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미세 유체의 Picoinjection 금속 전극없이 삭제

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DOI:

10.3791/50913

⸱

2014년 4월 18일

 ,  ,  , 
1Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, Unversity of California, San Francisco

이 논문에서

요약

우리는 금속 전극을 필요로하지 않는 마이크로 유체 방울 picoinjecting위한 기술을 개발했다. 이와 같이, 우리의 기술을 통합 장치 제조 및 사용이 간단합니다.

초록

미세 방울로 시약을 picoinjecting을위한 기존의 방법은 미세 유체 칩에 통합 금속 전극이 필요합니다. 이들 전극의 통합은 디바이스 제조 프로세스에 가시고 오류가 발생하기 쉬운 단계를 추가한다. 우리는 picoinjection 중에 금속 전극에 대한 요구를 미연에 방지하는 기술을 개발했다. 대부분의 생물학적 시약을 용해 전해질을 함유하고 있기 때문에 도전성 대신, 전극으로 주입 액 자체를 이용한다. 전극을 제거함으로써, 우리는 디바이스의 제조 시간 및 복잡성을 감소하고, 디바이스는 더 강력하게. 또한, 우리의 접근 방법으로, 주입 부피는 picoinjection 용액에인가되는 전압에 의존한다; 이것은 우리가 빠른 속도로인가 전압을 조절하여 주입하여 볼륨을 조정할 수 있습니다. 우리는 우리의 기술은 버퍼, 효소, 핵산 등의 일반적인 생물학적 화합물을 통합 시약과 호환되는지 보여줍니다.

서론

액적 기반 미세 유체에서, 마이크론 규모의 수성 액은 생물학적 반응에 대해 "테스트 튜브"로 사용됩니다. 작은 방울의 반응을 수행하는 장점은 각각의 방울 시약 중 일부만 PL을 사용하고, 마이크로 유체, 방울을 형성 할 수 킬로 헤르츠 및 체크 하나에서 처리한다는 것이다. 결합, 이러한 속성은 개별 셀, 핵산 분자, 또는 전체 재료의 μL로 분 만에 수행 할 수있는 화합물과 반응의 수백만을 할 수 있습니다.

이와 같은 응용 프로그램에 방울을 사용하려면 기술은 방울에 시약의 제어 볼륨을 추가 할 필요; 이러한 작업은 테스트 튜브에 피펫 팅 유사하다. 시약의 방울은 전기장을인가함으로써 타겟 강하와 병합되는 것을 특징으로이를 달성하기위한 하나의 방법은, electrocoalescence이다. 전계는 방울의 인터페이스에서 계면 활성제 분자의 배열을 방해, IND박막의 불안정성을 ucing 2 그렇지 않으면 안정이 유제의 유착을 유발. 전기적으로 유도 된 병합도 picoinjector 그들이 가압 채널 3을지나 유동으로 방울로 시약을 주입 장치의 설계에 이용된다. 전계를 적용하려면 picoinjector 장치는 금속 전극을 이용하지만, 액체 솔더 와이어가 쉽게 채널에 기포 나 먼지 나 다른 이물질에 의해 손상되는 미세 유체 칩에 금속 전극의 통합은 종종 복잡하고 오류가 발생하기 쉬운 공정이며 뿐만 아니라, 스트레스 골절 또는 장치를 설치하는 동안 절곡.

여기서 우리는 제조가 간단하고 견고하게, 금속 전극을 사용하지 않고 picoinjection을 수행하는 방법을 제시한다. 대부분의 생물 시약이 용해 된 전해질을 포함하는 전도성 때문에 picoinjection를 실행하기 위해, 우리는 대신에, 전극으로 주입 액 자체를 사용합니다. 우리는 또한 "패러데이 모아 추가보편적 인 지상 (그림 1)과 같은 장치와 행위의 민감한 지역을 보호하는 T "는. 해자는 전기적으로 접지를 제공하는 의도하지 않은 방울 합병을 방지하여 picoinjection 사이트의 상류 방울을 분리합니다. 우리의 기술의 이점은 그 알갱이로 주입 부피는인가 된 신호를 조정하여 조절 될 수 있도록,인가 전압의 크기에 의존한다.

우리는 소프트 리소그래피 기술 4.5을 사용하여 폴리 (디메틸 실록산) 우리의 장치 (PDMS)을 제조. 우리의 접근 방식은 수지, 플라스틱과 에폭시와 같은 다른 재료로 제조 장치와 호환됩니다. 채널은 높이와 물방울 직경이 50 ㎛ (65 PL) 작업에 최적화되어 30 ㎛, 폭을 보유하고 있습니다. 우리는 방법의 descr가 유사한 0.50 mm 생검 펀치와 장치 제조시 생성 된 포트에 삽입되는 polyethelene 튜브 (0.3/1.09 mm 내부 / 외부 직경)를 통해 시약을 소개합니다IBED 이전 5. 주입 된 유체의 실제 메이크업은 특정 애플리케이션에 의존한다. 유체는 필요 picoinjector에 송신하는 전기 신호에 충분한 도전율을 수득 할만큼 높은 농도에서 용해 된 전해질을 함유한다. 벤치 테스트에서, 우리는이 값과 유체 전도도가 특정 장치의 크기와인가 전압의 크기에 따라 달라집니다하지만 10 밀리미터보다 더 큰 이온 농도, 6 충분합니다 것으로 나타났습니다.

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프로토콜

1. 실험을 기반으로하는 디자인 장치의 크기 및 토폴로지는 컴퓨터 지원 설계 (CAD) 소프트웨어를 사용하여 필요

주 : 구형 액적보다 작은 선택 에멀젼 채널 직경. 이 원통형 또는 "소시지"모양으로 물방울을 강제로보다 효과적인 picoinjection 수 있습니다. 우리의 목적을 위해, 우리는 직경 50 ㎛이었다 물방울 30 × 30 μm의 채널을 디자인했다.

  1. 모델 picoinjection 사이트 (들)가 불필요한으로 금속 전극의 채널을 제거하는 것을 제외하고는 아바 테 등. (3)에 의해 기술 된 후.
  2. 패러데이 해자 picoinjection 사이트 (들) 그리고 그들은 전기 분야에서 물방울을 보호하도록 상류 에멀젼 사이에 실행 (그림 1) 역할을하는 채널을 추가합니다.
    참고 :이 의도하지 않은 병합을 방지 할 수 있습니다.

소프트 포토리스를 사용하여 2. 제작하십시오 장치ographic 기술

  1. 기존의 상용 서비스를 사용하여 CAD 파일에 근거 투명도 포토 리소그래피 마스크를 생성한다.
  2. 앞서 설명한 바와 같이 4 포토 마스크와, 마스터 디바이스를 생산하는 실리콘 웨이퍼에 포토 레지스트를 경화.
  3. PDMS가 5cm 폴리스티렌 배양 접시에 함유 장치 마스터 위에 경화제 (11시 1분 비율)과 혼합 붓는다.
  4. 임의의 기포를 제거하기 위하여 약 15 분 동안 진공 데시 케이 터로 PDMS 마스터 배치.
  5. 1 시간 동안 95 ° C의 오븐에 배치하여 PDMS 소자 치료. 다르게는, PDMS는 24 시간 후 RT에서 치료할 것이다.
  6. 수술 블레이드 주위에 절단 조심스럽게 마스터에서 장치를 박리하여 장치를 제거합니다.
  7. 입구 펀치와 0.5 mm 생검 펀치를 사용하여 PDMS에 구멍 출구.
  8. 플라즈마 본더 4를 사용하여 유리 현미경 슬라이드에 접합 장치.

3. 공기 압력을 준비유체를 포함하는 저수지에 압력을 제어 펌프

  1. 2.7 mm 내경 폴리에틸렌 튜브의 길이를 통해 펌프 출력 등의 압축 공기가 종료 그것을 수정합니다.
  2. 이 같은 튜브가 루어 잠금의 뒷면에 젖꼭지를 통해 루멘을 맞춤으로써 루어 잠금 주사기의 끝에서 종료되는 구축합니다.
  3. 루어 로크 스레드 및 에폭시와 튜브 사이의 공간을 충전하여 밀봉.
  4. 27.5 G 바늘을 연결합니다.

4. 생체 친 화성 계면 활성제 7을 용해 수성의 단 분산 에멀젼 2 % (중량 / 중량)와 불활성 불소 캐리어 오일에 현탁 (유중) 물방울을 준비

이러한 방울에 포함 특정 시약은 애플리케이션에 의존

  1. 재 주입에 대비, 27.5 G 바늘로 1 ML의 주사기에 에멀젼을로드합니다.
  2. 주사기 펌프에 주사기를 안전하고 (바늘 위쪽) 수직 펌프의 방향.
    주의이 방향은 물방울 캐리어 오일 위의 층에 포장됩니다. 펌프가 시작되면, 소적은 그들 아래 유층으로 높은 부피 분율에서 주사기 밀려한다.

5. 미세 유체 칩에 소개 시약을 준비

  1. 생검 펀치, 바늘, 또는 드릴을 사용하여 15 ML의 원심 분리기 튜브 (스크류 캡으로 모든 컨테이너가 충분합니다)의 모자에 세 0.5 mm의 구멍을 뚫습니다.
  2. 그들은 튜브의 바닥에 도달 할 수 있도록 홀이 통해 0.5 mm 직경의 와이어 전극 및 PE-2 튜브 ~ 20cm 길이입니까.
  3. 나머지 홀에서, 유체 레벨 이상 휴식합니다 있도록 PE 배관의 ~ 20cm 길이의 ~ 2.5 cm 실.
  4. UV 경화 에폭시와 캡의 상단에 틈새를 밀봉.
  5. 캡에 picoinjection 유체 및 나사 튜브를 입력합니다.
  6. 삽입에 의해 튜브의 짧은 길이에 공기압 제어 펌프의 출력에 연결루멘에 바늘을 주입. 바늘은 꼭 맞게해야합니다.
  7. 패러데이 해자 역할을하는 1 M NaCl로 1 ML의 주사기를 채우십시오.
  8. 27.5 G 바늘을 연결하고 주사기 펌프에 주사기를 고정합니다.
  9. 캐리어 / 스페이서 오일로 1 ML의 주사기를 채우 27.5 G 바늘을 연결하고 주사기 펌프에 고정.

6. Picoinjection의 미세 유체 장치를 준비합니다

  1. 미세 유체 칩상의 picoinjection 유체의 유입구로 주입 유체 컨테이너로부터 출력 튜브 (이상 길이)를 연결한다.
  2. PE 배관의 길이를 갖는 미세 유체 칩에 대한 패러데이 모트 유입구에 1 M의 NaCl을 함유하는 주사기를 연결한다.
  3. PE 배관의 길이를 갖는 미세 유체 칩의 유입구에 캐리어 오일을 함유하는 주사기를 연결한다.
  4. 미세 유체 칩에 유화 출구에 PE 튜브를 삽입합니다. 튜빙은 에멀젼 회수 조에서 종료, 또는 이용해야mally 1.5 ML의 원심 분리기 튜브.
  5. 미세 유체 칩에 패러데이 해자에 대한 출구로 PE 튜브를 삽입합니다. 튜빙은 비전 도성 및 누전을 방지하기 위해 전기적으로 절연 용기에 종료한다.
  6. picoinjection 유체에 잠긴 금속 전극에 악어 클립을 통해 고전압 (HV) 증폭기의 출력을 연결합니다.
  7. 1 M의 NaCl이 들어있는 주사기 바늘의 금속 악어 입 클립을 통해 HV 증폭기의 접지 전극을 연결합니다.

미세 유체 칩에 7.를 주입 시약

  1. (100)의 속도로 장치에 1 M 염화나트륨 (패러데이 해자) 소개 μL / 시간.
  2. 장치의 크기에 적합한 가격의 물방울 에멀젼과 캐리어 오일을 소개합니다. 우리의 데모 장치를 위해, 우리는 각각 상품 및 오일 200에서 400 μL / 시간을 소개합니다. 유속 방울이 분리 정기적 picoinjector를 전달할 수 있도록한다캐리어 오일의 간극 따라.
  3. picoinjection 오리피스에서의 유체 압력이 액적 채널 기계적 평형되도록 picoinjection 유체에 가해지는 압력을 조정한다.
    참고 :이 압력 (라플라스 압력)에서, 주입 액이 떨어져 신진 (그림 2) 자신의 방울을 형성하지 않고 물방울 채널로 팽창한다. 상술 이러한 유속에서, 우리는 주사 부위에서 평형을 달성하기 위해 유체 주입에 13 ~ PSI의 압력을 적용한다.

8. Picoinjection에게 시작

  1. 물방울이 분사 구멍을 통과하면 적용 0-10 V는, 10 kHz에서, AC 신호는 HV-증폭기로 1,000 × (그림 3) 증폭.
  2. 인가 전압의 진폭을 변경하여 주입량을 변조한다.
    참고 : 높은 전압이 방울을 소개하기 위해 더 많은 유체를 허용해야합니다. 우리의 테스트에서, 우리는 전압에서 안정적이고 일관된 주입을 관찰 할 수사이 100과 3,000 V ~ 500 MM (그림 4)에 이르기까지의 염화나트륨 주사액을 사용.

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결과

현미경 이미지는 picoinjection 유체의 대전 주입 (그림 2) 트리거 할만큼 것을 picoinjection 사이트 쇼에서 찍은 사진. 주입 부피는 높은 주입량을 허용 높은 전압과,인가 전압의 진폭을 변조함으로써 제어 될 수있다. 우리는 (도 3)에서 분사 된 유체의 대표적인 세 molarities 대한인가 전압의 크기에 비해 주입량을 플롯. 속도 우리의 방법을 설명하기 위해 선택적으로 존재 또는 형광 염료 (동영상 1)의 결석에 따라 주사 부위를 통과 방울을 주입했다. 10 kHz에서의 높은 비율이 가능하다하더라도 방울 방울 검출기구 (3)의 기능에 따라, 200 Hz에서 인젝터를 통과한다.

우리는 사실에인가 된 전압에 대한 주입 부피의 의존 특성 즉 물방울 접근하고 picoinject를 통과이온 오리피스는 주사 부위 융기로부터 액적 인터페이스를 분리하는 오...

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토론

주입 부피와인가 전압 사이의 관계는 그들이 인젝터 통과 디바이스 치수, picoinjection 유체 장치, 몰 농도로 picoinjection 유체를 운반하는 튜브의 길이 및 액 적의 속도를 포함하여 많은 요인에 의존한다. 이러한 이유로 우리는 볼륨 / 전압 관계가 전압과 몰 농도의 작업 범위의 가장자리에 주입 볼륨을 측정하여 picoinjection의 각 실행하기 전에 특징으로하는 것이 좋습니다. 추가적으로, 높은 전압 및 주입 유체 molarities에서 우리 picoinjection 유체가 더 이상 분사 오리피스에서 평형에 유지되는 현상을 관찰하는 대신 오프 싹 및 유동 채널에 작은 방울을 형성한다. 수성 단계는 부분적으로 소수성 채널을 싼다에있어서 우리는 구멍에서 그리고 유로 (11)에 기어 원인, 일렉트로이 문제 때문이다. 이 불안정 원하는 전에 발생하는 경우주입 부피가 달성되고, 그들이 인젝터를 통과하는 액체 방울의 유량을 감소시키고 분사 기간을 증가하는 액적 채널을 좁히는 참고.

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공개 사항

우리는 완전히 우리의 실험에서 관찰 된인가 전압 및 주입 부피 사이의 관계 뒤에 정확한 물리적 인 메커니즘을 이해하지 않습니다. 실험실의 관심과 전문 지식의 관련 영역이 느린 질문을 추구에 적합하지 않습니다. 우리는이 현상을 탐구하기 위해 더 많은 물리학 및 기술 통찰력을 가진 사람들을 격려한다.

감사의 글

이 작품은 UCSF, 양적 생명 과학 (QB3)에 대한 캘리포니아 연구소에서 생명 공학 및 치료 과학의 부에 의해 지원되었다 로저스 가족 재단에서 갭 상을 브리징.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1 ml Luer-Lok™ 주사기BD Medical309628
LocTite UV 경화 접착제Henkel35241
PE-2 튜빙Scientific CommoditiesBB31695-PE/2
Novec HFE-75003M98-0212-2928-5
NaClSigma AldrichS9888
1.5 ml 원심분리기 튜브Eppendorf22363531
BD Falcon 15 ml 튜브BD Biosciences352097
공기압 제어 펌프Control Air Inc.우리는 DAQ 및 제어 소프트웨어 주사기 펌프의 제어하에 하나를 권장합니다
: New Era는 1 ml 주사기를 담을 수 있어야하며 100 &# 956의 낮은 속도로 흐를 수 있어야합니다. l/hr
HV-ampier0.01 및 10V
플라즈마 본더/클리너Harrick Plasma
3" 실리콘 웨이퍼Sigma Aldrich647535
PDMSDow CorningSylgard 184 경화제가 포함된
SU-8 포토레지MicroChem이 포함되어야 합니다.점도는 장치 크기에 따라 다릅니다.
사이의 신호를 1,000배 증폭할 수 있어야 함 스트

참고문헌

  1. Kritikou, E. It's cheaper in the Picolab. Nat. Rev. Genet. 6 (9), (2005).
  2. Ahn, K., Agresti, J., Chong, H., Marquez, M., Weitz, D. A. Electrocoalescence of drops synchronized by size-dependent flow in microfluidic channels. Appl. Phys. Lett. 88 (26), (2006).
  3. Abate, A. R., Hung, T., Mary, P., Agresti, J. J., Weitz, D. A. High-throughput injection with microfluidics using picoinjectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 107, 19163-19166 (2010).
  4. Harris, J., et al. Fabrication of a microfluidic device for the compartmentalization of neuron soma and axons. J. Vis. Exp. (7), (2007).
  5. Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J., Whitesides, G. M. Rapid prototyping of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Anal. Chem. 70 (23), 4974-4984 (1998).
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  9. Herminghaus, S. Dynamical instability of thin liquid films between conducting media. Phys. Rev. Lett. 83 (12), 2359-2361 (1999).
  10. Priest, C., Herminghaus, S., Seemann, R. Controlled electrocoalescence in microfluidics: Targeting a single lamella. Appl. Phys. Lett. 89 (13), 134101-134103 (2006).
  11. Florent, M., Siva, A. V., Hao, G., Dirk, E., Frieder, M. Electrowetting-controlled droplet generation in a microfluidic flow-focusing device. J. Phys: Condens. Matter. 19 (46), (2007).
  12. Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Picoinjection enables digital detection of RNA with droplet rt-PCR. PLoS ONE. 8 (4), (2013).

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