포토 리소그래피 정의 파릴 렌-C에 대한 세포 패터닝 : 그런가 ₂ 기판

합성 물질에 대한 세포 부착 및 패턴을 지시 메커니즘을 이해하는 것은 이러한 조직 공학, 약물 발견 및 바이오 센서 ^1-3의 제조와 같은 어플리케이션에 중요합니다. 많은 기술을 사용할 수 및 진화, 세포 접착에 영향을 미치는 수많은 생물 화학적 및 물리적 인자의​​ 각 복용 장점.

여기서는 처음에 마이크로 제조 목적을 위해 개발 프로세스를 이용하는 휴대 패터닝 기술을 설명한다. 따라서,이 플랫폼은 패터닝 플랫폼으로, 같은 다자간 환경 등의 마이크로 전자 기술의 다운 스트림 통합을 가능하게하기 위해 잘 배치됩니다.

세포막과 인접한 물질 사이의 인터페이스는 양방향하고 복잡하다. 생체 내에서, 세포 외 기질 단백질의 구조와 강도 및 세포 부착 수용체와의 상호 작용을 통해 세포 행동에 따라 영향을 제공한다. V에 마찬가지로 세포물리 화학적 영향도 접착력을 조절하는 동안 나이트로 단백질 ^4의 흡수 층을 통해 합성 기판과 상호 작용합니다. 예를 들어, 중합체 표면은 아세트산 또는 수산화 ^5로 처리함으로써 이온, 자외선 조사, 또는 에칭에 의해 (친수성) 기타 "습윤성"렌더링 할 수있다. 세포 패터닝 설립 방법은 이들과 다른 세포 부착 매개체의 활용. 예를 들면 ^{6 인쇄,} 잉크젯, 미세 접촉 ^{7 스탬핑,} 물리적 고정 ^8, 미세 유체 ^9, 실시간 조작 ^(10), 및 선택적 분자 조립 패턴 (SMAP) ¹¹ (가) ^{있습니다.} 각각의 특정 장점과 제한 사항이 있습니다. 우리의 작업의 핵심 드라이버는, 그러나, 미세 전자 기계 시스템 (MEMS)과 세포 패턴을 통합하는 것입니다.

MEMS는 전기로 구동되는 매우 작은 기계 장치를 참조하십시오. 이 나노 상응 nanoelectromech과 중복anical 시스템. 이 개념은 반도체 전략이 마이크로에서 자리를 차지할 제조를 사용하는 경우에만 실제되었다. 반도체 전자에 대해 독자적으로 개발 한 미세 가공 기술은 실수로 예를 들면, 세포의 전기 생리학 등의 다른 용도로 유용한 것으로 밝혀졌다. 핵심 목표는 하류 (바이오 MEMS 디바이스의 형성) 고 충실도 셀 패터닝 공정과 같은 마이크로 전자 기술을 결합하는 것이다. 여러 기존과 달리 안정적이고 실용적인 세포 패터닝 기술은이 아이디어와 호환되지 않습니다. 예를 들어, 임베디드 마이크로 일렉트로닉스 나 바이오 센서의 정확한 정렬은 그들의 효능에 기초하지만, 이러한 마이크로 콘택트 스탬핑 기술을 사용하여 달성하기 매우 어렵다.

이 문제를 회피하기 위해, 우리는 포토 리소그래피 인쇄 파릴 렌-C를 사용하는 그런가 ₂ 기반 패턴 플랫폼에 노력하고 있습니다. 포토 리소그래피에서 기하학적 기능의 이전을 포함한다UV 조명을 통해 기판에 마스크. 마스크는 적절한 컴퓨터 지원 설계 프로그램을 이용하여 디자인된다. 유리판 위에, 불투명 크롬의 얇은 층을 원하는 형상 패턴 (1-2 ㎜의 피쳐 해상도가 가능하다)를 나타낸다. 패터닝되는 기판은 포토 레지스트의 박층 (UV 구분 중합체)로 피복된다. 코팅 된 중합체는 다음과 정렬 마스크에 밀착된다. UV 소스는 보호되지 않은 구역이 조사되도록 도포하고 뒤 따라서, 마스크 패턴의 파릴 렌-C 표현을 떠나, 다음 현상 공정에 가용성 및 탈착되어있다. 이 프로세스는 반도체 장치의 개발시에 유래. 이와 같이, 실리콘 웨이퍼를 기판으로서 자주 사용된다. 그런가 ₂ 파릴 렌-C의 포토 리소그래피 증착 따라서 정기적으로 마이크로 전자 클린 룸 시설에서 발생하는 간단하고 신뢰할 수있는 과정입니다.

파릴 렌은이 동안여러 가지 바람직한 생체 공학 특성 (화학적으로 비활성, 비 생분해 성), 셀 패턴에서의 직접 사용을 제한하는 요인은 극도의 소수성에 부분적으로 기인은 본질적으로 가난한 세포 접착이다. 그럼에도 불구하고, 파릴 렌-C는 이전에 껍질 멀리 휴대 템플릿 ^{(12, 13)} 예를 들어, 세포 패터닝 간접적으로 사용되어왔다. 이 방법은별로 해상도에 의해 제한하고 여러 단계가 필요합니다. 여기에 설명 된 프로세스는 그 대신 파릴 렌-C 영역 바인딩 소수성 혈청 단백질의 감소의 결합을 통해 세포 접착되어 있도록, 혈청 인큐베이션 산 에칭 공정을 이용한다.

최종 결과는 생물학적 활성화 한 후, 각각의 사이토 접착 또는 사이토 - 반발 특성을 나타내 그래서 효과적인 세포 패터닝 플랫폼을 나타내며, 두 개의 서로 다른 기판으로 구성된 구조입니다. 중요한 생물학적 AG를 도입 할 필요가 없다(그들이 태아 혈청 또는 다른 활성 용액을 사용하여 활성화된다 그러자) 행군 클린 설비로 패터닝 된 기판을 사용하기 이전에 무기한으로 저장 될 수있다.

제조 프로세스가 너무 밀접하게 마이크로 전자 제조에 사용되는 거울로이 parylene-C/SiO ₂ 패터닝 플랫폼 따라서 MEMS 구성 요소와 연합을위한 좋은 후보입니다.

1. 그런가 ₂ 파릴 렌 패턴의 제작 : 프로세스 흐름 (그림 1 참조)

1. 디자인 읽을 수있는 레이아웃 편집기 소프트웨어 패키지 / CIF (Caltech의 중간 형태) 또는 GDS-II (그래픽 데이터베이스 시스템 II) 파일을 작성을 사용하여 파릴 렌-C 구성을 원하는. CIF와 GDS-II는 집적 회로 작품 레이아웃에 대한 업계 표준 파일 형식입니다.
2. 위원회의 포토 마스크가 적절한 마이크로 전자 공학 시설에 제조 또는 시설이 존재하는 경우 사내합니다.
3. 200 nm의 그런가 ₂ 층 (작은 자리 분광 반사 계와 두께를 확인) 생산하는 40 분 동안 950 ° C에서 대기 가로로 (H ₂ 1.88 SLM 및 O ₂ 1.25 SLM)에서 실리콘 웨이퍼를 산화.
4. 실란 접착 촉진제 프라임 산화 ​​된 웨이퍼. 이제 구체적으로 파릴 렌을 입금하도록 설계된 진공 증착 시스템을 사용하여 이량 체의 1.298 ㎚ / MG의 속도로 22 ° C에서 파​​릴 렌-C을 예금. (100)nm 두께의 파릴 렌-C 코팅은 아래의 모든 예제를 사용 하였다.
5. 적합한 포토 레지스트 코팅 시스템을 사용 파릴 렌 코팅 웨이퍼상의 다음 예금 헥사 메틸 디 실라 잔 (HMDS) 접착 촉진제.
6. 지금 적용하면서 30 초 동안 4000 rpm에서 웨이퍼를 스핀 긍정적 상기와 같은 포토 레지스트 코팅 시스템을 사용하여, (1 μM의 이론적 인 두께로 인해 발생하는) 포토 레지스트.
7. 소프트 90 ℃에서 60 초 동안 웨이퍼를 구워
8. 마스크 얼 라이너로 웨이퍼와 premanufactured 포토 마스크를 모두 넣습니다.
9. 원하는 파릴 렌-C 구성의 UV 부정적인 표현으로 포토 레지스트 코팅 된 웨이퍼를 노출합니다.
10. 110 ℃에서 60 초 동안 노출 된 웨이퍼를 구워
11. 모든 적절한 현상액으로 현상하여 웨이퍼로부터 포토 레지스트를 노광 제거한다.
12. 보호되지 않은 파릴 렌을 에칭. 산소 플라즈마 에칭은 50 mTorr의 챔버 압력에서 시스템 (49 SCCM의 O _2, 13.56 MHz에서 100 W RF 전력, 및를 사용기본 그런가 _2를 공개하는 100 ㎚ / 분)의 에칭 속도.
13. 적절한 다이 싱 톱 (스핀들 속도 30,000 RPM, 이송 속도 7mm / 초)를 사용하여 웨이퍼를 주사위.
14. 탈 H ₂ O의 칩을 씻어 질소로 건조한다.
15. 상점 칩 (무기한) 먼지가없는 상자에 필요한 때까지.

2. 칩 청소 및 활성화 : 프로토콜

1. 10 초 동안 아세톤으로 세척하여 칩에서 잔류 포토 레지스트를 제거합니다.
2. 탈 증류수 H ₂ O 3 배에 씻어.
3. 신선한 피라니아 폰산 (5:3 30 % 과산화수소의 비율과 98 % 황산)을 구성한다.
   주의 : 큰 관심과 함께 피라 산을 준비합니다. 또한, 매우 강력한 산화제이다 강산성이고, 황산과 과산화수소 수를 혼합하는 발열 반응이다. 산 흄 후드에서이 단계를 수행합니다. 2 분의 피라 산을 혼합 한 후 통과하지만 20 분 이내에 사용할 수 있습니다.
4. PI에 침수 깨끗하고 에칭 칩10 분 동안 ranha 산.
5. 린스 칩 탈 H ₂ O의 3 배 및 멸균 배양 접시에 전송합니다.
6. 이제 셀 패터닝 칩을 활성화합니다. 예를 들어, 6 - 웰 플레이트에 웰 당 두 개의 칩을 추가하고 완벽하게 모든 칩을 몰입 할 수 있도록 다음 소 태아 혈청 2 ㎖를 추가합니다. 층류 조직 배양 후드에서 무균 조건 하에서이, 이후의 모든 세포 배양 단계를 수행한다.
7. 37 ℃에서 3-12 시간에 대한 혈청 칩을 품어
   참고 : 단계 2.4-2.7가 순차적으로 단계 사이의 지연없이 수행해야합니다. 피라니아 처리가 세포 패터닝 인해 그런가 ₂ 지역에서 감소 된 세포의 반발에 손상 후 혈청 활성화는 ≥ 24 시간 지연됩니다.
   구체적인 세포 접착 단백질을 함유 대체 활성화 용액 소 태아 혈청 대신에 사용될 수있다. 이러한 솔루션은 두 개의 대비되는 기판 (예를 들면 대표적인 결과를 참조)의 세포 접착 특성을 변화.

   3. 온 - 칩 도금 세포주 : 프로토콜

   1. 정품 인증 솔루션에서 칩을 제거하고 행크의 균형 소금 용액에 10 초에 한 번 세척한다.
   2. 물론 문화에 칩을 넣고 평소 성장 미디어에서 정지로 선택 세포 유형을 도금. 최적의 셀 도금 밀도는 세포의 종류와 온 - 칩 파릴 렌-C의 기하학적 인 패턴에 모두 의존한다. 5 × ¹⁰⁴ 세포 / ml의 밀도는 분별 출발점이다.
   3. 이미징은 세포 패터닝하지만 살아있는 세포 행동은 쉽게 적절한 릴레이 렌즈와 해부 현미경과 디지털 카메라를 사용하여 평가 될 수있다에 대한 기본 동기에 맞게 조정됩니다.

파릴 렌-C와 SiO2로 패터닝의 포토 리소그래피 공정은도 1에 도시되어있다. 일단 제조, 소 태아 혈청에있는 칩의 활성화는 문화 패터닝되는 세포 유형의 넓은 범위를 가능하게한다. 우리 그룹은 성공적으로 기본 쥐의 해마 세포 14-16, HEK 293 세포 라인 (17), 인간의 신경 세포와 같은 teratocarcinoma (HNT) 셀 라인 (18), 차 쥐의 소뇌 과립 세포 및 인간의 기본 신경 교종 유래 줄기 세포와 같은 무늬입니다.

그림 3은 '크로스 헤어'확장자를 가진 원형의 노드로 구성된 파릴 패턴에 HEK 293 세포의 강력한 패턴을 보여줍니다. 이 예에서 칩의 활성화는 소 태아 혈청했다. 대조적으로,도 4는 대안적인 활성 용액을 사용하여 패터닝 플랫폼을 확대 할 가능성을 나타낸다. 소 혈청 알부민 (3 ㎎ / ㎖)의 용액을 사용하고 HBSS에 피브로넥틴 (1 ㎍ / ㎖) 이전 패턴의 교훈은 반전되었다.

도 5는 다른 세포 형 (고급 교종 유래 일차 인간 유래 줄기 같은 세포주)를 도시한다. 도 4b 및도 4c에 도시 된 바와 같이 여기에서,도 4a에 도시 된 패턴이 얇은 파릴 렌-C를 따라 세포 성장 프로세스를 촉진과 기본 패턴에 영향 세포 행동의 형상은, 추적한다.

설립 태아 혈청 활성화 프로토콜을 사용할 때 일부 세포 유형 패턴을하지 않습니다. 6 파릴 렌-C와 그런가 2 지역 사이에 뚜렷한 사이토 - 반발 또는 사이토 접착 차이와 합류하기 위해 성장 3T3 L1 세포를 나타낸다 그림.

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그림 1. SiO2로상의 파릴 렌-C 패턴의 제작을위한 과정을 나타낸 도면을 흐른다.

그림 2. 칩 활성화 단계 동안 패턴 파릴 렌-C와 그런가 2 도메인에 대한 접촉각의 변화를 설명하는 흐름도.

그림 3. 체외에서 사흘 parylene-C/SiO 2에서 배양 HEK 293 세포의 라이브 세포 이미징은. 칩은 소 태아 혈청에서 3 시간 동안 배양 세포가 된 후5 × 104 세포 / ml의 농도로 현탁액에 도금된다. 파릴 렌-C는 동안 세포 접착을 촉진 베어 그런가 2 세포를 격퇴한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4. parylene-C/SiO 2 293 세포 배양 HEK의 라이브 세포 이미징 체외에서 사흘 다른 합리화 활성화 솔루션에서 3 시간 동안 활성화 칩 :. A : 태아 혈청, B : 비트로 넥틴 HBSS (1 ㎍ / ㎖) C : 소 혈청 알부민 HBSS, D (3 ㎎ / ㎖) + 비트로 넥틴 (1 ㎍ / ㎖) : 소 혈청 알부민 (3 ㎎ / ㎖) + 피브로넥틴 (156; ㎍ / ㎖) HBSS에. 도금 세포를 5 × 104 세포 / ml의 밀도로 현탁했다. 칩의 다른 치료가 SiO2를 사용하여 이전 패턴의 교리, 지금 접착제 및 파릴 렌-C 반발의 반전의 결과가 얼마나합니다. 휴즈 등. 17에서 적응 파릴 렌-C 노드 직경 250 μm의는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5. . 기본 인간의 신경 교종 유래 줄기 세포와 같은 면역의 이미지 그런가 2 파릴 렌-C의 다양한 패턴에 성장 : 개략적 인 B와 C에 나타낸 망상 파릴 렌의 디자인을 설명 B :.. 아교 섬유 성 산성 단백질 (GFAP)에 스테인드 (체외 4 일 이후에) 고정 된 세포의 형광 현미경 C :. 동일한 칩에 살아있는 세포의 빛 현미경 D : 다른 파릴 렌에 GFAP - 염색 된 세포를 설명 형광 이미지 . 디자인 E :. 반사율 노드의 이미지와는 D 군데 파릴 디자인 스포크 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6. 체외에서 네 일 후에 parylene-C/SiO 2에서 배양 3T3 L1 세포의 라이브 세포 이미징. w 후 태아 혈청에서 3 시간 동안 활성화 칩HICH 세포 현탁액 (1 × 104 세포 / ml)에 플레이 팅 하였다. 이 경우, 플랫폼은 세포가 파릴 렌-C와 그런가 2 지역에 동일하게 융합되고으로, 패턴을 사용하지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.