막 성인 쥐에서 Ventromedial 시상 하부 뉴런의 잠재적 인 염료 이미징은 포도당 감지를 연​​구하는

요약

성인 세 마우스의 단일 뉴런의 활동은 특정 뇌 영역에서 신경 세포를 해리와 형광 막 잠재적 인 염료 이미징을 사용하여 공부하실 수 있습니다. 포도당의 변화에​​ 시험 응답으로,이 기술은 성인 ventromedial 시상 하부 뉴런의 포도당 민감성을 연구하는데 사용될 수있다.

초록

신경 세포의 활동에 대한 연구는 종종 증가로 인해 결합 조직과 관련된 기술적 인 문제에 설치류 생후 2 달 이상에서 신경 세포를 사용하여 수행하고 나이가 발생하는 신경 세포의 생존 능력을 감소합니다. 여기, 우리는 성인 세 마우스의 건강한 시상 하부 신경 세포의 분리를위한 방법을 설명합니다. 성인 나이 든 쥐에서 신경 세포를 연구 할 수있는 능력은 나중에 나이에 명시 특정 연구에 대한 더 많은 발달 정확한 수 있습니다 질병 모델의 사용을 할 수 있습니다. 단일 신경 세포를 연구하는 전기 생리학을 사용하는 것이 아니라 해리 뉴런의 형광 이미징은 뉴런 집단의 활성을 연구하기 위해 이용 될 수있다. 원하는 신경 세포의 종류는 시상 하부의 포도당 감지 신경 세포에 대한 희귀되는 이기종의 연결 인구를 공부 할 때 특히 유용합니다. 우리는 차에 자신의 반응을 연구하는 성인 ventromedial 시상 하부의 신경 세포의 막 잠재적 인 염료 영상을 활용세포 포도당 nges. 포도당 감지 뉴런 에너지 균형의 조절에 중심적인 역할을하는 것으로 생각된다. 성인 설치류에서 포도당 감지 기능을 연구 할 수있는 능력은 장애 에너지 균형 (예. 비만) 연령 증가와 관련된 질병의 우세 이후에 특히 유용합니다.

서론

뇌는 신경 내분비 및 자율 신경 시스템을 통해 에너지 항상성을 조절한다. ventromedial 시상 하부 (VMH)에 ventromedial 핵 (VMN) 및 아치형 핵 (ARC)으로 구성된 에너지 항상성의 중추 조절에 중요​​하다. 전문 포도당 감지 뉴런은 VMH 내에서 신경 세포의 활동과 주변 포도당 항상성 ^1을 연결합니다. 포도당 여기 (GE) 포도당 (GI) 신경 세포의 포도당이 증가함에 따라 자신의 활동을 감소 억제하면서 신경 세포가 증가, 신경 세포를 감지하는 포도당의 두 가지 유형이 있습니다. VMH 포도당 감지 신경 세포는 일반적으로 전기 생리학 또는 칼슘 / 막 잠재력에 민감한 염료의 이미지를 사용하여 연구한다.

전기 생리학 패치 클램프 기술은 생체 신경 세포 활동의 연구에서 황금 표준으로 간주됩니다. 이 기술에서는, 유리 마이크로 피펫 전극은 높은 저항을 통해 세포막에 부착(GΩ) 인감. 패치 클램프 전극은 활동 전위의 주파수 (전류 클램프) 또는 이온 전도도 (전압 클램프)의 실시간 기록은 단일 신경 세포 내에서 변경 가능. 패치 클램프 기술은 특정 이온 채널 컨덕턴스의 변화에​​ 관한 상세 정보를 제공하는 반면, 주요 단점은 하나의 신경 세포가 동시에 관찰 할 수 있다는 것이다. ....

프로토콜

1. 동물

1. 모든 절차는 뉴저지의 기관 동물 관리 및 사용 의과 대학위원회와 치과에 의해 승인되었다.
2. 그룹 하우스 남성 C57BL / 6 12 시간 light/12 인사 어두운 일정에 마우스 및 물과 음식에 대한 광고를 무제한으로 액세스 할 수 있습니다. 4-5개월 이전에 희생. 마우스의 안락사는 마취의 수술 비행기와 안락사의 보조 형태 (즉, 조리개를 통해 흉강에 절개를 관통)를 사용하여 수행 하였다. 이 안락사에 AVMA 가이드 라인과 일치한다.

2. 관류 솔루션, Coverslips는, 유리 피펫 및 미디어의 준비

1. 2.5 밀리미터의 KCl, 12 mM의 _MgCl2를 1.25 밀리미터의 NaH ₂ PO _4, 28 mM의 _탄산 수소 나트륨, 0.5 mM의 _{염화칼슘으로} 구성된 1L 관류 액을, 12 mM의 포도당, 1 mM의 아스 코르 빈산, 증류 dH보다 ₂ O 3 mM의 피루 베이트 에 ~ (30) 삼투압 조절약 80 g / L의 크로스를 사용하여 0 mOsm. 95 _%, O2 / 5 % CO _....

결과

멀리 다른 시상 하부 지역에서 VMH의 정확한 해부 일관된 결과를 얻을 것이 중요합니다. 다른 지역의 포함은 계산 감극 뉴런의 %를 변경, VMH 신경 인구를 희석 수 있습니다. 또한, 포도당 감지 신경 세포는 VMH 포도당 감지 신경 세포의 기능과 기계적으로 다를 수 있습니다 측면 시상 하부, 시상 하부와 같은 다른 지역에서 확인되었다. 1 적절한 해부에 대한 정확한 해부학 적 위치를 보여줍니다 그림. 상기 프로토콜에 따라, 정확한 VMH 영역을 포함하는 뇌 조직은 분해 될 수있다. 각 모집단 전체를 유지하면서 정확하게, VMN 및 ARC를 분리 또한 절개가 가능하지 않을 수 있습니다. 그림 2는 건강의 예 VMH 신경 해리 보여줍니다. 면역 세포를 사용하여, 우리는 우리의 준비가> 90 %의 신경 세포가 있음을 확인. 남은 건강한 뉴런 데이터 analy 사용해야너무 많은 건강에 해로운 신경 세포와 동생과 요리를 폐기해야합니다. .......

토론

성인 쥐에서 신경 세포의 활동을 연구 할 수있는 열쇠는 건강한 신경 세포를 해리 할 수​​있는 기능입니다. 성인 마우스의 시상 하부 신경 세포의 분리 청소년 쥐에서 신경 세포에 비해 프로토콜의 몇 가지 주요 단계에서 더 어렵습니다. 우리는 여러 가지 방법으로이 문제를 극복했다. 두께 500 μm의 뇌 조각을 만들기 젊은 쥐에서 뇌 조직에 사용되는 보통 250 ~ 350 μm의 슬라이스에 비해 신경 세포에 기계적 손상을 최소화합니다. 그러나, 두꺼운 조각 심장 관류 및 뇌 조직의 파파인 소화에 더 큰주의가 필요합니다. 혈액이 뇌 조직에서 볼 경우, 우심방의 컷과 좌심실에 배치 바늘의 정밀도와 위치를 평가한다. 유량 및 관류 액의 양이 또한 조정될 수있다. 혈액은 신경 세포에 독성이 건강한 뉴런의 낮은 수율 원인이되므로 철저한 살포는 필수적입니다. 파파인 소화 수 있도록 충분히 효율적이어야합니다부드러운 분쇄 및 뇌 조직에서 단일 세포를 쉽게 릴리스. 큰 조직 조각이 제 분쇄 중에 존재할 때 VMH 조직 소화의 끝에서 빠르게 싱크 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Neurobasal-A Medium (Custom)	Invitrogen	0050128DJ	맞춤형 포도당 무료
Hibernate-A Medium (Custom)	BrainBits		맞춤형 포도당 무료
페니실린 스트렙토마이신 (20,000 U/ml)	Invitrogen	15140	기타 공급업체 허용
가능한 Stericup 진공 필터 유닛 (0.22 μ m)	Millipore		다른 공급 업체 허용
25mm 유리 커버 슬립	Warner	# 1 25mm 라운드
18mm 유리 커버 슬립	Warner	# 1 18mm 라운드
GlutaMAX	Invitrogen	35050
B27 마이너스 인슐린 (50x)	Invitrogen	0050129SA
면도날	VWR	55411
비브라톰 & 냉각 챔버	Vibratome	Series 1000 Sectioning system
Vibratome blades	Polysciences	22370	injector or double edge blades from other vendor acceptable
Papain, 현탁	Worthington	LS003124
BSA, 세포 배양에 적합	Sigma		other vendor acceptable
DNAse, for cell culture	Invitrogen		기타 공급업체 허용
클로닝 실린더, 6 mm x 8 mm	Bellco Glass	2090-00608
Membrane Potential Dye (blue)	Molecular Devices	R8042
인라인 히터	Warner	SF-28
주사기 펌프	WPI	sp100i	기타 공급업체 허용
폐쇄 챔버	Warner	RC-43C
폴리에틸렌 튜빙	워너	PE-90
메타모프	분자 장치		대체 이미지 분석 소프트웨어 허용
현미경	Olympus	BX61 WI	10X와 함께 사용됨  objective
카메라	광도 측정	Cool Snap HQ
Narrow Cy3 필터 세트	Chroma	41007a
조명 시스템	셔터 악기	Lambda DG-4

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