력은 절단 후 스스로 치유하는 이 세포의 놀라운 능력에 달려 있습니다. 스텐터 세포를 절단할 때 세포질이 누출되지 않는 이유는 무엇입니까? 상처 치유는 세포 피질의 즉각적인 수축에 의한 것이 아닌데, 그 이유는 두 개의 스텐터 세포를 취하여 절단한 다음 두 개의 절단된 세포를 다양한 형태로 결합하는 것이 가능하기 때문이다⁷. 이러한 이식 실험 동안 두 세포의 세포질은 세포가 서로 밀착될 때 융합하기 때문에 노출된 상태로 유지되어야 합니다. 어쨌든 세포질은 이식이 가능할 만큼 주변 매체에 충분히 노출되어 있지만 아직 세포 밖으로 흘러나오지 않습니다. 스텐터의 세포질은 원형질막에 큰 구멍을 뚫어도 흘러나올 수 없을 만큼 충분히 탄성이 있습니까? 세포는 세포질이 흘러나오는 것을 막기 위해 상처 주위의 세포질의 점도를 국소적으로 증가시킵니까? 세포질은 매우 복잡한 활성 물질^9-11이며, Stentor 상처 치유 반응은 단세포 상처 치유 중 세포질의 흐름과 역학을 연구할 수 있는 독특한 기회를 나타냅니다. 그러나 스텐터의 상처를 유도하기 위해 수술 방법을 사용하는 것은 기술적인 문제를 야기합니다. 1mm 길이의 셀을 유리 바늘을 사용하여 절단하기 위해서는 기존의 수술 패러다임으로 긴 작동 거리에서 저배율로 수술해야 합니다. 이러한 이미징 조건에서는 세포질의 흐름을 추적할 수 없으며, 세포질이 세포 내부에 남아 있는지 여부만 확인할 수 있습니다. 우리가 묻고 싶은 진짜 질문은 절단과 치유 중에 세포질의 움직임과 점도가 어떻게 변할 수 있는가 하는 것입니다. 이를 위해서는 고해상도 이미징이 필요합니다. 여기에서는 저배율 광학 장치에서 절단을 수행하는 동시에 고해상도에서 세포질 흐름을 관찰하는 동시에 이 시스템을 단세포 상처 치유 메커니즘을 탐색하기 위한 플랫폼으로 사용할 수 있도록 하는 Tartar의 Stentor⁷ 절단 프로토콜의 적응을 제시합니다.

프로토콜

1. 세포 배양 및 수집

1. Tartar⁷에 의해 설명된 대로 자연 연못 또는 상업용 공급업체에서 Stentor coeruleus 세포를 얻습니다(시약 참조).
2. 0.75 mM Na₂CO₃ , 0.15 mM KHCO₃ , 0.15 mM NaNO₃ , 0.15 mM KH₂PO₄ , 0.15 mM MgSO₄ , 0.5 mM CaCl₂ 를 포함하는 Tartar⁷ 및 De Terra¹² 에 의해 설명 된 조리법에서 채택 된 Modified Stentor Medium (MSM)에서 20ºC의 어둠 속에서 성장하여 배양을 유지하십시오. 및 1.47mM NaCl.
3. MSM 배지에 살아있는 먹이를 추가하여 탄소원으로 보충합니다. 표준 배양 방법을 사용하여 Chlamydomonas reinhardtii TAP 배지의 배양을 성장시킵니다¹³. 수유 전에 MSM에서 클라미도모나스 세포를 세척합니다. 300ml의 스텐터 배양액을 주당 ~3 x 10⁷개의 클라미도모나스 세포 2-3회 먹이십시오.
4. 피펫을 사용하여 수술을 위한 스텐터 세포를 수집합니다. 스텐터는 배양 접시의 바닥과 측면에 고정되는 경향이 있으므로 세포를 수집하기 위해 세포가 분리되어 자유롭게 헤엄치기 시작할 때까지 피펫 팁을 통해 공기를 버블링하여 배양
물을 교반합니다.
5. 세포가 전단되는 것을 방지하기 위해 넓은 구멍의 팁이 장착된 피펫을 사용하여 수영하는 세포를 캡처합니다.
6. 수집된 세포를 신선한 MSM으로 세척합니다.

2. 미세수술을 위한 도구의 준비

1. 끝이 녹기 시작할 때까지 두 개의 유리 교반 막대를 Bunsen 버너 또는 기타 화염 위에 놓습니다.
2. 두 막대의 끝을 함께 터치하여 용융 유리가 융합되도록 합니다.
3. 두 막대 사이에 용융된 유리의 작은 방울을 만든 후 화염에서 제거하고 1-2초 동안 식힌 다음 분리하여 깨끗하게 분리합니다. 이상적으로는 유리가 얇은 끈으로 당겨지고 유리가 냉각됨에 따라 부드럽게 부서져 끝에 미세한 끝이 있는 약 1-2cm 길이의 바늘이 생성됩니다(그림 2).
4. 결과 바늘이 최적이 아닌 경우 팁이 유리 폐기물로 부서질 수 있으며 막대가 재사용될 수 있습니다.

3. 미세수술 및 관찰을 위한 세포 장착(일반 수술)

1. 바셀린으로 코팅된 정사각형 고무 스탬프를 사용하여 정사각형 바셀린 벽 챔버를 준비하고 유리 커버슬립에 압착합니다.
2. 2% 메틸 셀룰로오스가 함유된 MSM을 바셀린 사각형에 추가합니다.
3. 커버슬립을 플라스틱 어댑터에 넣으면 표준 슬라이드 홀더를 사용하여 커버슬립을 현미경에 놓을 수 있습니다(그림 3).
4. 1.6단계에서 세척된 세포를 MSM과 메틸 셀룰로오스에 첨가하여 스텐터 세포의 운동성을 방해하여 수술 중에 제자리에 유지되도록 합니다.
5. 메틸 셀룰로오스의 세포를 배열하여 균일한 간격을 유지하고 이미징 중에 초점이 맞춰질 수 있도록 커버슬립 표면에 충분히 가깝게 밀어 넣습니다.

4. Live Stentor에서 상처 치유의 고해상도 이미징

저배율로 외과적으로 절단하는 동시에 고해상도로 Stentor 세포를 이미지화하려면, 거꾸로 된 내시경의 접안렌즈 헤드에 해부 내시경이 부착된 "이층" 현미경을 구성하여 거꾸로 된 내시경은 슬라이드 상단에서 초점을 맞추고 거꾸로 된 내시경은 슬라이드 아래에서 초점을 맞춥니다.

1. 거꾸로 된 스코프에 슬라이드를 놓습니다(Zeiss Axiovert 200M 또는 Olympus IX80 사용).
2. 스탠드에서 해부 현미경 본체를 제거하고 저배율에서 슬라이드를 시각화할 수 있도록 해부 스코프를 배치하기 위한 도립 현미경 접안렌즈 위의 대략적인 위치를 결정합니다.
3. 인버티드 스코프 접안렌즈 헤드와 해부 스코프 사이의 원하는 간격과 동일한 두께로 판지 상자를 수정한 다음 실험이 완료되면 쉽게 제거할 수 있는 실험실 테이프를 사용하여 인버티드 스코프에 테이프를 붙입니다. 도립 현미경의 접안렌즈 헤드의 정확한 구성과 해부 현미경의 크기에 따라 상자의 두께를 조정하여 샘플이 부착 후 해부 내시경을 이동할 필요 없이 시야에 있도록 합니다.
4. 해부 스코프를 상자에 대고 슬라이드에 초점이 맞춰질 때까지 이동한 다음 실험실 테이프를 사용하여 상자에 다시 테이프로 붙입니다. 최종 구성은 그림 4에 나와 있습니다.
5. DIC 광학 장치와 20X 공기 대물 렌즈를 사용하여 도립 스코프를 통해 세포를 이미지화합니다. 긴 작동 거리 DIC 콘덴서를 사용하여 위에서 미세 수술을 수행할 수 있는 충분한 공간을 확보하십시오.
6. 512 x 512 CCD 카메라를 사용하여 초당 2개 이미지의 프레임 속도로 이미지를 획득합니다.
7. 초기 세포질 흐름 패턴을 포착하고 상처 및 상처 치유 과정의 모든 단계를 관찰하기 위해 세포 절단을 시작하기 전에 수집을 시작합니다.
8. 세포가 정상적인 모습 및/또는 활발한 운동성을 회복하면 획득을 종료하여 재생 과정 전반에 걸쳐 세포질 움직임을 시각화하고 측정합니다.

5. 상처 치유 중 세포질 흐름 분석

입자 이미지 속도계(PIV)를 사용하여 세포질 흐름을 측정합니다. 이 기술은 유체 역학 연구에서 일상적이며 유체에 개별적으로 추적 가능한 입자가 없는 경우 유동장을 생성할 수 있습니다. PIV는 투과 광 현미경¹⁴에 의해 세포질에서 볼 수 있는 세포질에서 볼 수 있는 세포 내 소포 및 기타 특징의 이미징을 기반으로 세포질의 흐름을 측정하는 데 사용되었습니다.

1. 웹 사이트 http://pivlab.blogspot.com/ 에서 PIV용 MATLAB 패키지인 PIVLab을 다운로드합니다.
2. 각 비디오 시퀀스에 대한 tiff 이미지 스택을 MATLAB 내의 PIV 프로그램으로 불러옵니다.
3. 각 이미지 스택에 대한 마스크를 수동으로 생성하여 Stentor의 본문 외부에 있는 원시 데이터 영역을 마스킹합니다.
4. 고속 푸리에 변환 설정과 64 x 64 픽셀의 빈 크기를 사용하도록 PIVLab을 설정하면 각 프레임의 픽셀이 더 큰 정사각형 픽셀로 빈됩니다.
5. PIVLab을 실행하여 각 프레임의 픽셀과 다음 프레임의 인접 픽셀 간의 상호 상관을 계산하여 원시 데이터와 동일한 시간 해상도를 가진 각 binned 픽셀을 중심으로 하는 시간 종속 흐름 벡터를 생성합니다.
6. 결과 벡터장 출력의 시간 평균을 계산하여 절단 전과 상처 치유 중에 스텐터로 촬영한 데이터를 비교하기 위한 유선을 생성하고, 유속(유동 강도를 연구하기 위해) 및 시간 경과에 따른 주어진 픽셀에서의 속도 변화(유동 변동을 연구하기 위해)의 히스토그램을 계산합니다.
7. 스텐터(Stentor)가 반으로 쪼개지고 세포질이 주변 완충액으로 눈에 띄게 누출되는 이미지 시퀀스의 경우, 평균 유속에 세포질의 세포외 기포 기저부의 단면적을 곱하여 세포질의 총 플럭스를 적절하게 계산합니다.

결과

위에서 설명한 프로토콜을 사용하여 Stentor의 세포질이 절단 전과 절단 후 모두에서 매우 역동적이라는 것이 밝혀졌습니다. 동영상 1은 절단되지 않은 세포에 존재하는 세포질의 광범위한 흐름을 보여줍니다. Stentor가 절단에서 살아남을 수 있는 능력은 세포질의 경직 또는 겔화를 포함할 것이라는 원래의 예상에도 불구하고, 실제로 Stentor 세포가 세포질에서 세포질을 끌어낼 수 있을 만큼 충분히 격렬하게 절단될 때 세포질은 매우 역동적인 상태를 유지하고 고도로 지시된 방식으로 세포로 다시 흐를 수 있습니다(비디오 2).

상처 치유 중 이전에는 예상하지 못했던 수준의 세포질 움직임을 입증하는 것 외에도, 분석의 고해상도 이미징은 입자 이미지 속도 측정을 사용하여 유속을 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 측정을 수행할 수 있는 능력을 통해 화학 억제제의 효과를 엄격하게 테스트할 수 있습니다.

그림 1. 살아있는 스텐터 세포의 형태학. 절차 1.3에 설명된 대로 클라미도모나스를 공급받은 살아있는 스텐토르 세포의 암시야 이미지로, 식품 액포 내부에서 녹색 물질로 볼 수 있습니다. 세포가 먹는 구강 기관은 이미지 상단에서 섬모 테두리로 볼 수 있습니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2. 수술용 유리바늘 준비. (A) 바늘은 단단한 유리 막대의 끝에서 뽑습니다. (B) 수술에 필요한 길이와 날카로움을 나타내는 바늘 끝의 고배율 보기. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3. 미세 수술을 위한 맞춤형 커버슬립 홀더. 최적의 이미징 조건을 허용하면서 수술을 위한 개방적인 접근을 허용하기 위해 세포는 두꺼운 클래스 슬라이드가 아닌 커버슬립에 장착됩니다. 커버슬립이 현미경 스테이지에 맞도록 하기 위해 3D 프린터를 사용하여 플라스틱 홀더를 제작할 수 있습니다. 홀더는 표준 현미경 슬라이드와 치수가 동일하며 중간의 함몰부는 커버슬립의 치수와 일치합니다. 한쪽 모서리에 있는 구멍을 통해 커버슬립을 홀더에서 튀어나올 수 있습니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4. 이층 현미경 구성. 해부 현미경 헤드는 도립 현미경의 접안렌즈 헤드 위에 장착됩니다. 실험실 테이프를 사용하면 실험이 완료되었을 때 장치를 신속하게 조립하고 분해할 수 있습니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

비디오 1. 살아있는 스텐터 세포에서 관찰된 세포질 흐름의 예. 암시야 광학 장치를 사용한 10X 대물렌즈로 2프레임/초의 속도로 셀 이미지화.

비디오 2. 나는 스텐터 세포가 유리 바늘로 절단되고 파괴되는 것을 상상해 본다. 절단 후 상당한 양의 세포질이 주 세포체에서 빠져나갔지만 빠르게 세포로 다시 흘러 들어갔습니다.

토론

이 방법의 가장 중요한 응용 분야는 Stentor에서 상처 치유 동안 세포질 흐름을 조절하는 분자 경로를 결정하는 데 사용하는 것입니다. 세포골격의 구성 요소뿐만 아니라 모터 단백질을 표적으로 하는 광범위한 화학 억제제를 사용할 수 있습니다. 칼슘 신호 전달 억제제도 후보가 될 가능성이 높습니다. 스트레스 하에서 세포에서 방출되는 파란색 색소 Stentorin을 포함하는 색소 과립(압출체)을 제거하거나 감소시키고 Stentorin의 엑소 세포 방출이 인근 세포질의 흐름에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 묻는 것도 흥미로울 것입니다. 안료는 절단 직전에 수행할 수 있는 간단한 표백 처리⁽¹⁵ )를 사용하여 고갈될 수 있습니다. 세포를 한 번에 하나씩 절단하고 영상화해야 하기 때문에 상처 치유 분석을 병렬 방식으로 수행하는 간단한 방법은 없는 것 같습니다. 따라서 단일 현미경을 사용하면 0.5시간당 약 1개의 속도로 세포를 작업하고 측정할 수 있으므로 하루 동안 단일 화합물에 대한 충분한 데이터 포인트를 얻을 수 있어 공정에 통계적으로 유의미한 영향을 미치는지 확인할 수 있어야 합니다. 따라서 이 방법은 어떤 의미에서도 높은 처리량은 아니지만 신중하게 선택된 몇 가지 표적 경로에 특이적인 선택된 후보 화합물 세트를 통해 스크리닝하는 것이 절대적으로 가능합니다.

현재 접근 방식의 주요 한계는 이층 현미경을 조립하는 비교적 조잡한 방법입니다. 이미징에 사용되는 도립 현미경이 다른 작업자가 다른 목적으로 사용해야 하는 일반적인 용도 기기라고 가정할 때, 중요한 고려 사항은 장치를 분해하고 재조립할 수 있는 용이성입니다. 실험실 테이프를 사용하는 현재 방법은 실제로 빠르고 쉽게 분해할 수 있지만 매번 조립하는 동안 사용자가 신중하게 정렬해야 합니다. 따라서 중요한 수정은 거꾸로 된 스코프의 접안렌즈 헤드와 해부 스코프의 본체를 위한 슬롯이 있는 맞춤형 탈착식 홀더를 구성하는 것입니다. 이것은 최신 3D 프린터 기술을 사용하여 쉽게 제작할 수 있어야 합니다.

접근법의 두 번째 한계는 흐름의 마커로서 세포내 소기관의 DIC 이미징에 의존한다는 것입니다. 현미경에서 관찰되는 이러한 소기관의 정체는 현재 알려져 있지 않기 때문에 크기나 다른 세포 구성 요소와의 잠재적 상호 작용을 알 수 없습니다. 따라서 형광 구슬과 같은 외인성 추적자를 주입하고 이를 사용하여 흐름을 추적하는 것이 유리할 수 있습니다. 그러나 이를 위해서는 실험을 수행하기 전에 추가 단계인 미세 주입이 필요하므로 분석 속도가 더욱 느려집니다.

마지막 주요 제한 사항은 데이터 수집을 위해 단일 이미지 평면에 의존한다는 것입니다. 이 분석의 가장 중요한 점은 단순히 상처가 치유되는지 여부를 묻는 것을 넘어 흐름 패턴에 대한 자세한 분석을 얻을 수 있다는 것입니다. 이와 관련하여 이미징을 3차원 이미징으로 확장하는 것이 매우 중요할 것입니다. 현재 방법은 단일 초점면을 이미지화하므로 PIV 분석이 수행될 때 결과는 전체 3차원 유동장을 통한 슬라이스입니다. 이것은 유익하지만 불완전합니다. 각 시간 단계에서 3D 이미지를 획득하면 완전한 3차원 흐름장을 얻을 수 있어야 합니다. 이것은 세포질이 상처 부위 바로 근처에서 어떻게 움직이는지 정확히 관찰하는 데 특히 중요합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Stentor coeruleus 살아있는 배양	Carolina Biological	131598
Methyl Cellulose, 1,500 cP	Sigma	M0387
EQUIPMENT:
Material Name	Company	Catalog Number
Soft glass stirring rod 5 in long	Fisher Scientific	11-380A
Culture Dish 4.5 인치 250 ml  유리	캐롤라이나 생물학적	741004
IX81 도립 현미경	올림푸스
Axiovert 200M 도립 현미경	Zeiss
Stemi 2000 스테레오 현미경	Zeiss
Evolve 512 x 512 EMCCD 카메라	광도 계획
Apo 20X 대물렌즈	Olympus	UPLSAPO