시투에서 액체에 있는 생물학 어셈블리의 TEM

요약

여기서는 투과 전자 현미경을 이용하여 나노미터 해상도로 액체에 바이러스 성 복합체를 이미지화하는 절차를 설명합니다.

초록

연구원은 정기적으로 전염 전자 현미경 (TEM)을 사용하여 생물학적 개체를 검사하고 새로운 물질을 평가합니다. 여기서는 액체 환경에서 이러한 계측기-바이러스 성 어셈블리를 볼 수 있는 추가 응용 프로그램에 대해 설명합니다. 생물학적 구조를 시각화하는 이 흥미롭고 새로운 방법은 최근에 개발된 미세 유체 기반 표본 홀더를 활용합니다. 비디오 기사에서는 미세 유체 홀더를 조립하고 사용하여 TEM 내에서 액체 표본을 이미지화하는 방법을 보여 줍니다. 특히, 우리는 우리의 모델 시스템으로 시미안 로타 바이러스 이중 층 입자 (DlP)를 사용합니다. 우리는 또한 보기 창에 DLP를 묶는 친화성 생물막으로 액체 챔버의 표면을 코팅하는 단계를 설명합니다. 이렇게 하면 3D 구조 결정에 적합한 방식으로 어셈블리를 이미지할 수 있습니다. 따라서, 우리는 네이티브 액체 환경에서 서브 바이러스 입자의 첫 번째 엿볼을 제시한다.

서론

생물학자와 엔지니어의 공통된 목표는 분자 기계의 내부 작동을 이해하는 것입니다. 전송 전자 현미경 (TEM)은 거의 원자 해상도^1-2에서이러한 복잡한 세부 사항을 시각화하기에 이상적인 도구입니다. TEM의 높은 진공 시스템을 유지하기 위해, 생물학적 샘플은 전형적으로 유리체^3,설탕^4,중금속 염^5,또는 그^일부조합6의 박막에 내장되어 있다. 따라서 임베디드 표본의 이미지는 동적 프로세스의 제한된 스냅샷만 나타낼 수 있습니다.

환경 액체 챔버에서 수화 된 생물학적 표본을 유지하기 위한 초기 시도는 파슨스와 동료들이 차동 펌핑 단계를 사용하여 수행되었습니다. 스테인드 카탈라제 결정의 전자 회절 패턴은^7-8수화 상태에서 3Å의 해상도로 성공적으로 기록되었다. 또한, 위상 분리지질 도메인은 인간 적혈구^9-10의수화 막에서 검사될 수 있었다. 그러나, 액체를 확산시키고 전자빔과의 간섭으로 인한 움직임은, 생물학적 표본을 이용한 심한 분해능 손실 및 추가 실험이 최근까지 시도되지 않았다.

새로 개발된 미세유체 표본 홀더는 반도체 마이크로칩을 활용하여 마이크로 스케일환경챔버....

프로토콜

1. 선호도 캡처 장치 준비장치¹⁶

1. 실리콘 질화물 E 칩을 15 ml의 아세톤으로 2 분 동안 배양하고 2 분 동안 메탄올 15 ml(그림 1A)를청소하십시오. 칩이 라미나르 공기 흐름 아래에서 건조하도록 허용합니다.
2. 150°C에서 1.5시간 동안 가열된 교반판에 말린 칩을 배양한 다음 사용하기 전에 실온으로 식힙니다.
3. 해밀턴 주사기를 사용하여 작은 유리 튜브에 지질 혼합물을 구성하여 25 % 클로로폼을 함유하고, 클로로폼(1mg/ml)의 55%의 DLPC(1,2-딜라우로일-인포콜린)와 20% Ni-NTA 지질(1,2-디오틸-이미노이아세트산-succinyl-니켈 소금)을 총 40μl의 부피량에 대해 클로로폼(1 mg/ml)이다.
4. 습한 페트리접시(그림 1B)에서파라필름 조각에 밀리-Q 물 15μl 방울에 혼합물의 1 μl 알리쿼트를 적용한다. 얼음에 샘플을 60분 이상 배양합니다.

2. 매크로 분자 캡처¹⁷

1. 단층 샘플 위에 150 nm 통합 스페이서가 있는 E 칩을 1분 동안 배양한다(그....

결과

광분 방출된 E칩을 이용한 액체의 DlP의 대표적인이미지(그림 3A)는선호도 캡처 장치(그림3B)에농축된 DlP에 비해 확산으로 인한 특정 보기 영역에서 더 적은 DP를 보여준다. 이미징 챔버에 우라알 수감자를 첨가하면 시편의 대비를 향상시키고 따라서 용액에서 개별 DlP의가시성(도 3C,상단 패널). 더 나은 콘트라스트는 이전에 설명된^17과같이 입자평균(도 3C,하단 패널) 및 3D 재구성 루틴(도3C,인셋)과 같은 다운스트림 이미지 처리를 가능하게 한다. 간단히, 3D 재구성을 위해 우리는 SPIDER 소프트웨어^{패키지(19)를}사용하여 600개의 DP 입자를 선택했습니다. 선택된 입자는 80Å 해상도로 여과된 로타바이러스^DLP(20)의 초기 모델에 대해 정제되었다. 우리는 RELION 소프트웨어 패키지^{(21)를.......}

토론

제시된 작업에서, 우리는 마이크로 유체 플랫폼에 밧줄 로타 바이러스 DLP에 친화성 캡처 접근 방식을 채택했다. 이것은 액체 미세 환경에서 매크로 분자 복합체의 시상 화상 진찰에서 허용했습니다. 포획 접근법은 다른 미세 유체 이미징 기술과 관련하여 중요한데, 이는 액체에서 이미지를 기록하는 동안 발생하는 큰 확산 문제를 부정하기 위해 이미징 창에 생물학적 표본을 국소화하기 때문입니다. 그러나, 우리의 프로토콜에서 가장 중요한 단계 중 하나는 마이크로 칩 표면에 지질 생물막의 전송을 포함한다. 지질 단층이 그리드 위로 고르게 퍼지지 못하면 결함이 있는 실험이 발생합니다. 가난한 전송 단계의 표시는 거의 또는 전혀 바이러스 성 어셈블리 는 유체 칩에 바인딩됩니다. 이송 단계의 한계는 지질 층의 유동성에 관한 열 안정성이다. 이송 단계가 부적절한 경우, 드롭의 고르지 않은 확산에 의해 평가, 지질 층은 더 이상 얼음또는 진동없는 차가운 방에서 인큐베이션해야합니다.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
전자 칩, 스페이서 칩	Protochips, Inc.	EPB-52TBD	400 &뮤; m x 50 &뮤; m 창
전자 칩, 최고 칩	Protochips, Inc.	EPT-45W	400 &뮤; m x 50 &뮤; m 창
Ni-NTA 지질	Avanti Polar Lipids	790404P	분말 형태
DLPC (12:0) 지질	Avanti Polar Lipids	850335P	분말 형태
부피 플라스크	Fisher Scientific	20-812A; 20-812C	1 ml; 5 ml
해밀턴 주사기	Hamilton Co.	80300, 80400	1-10 &뮤; l; 1-25 &뮤; l
Whatman #1 여과지	Whatman	1001 090	100개, 90mm
유리 페트리 접시	Corning	70165-101	100mm x 15mm
유리 파스퇴르 피펫	VWR	14673-010	14673-010
유리 배양 튜브	VWR	47729-566	6mm x 50mm
아세톤	Fisher Scientific	A11-1	1L
메탄올	피셔 사이언티픽	A412-1	1 L
클로로포름	전자 현미경 과학	12550	100 ml
그의 태그가 붙은 단백질 A	Abcam, Inc.	ab52953	10 mg
Milli-Q 급수 시스템	EMD Millipore Corp.	Z00QSV001	초순수
HEPES	피셔 사이언티픽	BP310-500	500 g
장비
포세이돈 In situ 표본 홀더	Protochips, Inc.		FEI 호환 FEI
스피릿 바이오트윈 TEM	FEI Co.		120 kV
독수리 2k HS CCD 카메라	FEI Co.		10  Å/픽셀 샘플링 at 30,000X
Gatan 655 Dry pump station	Gatan, Inc.		펌프 홀더 팁을 10-6  range
PELCO easiGlø, 글로우 방전 장치	Ted Pella, Inc.		음극 모드
Isotemp 가열 교반 플레이트	Fisher Scientific		Heat to 150 º C 1.5

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