추출 및 인간과 원숭이의 머리에서 코르티솔 분석

요약

코르티솔 (CORT)은 인간과 인간이 아닌 영장류의 성장 머리 갱구에 축적. 우리는 높은 정밀도 및 감도로 머리 CORT를 추출하고 분석하는 방법을 설명합니다. 머리 CORT의 측정은 특히 개월 주 기간 동안 만성 스트레스를 평가하기에 적합합니다.

초록

스트레스 호르몬 코르티솔 (CORT)은 서서히 인간, 비인간 영장류, 그리고 다른 포유 동물의 성장 머리 샤프트​​에 통합됩니다. 우리는 개발과 검증 된 붉은 털 원숭이의 머리에서 CORT 추출 및 분석하는 방법을 연속적으로 인간의 두피 모발에 사용하기 위해이 방법을 적용. 플라즈마 또는 침에서 얻은 CORT "포인트 샘플"대조적으로, 머리 CORT 호르몬 결합의 기간 동안, 시상 하부 - 뇌하수체 - 부 신피질 (HPA) 시스템 활동의 통합 측정, 따라서 생리적 인 스트레스를 제공합니다. 사람의 두피에 머리가 1cm / 월의 평균 속도로 성장하고 있기 때문에, 머리 부분에서 얻은 CORT 수준의 길이는 몇 cm 잠재적 개월 수에 대한 경험이 스트레스의 바이오 마커 역할을 할 수 있습니다.

우리의 방법에서, 각 모발 샘플은 제 땀과 피지에서 증착 된 머리 샤프트​​의 외부로부터 어떠한 CORT 제거 이소프로판올에 두 번 세척한다. 건조 후,샘플은 모발 단백질의 행렬을 분해 및 추출을위한 표면적을 증가시키는 미세 분말로 분쇄된다. 모간의 내부로부터 CORT 메탄올로 추출하고, 메탄올을 증류 제거하고, 추출액을 분석 완충액에서 재구성된다. 추출 CORT, 표준 및 품질 관리와 함께, 다음 민감하고 특정 시판 효소 면역 측정법 (EIA) 도구에 의해 분석된다. EIA의 판독은 MG 분말 머리 무게 당 PG의 CORT으로 변환됩니다. 이 방법은 인간의 머리 CORT을 분석하기 위해 실험실에서 사용 된, 짧은 꼬리 원숭이, 명주 원숭이, 개, 그리고 북극곰의 몇몇 종. 우리가 실험실에서와 다른 연구 그룹 모두에서 많은 연구가 자연에 만성 스트레스에 노출을 평가뿐만 아니라 실험실 설정에 대한 머리 CORT의 광범위한 적용 가능성을 증명하고있다.

서론

혈장, 타액, 또는 때때로 소변이나 대변의 CORT 측정 스트레스 ¹ HPA 축의 역할 Selye 디스커버리시기 생리적 스트레스의 지표로서 사용되었다. 수많은 논문이 급성 스트레스 상황에 HPA 활동과 관련된 발행되었지만, 필드는 만성 생리적 스트레스 간단하고 신뢰성 지수의 부족에 의해 방해되었다. 이 문제가 발생주기 차이가있을 수있는 환경 교란에 의해 혼동 될 수 HPA 활동의 플라즈마 침 수율 모두 "포인트"예상하기 때문이다. 오줌과 배설물 샘플 어떤 경우에는 하루 종일까지 시간의 숫자에 걸쳐 CORT 및 / 또는 대사 산물의 배설의 측정 값을 얻을 수 있습니다. 그러나, 이들 접근법 중 어느 것도 HPA 활성의 진정한 장기 인덱스 및이 싸이의 응답 성을 제공하지 않는다; 이러한 행렬들의 임의 시간 경과 CORT 레벨의 거친 지수를 제공 할 수있다하여 여러 샘플의 컬렉션만성 스트레스에 줄기.

머리에 CORT를 측정하는 것은 스트레스 문학이 중요한 필요를 채우기 위해 시작했다. 여러 실험실에 의한 초기 연구는 인간의 머리에 CORT의 존재를 증명하지만, 머리 CORT 수준이 스트레스 ^2의 함수로 변경 여부를 조사하지 않았다. 우리 연구실은 다양한 사회 및 행동 요인 ^(3)에 의해....

프로토콜

1. 시료 채취 및 보관

1. 사람의 모발
   1. 고무 밴드 나 클립 (직경 연필 폭까지) 샘플링 할 수있는 머리의 전체 길이를 고정합니다. 최대한 두피에 가깝게 잘라 머리 깨끗한 가위 (닉은 피부를 돌보는). 주 : 표준 샘플링 에리어가 두개골의 후방 정점이다.
   2. 일부 연구자들은 비록 볼 Manenschijn 등. ⁸ (물과 샴푸 ⁷ 반복 노출에서 유실로 인해 수 있습니다 두피 ^6에서 거리를 가진 사람의 모발의 CORT 수준의 감소를보고 반하는 결과를 톰슨 등. ^9있다 더 분절 하락이 잠재적 인 "유실 효과"의 영향을 최소화하기 위해) 관찰 된, 우리는 1cm / 월 ^(10)의 평균 성장률을 가정 3cm (,보다 더 큰 길이 두피에 인접 머리 세그먼트를 수집하는 것이 좋습니다 3cm 세그먼트는 C를 포함약 지난 3 개월 동안 퇴적 된 ORT). 이 작업을 수행하려면 첫 번째 컷에서 3cm를 측정하고 3cm 샘플을 얻을 다시 잘라 통치자를 사용합니다. 참고 : 머리 길이로 절단되면,이 연구는 이전의 샘플링 기간 동안 CORT 증착의 회고 일정을 설정하는 별도의 1cm 긴 세그먼트로 샘플을 절단 포함하지 않는 정렬 가닥을 유....

결과

그림 1은 방법 2 분쇄 및 추출을 사용하여 처리 사람의 모발 샘플 (성인 남성과 여성의 인체)의 대표 세트의 출력을 보여줍니다. 컴퓨터 소프트웨어는 데이터 출력을 생성하고 CORT 표준에 4 - 파라미터 S 자형 곡선 (도 2)을 맞추기 위해 사용되었다. 이 판의 사이에 잘​​ CVS는 0.01-5.73 %에서 1.34 %의 평균 내부 분석 CV와 함께였다. 분석 간 CV는 4.41 % 아홉 최근 인간의 머리카락 분석에서 QC 값을 사용하여 결정되었다. (; SD 평균 ± = 36.0 ± 110 PG / MG를 평균 = 10.2 PG / MG)이 접시에 분석 된 37 샘플 3.1-650 PG / MG에서 헤어 CORT 값의 범위를 얻었다.

방법 1은 인간이 아닌 영장류 등 대형 동물의 모발 샘플을 처리하기 위해 우리 실험실에서 사용된다. (주로 여성에서) 성인 붉은 털 원숭이 머리의 대표적인 분석은 50.1-102.......

토론

전술 한 헤어 CORT 절차 수행하도록 심플 상대적으로 저렴하고, 쉽게 이용할 화학 시약 및 소모품의 사용을하게하고, 한 가지 예외 전형적인 분석 실험실에 존재할 가능성이 있다고, 장비를 필요로한다. 예외는 볼밀 미니 beadbeater 같은 연마 장치이다. 우리는 몇 가지 연구 그룹은 작은 조각 길이 ¹² 대략 1mm에 머리 샘플을 말하다 있습니다,하지만 우리는 연삭 수행하는 대신 가능하면 닦지 추천 우리의 관측에 근거. 문헌의 방법 론적 변화의 또 다른 영역은 종래 CORT 추출 ^(13)에 모발을 세정하고, 만약 그렇다면, 무엇 세척 조건의 사용 여부를 포함한다. 세정이 수행되지 않으면, 하나의 메탄올 추출물은 주 또는 육모 개월간 서서히 혼입 CORT뿐만 아니라 최근에 증착 땀 및 / 또는 피지 유래 CORT뿐만 포함될 가능성 위험머리카락의 표면. 아마도 주로 표면 오염을 나타내는 본래 머리의 짧은 이소프로판올 세척, 그리고 광범위한 메탄올 추출 액세스 할 수있는 더 밀접하게 결합 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
HPLC 등급 이소프로판올	Fisher	A451
HPLC 등급 메탄올	Fisher	A452
타액 코티솔 분석 키트	Salimetrics	1-3002	분석 감도 및 특이성에 대한 정보는 제조업체의 키트 삽입물을 참조하십시오.
15ml 폴리프로필렌 스크류 캡 원심분리기 튜브	Max	Scientific 10-9151
1.5ml Safe-Lock 마이크로 원심분리기 튜브	Fisher	05-402-25
2.0 ml Safe-Lock 마이크로 원심분리기 튜브	Fisher	05-402-7
2.0 ml XXTuff 강화 마이크로바이알	BioSpec	330TX	미니 비드비터
3.2 mm 크롬 스틸 비드	BioSpec	11079132c	미니 비드비터
10 ml 스테인리스 스틸 분쇄 용기	Retsch	02.462.0061	믹서 밀
12mm 스테인리스 스틸 연삭 볼			와 함께 사용
15ml 원심 분리기 튜브 용	Savant	S02135
마이크로 원심 분리기 튜브 용 로테이터	Fisher	NC9854190
마이크로 원심분리기 튜브용 벤치탑 원심분리기	Fisher	13-100-675
MM 200 믹서 밀	Retsch	20.746.0001
Mini-Beadbeater 16	BioSpec	607
Savant DNA Speedvac	Fisher	DNA120-115
Savant 냉장 증기 트랩	Fisher	RVT400-115
Savant 케미컬 트랩	Fisher	SCT120	냉장 증기 트랩의 대안
Microplate reader
마이크로플레이트 세척기
Microplate mixer
멀티채널 피펫터
분석 저울

와 함께 사용 와 함께 사용 과 함께 사용 Retsch05.368.0037 믹서 밀 Savant 활성탄 카트리지 Fisher DTK120R 케미컬 트랩 로테이터와 함께 사용 Fisher