셀룰로솜은 셀룰로오스를 소화하도록 설계된 다효소 복합체입니다. AFM 기반 SMFS는 셀룰로솜 관련 단백질 어셈블리의 기계적 특성과 접힘 구성을 연구하는 데 사용되었습니다. 우리는 셀룰로솜 조립에 관여하는 개별 수용체-리간드 복합체의 상호 작용을 연구하기 위해 단백질 고정화, 데이터 수집 및 데이터 분석을 위한 완전한 워크플로우를 제시합니다.
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방법 논문
AFM 기반 Single-molecule Force Spectroscopy를 사용한 셀룰로솜의 수용체-리간드 시스템 조사
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
셀룰로솜은 혐기성 박테리아와 곰팡이의 하위 집합이 리그노셀룰로오스 기질을 소화하는 데 사용하는 개별 다효소 복합체입니다. 비촉매 스캐폴드 단백질에 대한 효소의 조립은 상호 작용하는 코헤신 및 도커인 모듈을 포함하는 관련 수용체-리간드 쌍 제품군 간의 상호 작용에 의해 지시됩니다. 코헤신(cohesin)과 도커린(dockerin) 모듈 사이의 매우 강력한 결합으로 인해 낮은 피코몰에서 나노몰 범위의 해리 상수가 발생하며, 이는 기존의 벌크 방법으로는 정확한 오프레이트 측정을 방해할 수 있습니다. 원자력 현미경을 사용한 단일분자 힘 분광법(SMFS)은 힘에 대한 개별 생체 분자의 반응을 측정하며, 다른 단일 분자 조작 방법(예: 광학 핀셋)과 달리 고하중 영역(>120 pN)을 조사할 수 있는 능력으로 인해 고친화성 수용체-리간드 상호 작용을 연구하는 데 최적입니다. 여기에서는 단일 분자 수준에서 셀룰로솜 단백질 어셈블리를 연구하기 위한 완전한 프로토콜을 제시합니다. 천연 셀룰로솜에서 파생된 단백질 토폴로지를 사용하여 효소-도커인 및 탄수화물 결합 모듈-코헤신(CBM-코헤신) 융합 단백질을 사용했으며, 각각은 엔지니어링된 시스테인 잔기에서 접근 가능한 유리 티올 그룹을 가지고 있습니다. 우리는 high-affinity complex에 대한 자세한 결합 매개변수를 얻기 위한 측정 및 데이터 분석 절차와 함께 부위별 표면 고정화 프로토콜을 제시합니다. 우리는 단일 하위 도메인 전개력, 복잡한 파열력, 운동 오프 레이트 및 결합 웰의 잠재적 너비를 정량화하는 방법을 보여줍니다. 다중영역 셀룰로분해 복합체의 조립을 담당하는 코헤신-도커인 상호작용을 특성화하는 데 있어 이러한 방법의 성공적인 적용이 자세히 설명됩니다.
서론
셀룰로솜은 혐기성 셀룰로분해 박테리아(예: C. 열세포)의 표면에 표시되는 큰 다효소 복합체로, 식물 세포벽 리그노셀룰로오스를 용해성 올리고당으로 효율적으로 해중합하도록 진화했습니다1. 셀룰로솜의 핵심 속성은 친화도가 높은 코헤신-도커인 상호 작용입니다. 가장 두드러진 패러다임에서, 고도로 보존된 60-75 아미노산 유형 I 도커인 모듈이 다양한 박테리아 효소의 C 말단 말단에 표시됩니다. dockerin 모듈은 효소의 시너지 조합 어셈블리를 비촉매 스캐폴드 단백질('스캐폴딘')로 지시하며, 이 단백질은 유형 I 도커인 모듈에 특이적인 응집체 도메인의 폴리단백질을 구성합니다. 더 높은 수준에서, 셀룰로솜 구조는 매우 복잡해질 수 있으며, 구조를 세포 표면에 고정하고 여러 골격을 포함하는 분지 구조의 조립을 허용하는 대체 응집체 및 도커인 쌍(예: 유형 II, 유형 III)을 통합합니다2. 다양한 코헤신-도커인 유형은 관련 구조를 가지고 있음에도 불구하고 의도하지 않은 스캐폴딘 또는 다른 셀룰로솜 생성 박테리아 종의 성분과의 교차 반응을 억제하는 차등 결합 특이성을 나타냅니다. 생물정보학 접근법은 유전자 수준에서 수천 개의 고유한 셀룰로솜 구성 요소를 성공적으로 식별했지만 단백질 구조는 비교적 적게 알려져 ....
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프로토콜
cohesin-dockerin 상호작용을 탐색하기 위해 본 연구에서 사용한 당기기 기하 구조의 모식도가 그림 1A에 나타나 있습니다. 캔틸레버 및 커버 글라스 기능화를 위해 여기에 보고된 단백질 고정 프로토콜은 이전에 발표된 절차27를 수정한 버전입니다. 단백질은 일반적인 방법을 사용하여 E. coli의 플라스미드 벡터로부터 발현되었습니다. 단백질은 용매 접근 가능 thiol 그룹을 갖도록 설계되었으며, 이는 maleimide 화학과 결합하여 안정적인 thioether 결합을 통해 커버 글라스 표면과 캔틸레버에 단백질을 연결하는 데 사용되었습니다. CBM-cohesin 및 xylanase-dockerin 융합 단백질 모두에 설계된 cysteine 잔기는 cohesin-dockerin 결합 인터페이스에서 떨어진 단백질의 N-말단 쪽에 위치하였습니다11. 단백질 고정에 채택된 화학적 결합에 대한 상세한 개요는 그림 1B에 나타나 있습니다.
1. 시료 준비
- 완충액
- 칼슘이 첨가된 Tris 완충 식염수(TBS)를 준비합니다: 25 mM TRIS, 75 mM NaCl....
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결과
우리는 C. thermocellum 유래의 type I cohesin-dockerin 쌍을 조사하기 위해 기술된 절차를 사용하였습니다. cohesin-dockerin 쌍이 성공적으로 결합함에 따라, 기록된 힘-거리 트레이스(force distance traces)에서 특징적인 피크 패턴이 나타났습니다. 전형적인 트레이스는 그림 4a에 표시되어 있습니다. 트레이스의 각 피크는 하나의 단백질 서브도메인의 언폴딩(unfolding)을 나타내며, 마지막 피크는 수용체-리간드 복합체의 해리를 의미합니다.
본 연구에서 조사한 CBM-cohesin-dockerin-xylanase 복합체의 경우, 초기 힘의 상승은 PEG 링커 분자의 신장에 해당합니다. 이후 최대 3회까지 나타나는 일련의 하강 힘 강하(force dips)는 xylanase 도메인의 언폴딩(unfolding)을 반영합니다. 마지막 피크는 cohesin-dockerin 결합 인터페이.......
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토론
단일 분자 힘 분광법 실험에서 의미 있는 데이터를 얻으려면 잘 정의되고 재현 가능한 당김 형상을 달성하는 것이 중요합니다. 여기에 사용된 프로토콜은 정의된 당김 형상에서 단백질 복합체의 부위 특이적 고정화를 초래합니다.
이 연구에 사용된 캔틸레버는 물에서 힘 민감도와 높은 공진 주파수 때문에 선택되었습니다. 또한, 약 10nm의 작은 팁 곡률은 다중 상호 작용의 가능성이 감소하기 때문에 단일 분자 실험에 유리합니다. 그러나 캔틸레버 암의 작은 설치 공간(38x16μm2)은 광학 편향 방법(29)을 사용할 때 레이저 빔의 조정을 복잡하게 만듭니다. 이 연구에 사용된 설정에서 집중된 레이저 빔의 직경은 캔틸레버의 너비와 비슷합니다. 결과적으로 일정한 합계 신호를 얻는 것이 어려울 수 있습니다. 캔틸레버의 레이저 드리프트는 우리가 설명한 것처럼 역광학 레버 감도를 수정하기 위해 데이터 곡선 전체의 노이즈 분석을 사용하여 부분적으로 보상할 수 있습.......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
저자는 유럽 연구 위원회(European Research Council)가 헤르만 가우브(Hermann Gaub)에게 준 고급 보조금의 자금 지원을 인정한다. 마이클 A. 내쉬(Michael A. Nash)는 브랑코 바이스 펠로우십 프로그램인 소사이어티(Society in Science)의 자금 지원에 감사를 표합니다. 저자들은 이 연구에 사용된 단백질을 관대하게 제공한 와이즈만 과학연구소(Weizmann Institute of Science)의 에드워드 A. 바이어(Edward A. Bayer), 요아브 바락(Yoav Barak), 다니엘 B. 프리드(Daniel B. Fried)에게 감사를 표한다. 저자는 도움이 되는 토론을 해준 Hermann E. Gaub, Elias M. Puchner, Stefan W. Stahl에게 감사를 표합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 3-Aminopropyl dimethyl ethoxysilane | ABCR GmbH | AB110423 | |
| 5 kDa NHS-PEG-maleimide | Rapp Polymer | 13 5000-65-35 | |
| TCEP 디설파이드 환원 겔 | Thermo Scientific, Pierce | 77712 | www.thermoscientific.com/pierce |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | |||
| BioLever 미니 질화규소 캔틸레버 | Olympus | BL-AC40TS-C2 | 소프트 배치 |
| XYZ 압전 액추에이터 | Physik Instrumente GmbH | ||
| 적외선 " 광범위한 스펙트럼" IR 레이저 | Superlum | ||
| MFP-3D AFM 컨트롤러 | 망명 연구 | ||
| 이고르 프로 6.31 | 웨이브 메트릭 | 데이터 수집 및 분석 | |
| 염화나트륨 | |||
| 염화칼슘 pH 측정기 | |||
| 붕산나트륨 | |||
| 핀셋 | |||
| 커버 안경 | Thermo Scientific, Menzel-Glä ser | 직경 24mm, 두께 0.5mm, | |
| PTFE 샘플 홀더 | 맞춤형 | ||
| 초음파 발생기 욕조 | |||
| 에탄올 | 분석 순도 | ||
| , 황산(농축), | 분석 순도 | ||
| , 과산화수소(30%) | , 분석 순도 | ||
| 오비탈 셰이커 | |||
| 톨루엔 | 분석 순도 | ||
| 필터 페이퍼 | |||
| 유리 슬라이드 | |||
| 마이크로 튜브 | |||
| 마이크로 피펫 | |||
| 원심 분리기 | 마이크로 튜브 | ||
| 회전자 | |||
| 페트리 접시 | |||
| 비커 | |||
| 광학 현미경 |
참고문헌
- Bayer, E. A., Belaich, J. P., Shoham, Y., Lamed, R. The cellulosomes: Multienzyme machines for degradation of plant cell wall polysaccharides. Annu. Rev. Microbiol. 58, 521-554 (2004).
- Bayer, E. A., Lamed, R., White, B. A., Flint, H. J. From Cellulosomes to Cellulosomics. Chem. ....
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재인쇄 및 허가
