Using of a Eight-arm Radial Water Maze to assess Working and Reference Memory following Neonatal Brain Injury(신생아 뇌 손상 후 작업 및 참조 기억을 평가하기 위한 8개의 팔 방사형 물 미로 사용)

요약

팔이 여덟 개인 방사형 물 미로는 피험자가 탈출 플랫폼을 찾기 위해 미로 밖의 신호를 사용하도록 요구하고 지상 기반 방사형 팔 미로 설계에서 관찰된 한계를 해결함으로써 참조 및 작업 기억 성능을 동시에 평가하도록 설계되었습니다.

초록

작업 및 참조 기억은 일반적으로 육지 기반 방사형 팔 미로를 사용하여 평가됩니다. 그러나 이 패러다임은 사전 훈련, 음식 부족을 필요로 하며 냄새 큐 혼란을 유발할 수 있습니다. 여덟 개의 팔이 있는 방사형 물 미로는 피험자가 탈출 플랫폼을 찾기 위해 미로 외 신호를 사용하도록 요구하고 지상 기반 방사형 팔 미로 설계에서 관찰된 한계를 해결함으로써 참조 및 작업 기억 성능을 동시에 평가하도록 설계되었습니다. 구체적으로 말하자면, 피험자는 각 실험일 동안 이전에 탈출에 사용되던 팔(작업 기억)을 피해야 하며, 탈출 플랫폼이 없는 고정 팔(참조 기억)도 피해야 한다. 테스트 세션 동안 탈출을 위해 이미 사용된 팔에 다시 들어가는 것(따라서 탈출 플랫폼이 제거됨)과 참조 기억 팔에 다시 들어가는 것은 작업 기억 결핍을 나타냅니다. 또는 참조 메모리 암에 대한 첫 번째 항목은 참조 메모리 결핍을 나타냅니다. 우리는 이 미로를 사용하여 저산소증-허혈 유도 후 신생아 뇌 손상 및 가짜 대조군을 가진 쥐의 성능을 비교하고 11일간의 테스트 후 작업 기억과 참조 기억 모두에서 상당한 결함을 보여주었습니다. 이 프로토콜은 학습 장애의 다른 많은 모델을 검사하기 위해 쉽게 수정할 수 있습니다.

서론

작업 기억(WM)은 목표 지향 행동¹ 동안 물체나 장소를 표현하는 데 필요한 중요한 인지 영역에 해당합니다. 또는 RM(Reference Memory)은 이러한 개체 또는 장소를 시간적으로 안정적으로 표현하는 데 필요합니다. 작업 기억과 참조 기억은 육상 기반 방사형 팔 미로 패러다임^2,3을 사용하여 설치류에서 오랫동안 평가되어 왔습니다. 그러나 이러한 작업은 쥐가 자발적인 미로 달리기에 취약하지 않기 때문에 사전 훈련이 필요한 경우가 많습니다. 이로 인해 실험을 완료하는 데 필요한 시간이 크게 늘어날 수 있으며 시간에 민감한 종방향 설계에 방해가 될 수 있습니다. 육지 기반 8팔 미로의 다른 한계로는 식량 부족에 대한 요구 사항과 각 시도 후 미로에 남겨진 냄새 신호의 변화를 제어하기 어렵다는 것이 있습니다. 이러한 한계 중 많은 부분이 Morris 물 미로 패러다임⁴을 사용하여 극복되었지만 역사적으로 이러한 설계는 참조 기억 및 공간 학습을 테스트하는 것으로 제한되었습니다(예외^5-9). 여덟 개의 팔이 있는 방사형 물 미로는 여덟 개의 팔이 있는 방사형 육지 미로의 수정된 버전으로, 쥐와 생쥐^5-7의 참조 기억과 작업 기억을 모두 평가하는 데 사용되었습니다. 전통적인 육상 기반 미로와 달리, 8개의 팔로 된 방사형 물 미로는 식량 부족을 필요로 하지 않고, 잠재적인 혼란스러운 냄새 신호를 최소화하며, 사전 훈련^5-7 없이 작업 및 참조 학습 및 기억을 동시에 평가하는 효과적인 수단으로 피험자의 탈출 동기를 활용합니다.

이 패러다임의 한 가지 응용 프로그램은 신생아 뇌 손상 후 작업 기억 결핍을 테스트하는 것입니다. 인간을 대상으로 한 연구에 따르면 뇌 손상 위험이 있는 미숙아는 나중에 작업 기억 결핍을 보인다^10,11. 신생아 뇌 손상은 설치류에서 출생 후 발달 초기에 저산소증/허혈(HI)을 유도하여 모델링할 수 있습니다^12-15. 더 중요한 것은 위험에 처한 유아에서 발견되는 공간 학습 및 작업 기억 결핍이 방사형 팔 물 미로를 사용하는 설치류와 유사하여 이러한 손상 연구를 위한 강력한 모델이 된다는 것입니다^8,9. 8개의 팔이 있는 방사형 물 미로는 또한 참조 기억과 작업 기억을 동시에 정량화할 수 있으므로 시간에 민감한 모델(즉, 개별 발달 과부 동안)에서 뇌 손상 피험자와 비손상 피험자를 비교하거나 균형 잡힌 종방향 설계에 이상적입니다.

이 프로토콜에서는 8개의 팔이 있는 방사형 물 미로(그림 1 참조)를 사용한 테스트 절차와 신생아 저산소성 허혈성 손상이 있거나 없는 쥐에 대한 예제 데이터를 설명합니다. 저산소증-허혈(HI)은 우측 총경동맥의 소작술과 120분 동안 8%의 산소 노출 후 출생 후 7일째에 유발되었습니다. 이 수술 절차는 미숙아 및 신생아 뇌 손상의 병리학을 모델링하는 데 광범위하게 사용되었습니다(자세한 내용은^12,13,16,17 참조). 우리는 방사형 팔 물 미로 패러다임이 신생아 HI 손상 후 참조 기억 및 작업 기억 능력의 결핍을 드러낸다는 것을 보여줍니다. 현재 프로토콜에서 참조 메모리는 8개의 팔로 된 방사형 물 미로의 4개의 특정 팔을 사용하여 평가되며, 이는 테스트 전반에 걸쳐 추가 미로 신호에 일정하게 유지됩니다. 이 팔에는 탈출 플랫폼이 포함되어 있지 않으므로 피험자가 이 팔에 들어가는 것은 낮은 참조 기억 성능과 장기 학습의 결핍을 반영합니다. 나머지 4개의 팔에는 모두 하루가 시작될 때 탈출 플랫폼이 포함되어 있지만, 동물이 팔에 성공적으로 들어가 물을 탈출하면 각 플랫폼이 제거됩니다^5-7. 이를 위해서는 동물이 4번의 연속 시도에서 어떤 팔에 들어갔는지 기억해야 하며, 추가 플랫폼이 제거될 때마다 작업 기억 요구량이 증가합니다. 작업 기억은 같은 시험일 내에 이전에 탈출에 사용되었던 팔로의 재진입 또는 참조 기억 팔로의 재진입을 검사하여 평가됩니다. 또한 이 디자인은 해마 의존 공간 학습을 반영하는 탈출 플랫폼을 찾기 위해 미로 외 신호를 활용합니다. 작업 및 참조 메모리 오류를 평가하기 위한 이 방법은 원래 Jarrard et al.에 의해 사용되었습니다.¹⁸ 이후 노화 관련 신경 장애, 학습 장애 및 호르몬 조작에 대한 설치류 모델을 평가하는 데 광범위하게 사용되었습니다^5,6,7,19,20.

이 패러다임의 주요 목적은 참조 및 작업 기억을 평가하는 것이므로 8개의 팔이 있는 방사형 물 미로 설계는 발달 뇌 손상으로 인한 결함을 테스트하기 위해 제한되어서는 안 됩니다. 대신, 이 패러다임을 사용한 이전 연구는 많은 실험적 맥락에서 학습 및 기억의 병리학을 평가하기 위해 다양한 설치류 모델을 평가할 수 있음을 보여줍니다^{5,6,7,18,19,20}.

프로토콜

모든 절차는 Rhode Island College Institutional Animal Care and Use Committee의 승인을 받았으며 National Institutes of Health Guide의 실험실 동물 관리 및 사용을 준수합니다.

1. 미로 구성

1. 미로 주변에 명확하고 정적이며 눈에 띄는 미로 외 단서(페인팅된 모양, 가구 또는 기타 고정된 방 특징)를 배치합니다.
   참고: 모든 미로 외 신호는 실험 기간 동안 동일한 위치에 있어야 합니다.
2. 방사형 암 미로의 허브와 암을 플라스틱 통에 놓습니다(예: 장비 표 참조).
   참고: 이 프로토콜에 사용된 미로는 검은색으로 칠해진 원형 스테인리스강 베이스에 부착된 8개의 중앙 지지대에 부착된 8개의 탈착식 스테인리스강 암으로 구성됩니다(다이어그램 및 해당 치수는 그림 1 참조). 그림 1에 예시된 플라스틱 통의 내경은 122cm이고 높이는 60cm입니다.
3. 실온(22-26°C)으로 데운 물로 욕조를 채웁니다^.7.
4. 플랫폼을 수면 아래 1cm, 8개의 팔 중 4개 끝에 놓습니다.
   참고 1: 각 피험자에 대해 플랫폼 위치는 테스트 기간 동안 고정됩니다. 구성에 관계없이 두 개 이상의 인접한 암에 플랫폼이 배치되지 않도록 주의해야 합니다(인접한 암에 두 개 이상의 플랫폼이 위치해서는 안 됨). 시작 암에 플랫폼을 배치하지 마십시오.
   참고 2: 숨겨진 플랫폼은 미로 배경과 조화를 이루기 위해 미로 삽입물과 같은 색으로 칠해야 합니다.

2. 시험을 위한 과목 이송

1. 지정된 실험 순서를 유지하면서 사육장에서 실험실로 피험자를 이송합니다.
   참고: 동물은 예측 스트레스를 줄이고 시험실 신호를 보는 것을 방지하기 위해 불투명한 케이지에 넣어야 합니다.
2. 시험장에 도착하면 그룹 1의 모든 불투명 케이지를 시험 순서를 유지하면서 준비 벤치 또는 테이블에 놓습니다.
   참고: 대규모 연구(예: 30명의 피험자)에서는 피험자를 테스트 그룹(예: 각각 10명의 피험자로 구성된 3개 그룹)으로 나누는 것이 가장 좋을 수 있습니다. 이는 시험장의 크기와 피험자 운송의 타당성에 따라 달라집니다.

3. Maze Arm 엔트리 기록을 위한 디지털 태블릿 프로토콜

1. 디지털 태블릿에서 PDF 작성기 프로그램을 엽니다.
2. 그룹의 피험자에 대해 미리 저장된 모든 데이터 기록 템플릿 가져오기 1.
   참고: 각 레코딩 템플릿은 사전 저장되어야 하며 특정 주제 및 시험 번호(예: 주제 1_trial 1, 주제 1_trial 2 등)와 각 주제(시험 1-4)에 대해 총 4개의 템플릿이 있는 레이블이 지정되어야 합니다. 템플릿에는 미로와 플랫폼 위치가 비어 있어야 하며 피험자 번호, 시험 번호, 시험 날짜, 사용된 탈출 플랫폼 및 시험 대기 시간을 기록할 장소가 있어야 합니다(그림 2 참조).
3. 첫 번째 주제의 첫 번째 시도를 위한 템플릿을 엽니다.
   참고: 이 시스템은 태블릿이나 태블릿 기반 메모 작성 프로그램에 액세스할 수 없는 연구원을 위해 종이 템플릿과 함께 사용할 수도 있습니다.

4. 방사형 팔 물 미로 테스트

1. 동물이 쌍으로 수용되는 경우 실험 세션 전에 피험자를 분리하십시오. 첫 번째 피험자를 별도의 불투명 온난화 케이지로 옮깁니다.
   참고: 케이지는 테스트 시험 사이에 체온을 유지하기 위해 가열 패드를 사용하여 37°C로 예열해야 합니다.
2. 각 피험자에 대한 첫 번째 시도 전에 피험자 식별 번호가 데이터 기록 시트의 피험자 번호와 일치하는지 확인하고 플랫폼이 8개의 팔로 된 물 미로에 올바르게 배치되었는지 확인하십시오.
3. 미로의 벽을 향한 시작 암에 피험자를 놓고 타이머를 시작합니다.
   참고: 이 프로토콜은 두 명의 실험자를 위해 설계되었으며, 한 명은 데이터를 기록하고 다른 한 명은 피험자를 처리합니다. 이 협력 과정에서 실험자 간의 의사 소통이 가장 중요합니다. 각 재판 전에 시작 시간, 과목 번호 및 적절한 플랫폼 배치를 확인하는 것이 필수적입니다.
4. 각 시도 동안 신호 일관성을 유지하기 위해 각 시도 동안 방의 지정된 위치에서 정지 상태를 유지합니다.
   참고: 실험 중에 두드러진 신호(예: 향수)가 전송되지 않도록 주의해야 하며, 실험자는 신호 일관성을 유지하기 위해 매일 동일한 의복(실험실 가운)을 착용해야 합니다.
5. 디지털 태블릿의 기록 템플릿에서 해당 암에 표시를 하여 암에 각 항목을 기록합니다.
   참고: 진입은 피험자의 어깨가 팔의 개방 평면을 부러뜨릴 때 발생합니다.
6. 피험자가 네 개의 플랫폼 중 하나를 찾을 때까지 최대 120초를 허용한다. 동물이 플랫폼에 도착하면 타이머를 중지하면 평가판이 완료됩니다.
   주석: 일관성을 유지하기 위해, 피험자는 앞발이 플랫폼에 있을 때 목표에 도달했다고 한다.
7. 피험자가 120초 이내에 발판을 찾을 수 없다면, 가장 가까운 발판으로 조심스럽게 안내하고 10초 동안 플랫폼에 머물게 한 후 동물이 목표 위치를 인지
할 수 있도록 한다.
8. 첫째 날에만 피험자가 네 번의 시도가 모두 끝날 때마다 10초 동안 플랫폼에 앉아 있게 하여 피험자가 공간적 단서를 참조할 수 있도록 합니다.
9. 시험이 완료되면 피험자의 몸을 부드럽게 들어 올려 플랫폼에서 피험자를 제거합니다.
10. 90초의 재판 간 간격 동안 타이머를 시작합니다.
11. 피험자를 체온 조절 패드 위의 개별 케이지에 다시 넣습니다.
12. 데이터 기록 템플릿에서 해당 위치를 빙빙 돌면서 탈출에 사용된 특정 플랫폼을 기록합니다.
13. 이 기간 동안 이전 실험에서 피험자가 사용한 탈출구를 제거한다.
14. 다음 실험을 위해 템플릿을 열고 피험자가 탈출에 사용되어 이전 실험에서 제거된 모든 플랫폼을 X.
    로 표시합니다. 참고: 후속 시도 전에 누락된 모든 플랫폼을 표시하는 것은 오류 유형(예: 참조 메모리 및/또는 작업 메모리 수정)을 정의하는 데 중요합니다.
15. 후속 평가판을 시작하기 전에 주체 번호, 평가판 번호 및 나머지 플랫폼 위치를 확인하십시오.
16. 90초의 재판 간격이 경과한 후, 피험자를 미로의 벽을 향한 시작 팔에 놓고 다음 재판을 위한 타이머를 시작한다.
17. 시도 2-4에 대해 이 과정을 반복하여 각 시도 후에 도달한 탈출 플랫폼을 제거하고 각 시도 중 및 후에 템플릿을 적절하게 표시합니다(즉, 제거된 플랫폼 위에 X를 배치하고, 팔이 들어갔음을 표시하고, 탈출에 사용된 플랫폼을 동그라
미로 표시).
18. 한 피험자에 대한 네 번의 실험이 모두 완료되면, 탈출 플랫폼을 미로의 적절한 팔에 다시 놓고 다음 피험자에 대해 실험 과정을 반복합니다(실험 단계 4.1-4.17).
19. 그룹 1에 대한 테스트가 완료되면 데이터 기록 시트를 해당 테스트 날짜(예: 1일차)의 폴더로 내보내고 파일 스토리지 시스템에 저장합니다.
    참고: 데이터 손실 가능성을 최소화하기 위해 다음 테스트 그룹을 시작하기 전에 데이터 기록 시트를 내보내야 합니다.
20. 각 그룹에 대해 반복합니다(테스트 단계 2.1-4.19).

5. 종속 변수

1. 각 시도에 대해 이전에 플랫폼이 있었던 모든 부문에 대한 첫 번째 및 반복 입력 수를 계산합니다. 이는 데이터 기록 시트의 플랫폼 위에 X로 표시됩니다. 다음은 작업 메모리 수정 오류입니다.
   참고: 작업 메모리 수정 오류는 탈출에 이미 사용된 플랫폼의 위치를 기억하고 해당 암을 피하는 데 의존하기 때문에 첫 번째 시도에서 작업 메모리 수정 오류가 발생할 수 없습니다.
2. 각 시도에 대해 데이터 기록 시트에서 플랫폼을 포함하지 않은 모든 부문에 대한 첫 번째 항목 수를 계산합니다. 이는 참조 메모리 오류입니다.
3. 각 시도에 대해 데이터 기록 시트에서 플랫폼을 포함하지 않은 모든 부문에 대한 반복 항목 수를 계산합니다. 이는 작업 메모리 잘못된 오류입니다.
4. 각 평가판에 대해 플랫폼에 도달하기 위한 대기 시간을 기록합니다.

결과

본 연구실의 샘플 데이터에 따르면, 테스트 11일 차에 HI 동물이 sham 군에 비해 작업 기억 오답률이 유의하게 더 높게 나타났습니다(t = 2.124, p<0.05, 그림 3A 참조). 또한 HI 동물은 테스트 11일 차에 sham 피험자에 비해 참조 기억 오류가 유의하게 더 많이 나타났습니다(t = 2.303, p<0.05, 그림 3B 참조). 작업 기억 오답 및 참조 오류는 11일 차에 각 피험자가 수행한 4회 시행 전체의 누적 오류 총합을 포함합니다. 이러한 결과는 신생아 뇌 손상 모델에서 작업 및 참조 기억을 평가하는 이 과제의 타당성을 뒷받침하며, 다른 신경행동 병리 모델을 평가하기 위해 이 패러다임을 사용하는 것을 더욱 지지합니다.

토론

8팔 방사형 물 미로 패러다임은 신생아 뇌 손상^5-7,18-20이 있거나 없는 쥐의 작업 및 참조 기억 성능을 평가하기 위해 우리 연구실과 다른 사람들에 의해 성공적으로 활용되었습니다. 현재 패러다임에서 각 시도 후 탈출 플랫폼을 제거하면 후속 시도에서 작업 기억 요구량이 증가합니다(피험자는 탈출 옵션이 더 적습니다). 따라서 4번의 시도에서는 하나의 플랫폼만 남아 있고 작업 기억 요구가 가장 높아 동물이 이전에 방문한 팔에 다시 들어갈 확률이 높아집니다(작업 기억 오류). 이스케이프 암은 테스트 기간 내내 일정하게 유지되기 때문에 플랫폼이 포함되지 않은 암에 첫 번째 항목을 기록하여 참조 메모리를 쉽게 분석할 수 있습니다. 이 패러다임의 다른 중요한 이점으로는 식량 부족에 대한 요구 사항이 없고, 잠재적인 교란 냄새 신호의 위험이 적으며, 전통적인 육상 미로^5-7,18-20과 달리 사전 훈련이 필요하지 않습니다.

테스트 기간(일수)과 관련...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
플라스틱 욕조	Gototanks	http://www.gototanks.com ARM-19455	크기는 테스트 된 종 또는 개별 실험실의 요구에 따라 달라질 수 있습니다.
iPad 또는 기타 디지털 태블릿	Apple Inc.	N/A	http://www.apple.com
저명성 또는 기타 메모 작성 응용 프로그램	Gingerlabs	해당 없음	http://www.gingerlabs.com 디지털 pdf 작성기 또는 메모 프로그램
디지털 타이머	모든	N/A
Deltaphase 등온 가열 패드	Braintree Scientific	ASS7D	http://www.braintreesci.com/
스테인리스 집에서 제작 된 강철 미로		N / A