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방법 논문

AFM 기반 Single-molecule Force Spectroscopy를 사용한 셀룰로솜의 수용체-리간드 시스템 조사

7.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/50950

⸱

2013년 12월 20일

 ,  ,  , 
1Lehrstuhl für Angewandte Physik and Center for Nanoscience, Ludwig-Maximilians-Universität

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

셀룰로솜은 셀룰로오스를 소화하도록 설계된 다효소 복합체입니다. AFM 기반 SMFS는 셀룰로솜 관련 단백질 어셈블리의 기계적 특성과 접힘 구성을 연구하는 데 사용되었습니다. 우리는 셀룰로솜 조립에 관여하는 개별 수용체-리간드 복합체의 상호 작용을 연구하기 위해 단백질 고정화, 데이터 수집 및 데이터 분석을 위한 완전한 워크플로우를 제시합니다.

초록

셀룰로솜은 혐기성 박테리아와 곰팡이의 하위 집합이 리그노셀룰로오스 기질을 소화하는 데 사용하는 개별 다효소 복합체입니다. 비촉매 스캐폴드 단백질에 대한 효소의 조립은 상호 작용하는 코헤신 및 도커인 모듈을 포함하는 관련 수용체-리간드 쌍 제품군 간의 상호 작용에 의해 지시됩니다. 코헤신(cohesin)과 도커린(dockerin) 모듈 사이의 매우 강력한 결합으로 인해 낮은 피코몰에서 나노몰 범위의 해리 상수가 발생하며, 이는 기존의 벌크 방법으로는 정확한 오프레이트 측정을 방해할 수 있습니다. 원자력 현미경을 사용한 단일분자 힘 분광법(SMFS)은 힘에 대한 개별 생체 분자의 반응을 측정하며, 다른 단일 분자 조작 방법(예: 광학 핀셋)과 달리 고하중 영역(>120 pN)을 조사할 수 있는 능력으로 인해 고친화성 수용체-리간드 상호 작용을 연구하는 데 최적입니다. 여기에서는 단일 분자 수준에서 셀룰로솜 단백질 어셈블리를 연구하기 위한 완전한 프로토콜을 제시합니다. 천연 셀룰로솜에서 파생된 단백질 토폴로지를 사용하여 효소-도커인 및 탄수화물 결합 모듈-코헤신(CBM-코헤신) 융합 단백질을 사용했으며, 각각은 엔지니어링된 시스테인 잔기에서 접근 가능한 유리 티올 그룹을 가지고 있습니다. 우리는 high-affinity complex에 대한 자세한 결합 매개변수를 얻기 위한 측정 및 데이터 분석 절차와 함께 부위별 표면 고정화 프로토콜을 제시합니다. 우리는 단일 하위 도메인 전개력, 복잡한 파열력, 운동 오프 레이트 및 결합 웰의 잠재적 너비를 정량화하는 방법을 보여줍니다. 다중영역 셀룰로분해 복합체의 조립을 담당하는 코헤신-도커인 상호작용을 특성화하는 데 있어 이러한 방법의 성공적인 적용이 자세히 설명됩니다.

서론

셀룰로솜은 혐기성 셀룰로분해 박테리아(예: C. 열세포)의 표면에 표시되는 큰 다효소 복합체로, 식물 세포벽 리그노셀룰로오스를 용해성 올리고당으로 효율적으로 해중합하도록 진화했습니다1. 셀룰로솜의 핵심 속성은 친화도가 높은 코헤신-도커인 상호 작용입니다. 가장 두드러진 패러다임에서, 고도로 보존된 60-75 아미노산 유형 I 도커인 모듈이 다양한 박테리아 효소의 C 말단 말단에 표시됩니다. dockerin 모듈은 효소의 시너지 조합 어셈블리를 비촉매 스캐폴드 단백질('스캐폴딘')로 지시하며, 이 단백질은 유형 I 도커인 모듈에 특이적인 응집체 도메인의 폴리단백질을 구성합니다. 더 높은 수준에서, 셀룰로솜 구조는 매우 복잡해질 수 있으며, 구조를 세포 표면에 고정하고 여러 골격을 포함하는 분지 구조의 조립을 허용하는 대체 응집체 및 도커인 쌍(예: 유형 II, 유형 III)을 통합합니다2. 다양한 코헤신-도커인 유형은 관련 구조를 가지고 있음에도 불구하고 의도하지 않은 스캐폴딘 또는 다른 셀룰로솜 생성 박테리아 종의 성분과의 교차 반응을 억제하는 차등 결합 특이성을 나타냅니다. 생물정보학 접근법은 유전자 수준에서 수천 개의 고유한 셀룰로솜 구성 요소를 성공적으로 식별했지만 단백질 구조는 비교적 적게 알려져 있으며 코헤신-도커인 특이성 결정에 작용하는 메커니즘은 구조 생물학 연구의 활발한 영역으로 남아 있습니다.

Binnig et al.에 의해 원자력 현미경(AFM)이 발명된 이후.3, 비접촉 이미징, 진동 모드 이미징4 및 단일 분자 힘 분광법(SMFS)5,6을 포함하여 다양한 AFM 작동 모드가 개발되고 지속적으로 개선되었습니다. SMFS는 개별 단백질7-11, 핵산12-15 및 합성 고분자16-19를 직접 조사하는 데 널리 사용되는 기술로 발전했습니다. 수용체-리간드 결합20,21을 조사하기 위한 일반적인 SMFS 실험에서 AFM 캔틸레버 팁은 결합 파트너 중 하나로 수정되는 반면 평평한 유리 표면은 상보적 결합 파트너로 수정됩니다. 수정된 캔틸레버는 표면과 접촉하여 파트너가 바인딩할 수 있도록 합니다. 그런 다음 캔틸레버의 바닥을 일정한 속도로 빼내고 광학 레버 편향 방법을 사용하여 힘을 측정합니다. 결과 힘-거리 데이터 추적은 바인딩이 설정된 경우 톱니와 같은 피크를 나타냅니다. 결합 파트너가 여러 단백질 도메인에 융합되는 경우, 힘-거리 추적의 각 피크는 단일 단백질 도메인 또는 접힌 하위 도메인의 풀림과 상관될 수 있으며, 마지막 피크는 단백질 결합 계면의 파열에 해당합니다. 힘 저항 요소의 특정 위치는 관심 있는 다양한 단백질 영역을 식별하기 위한 지문으로 사용할 수 있습니다. 이 방법은 단백질 접힘 및 안정화에 관여하는 중요한 아미노산을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. SMFS 실험에서 관찰된 특징적인 힘 확장 거동을 치료하기 위해 많은 모델이 문헌에 보고되었습니다. 가장 일반적으로 사용되는 모델에는 자유 접합 사슬(FJC) 모델22, 웜 유사 사슬(WLC) 모델18,23-25 및 자유 회전 사슬(FRC) 모델25,26이 포함됩니다.

이전 작업11에서는 단일 분자 힘 분광법을 사용하여 cohesin 및 dockerin 모듈의 상호 작용을 조사했습니다. 여기에서는 enzyme-dockerin 및 CBM-cohesin 단백질 구조를 사용한 유리 표면 및 캔틸레버 기능화를 위한 실험 프로토콜을 제시합니다. 또한 데이터 수집 및 분석 절차를 포함한 AFM 기반 SMFS 프로토콜에 대해서도 설명합니다. 설명된 프로토콜은 다른 분자 시스템으로 쉽게 일반화될 수 있으며, 친화성이 높은 수용체 리간드 쌍에 관심이 있는 연구자에게 특히 유용하다는 것이 입증되어야 합니다.

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프로토콜

cohesin-dockerin 상호작용을 탐색하기 위해 본 연구에서 사용한 당기기 기하 구조의 모식도가 그림 1A에 나타나 있습니다. 캔틸레버 및 커버 글라스 기능화를 위해 여기에 보고된 단백질 고정 프로토콜은 이전에 발표된 절차27를 수정한 버전입니다. 단백질은 일반적인 방법을 사용하여 E. coli의 플라스미드 벡터로부터 발현되었습니다. 단백질은 용매 접근 가능 thiol 그룹을 갖도록 설계되었으며, 이는 maleimide 화학과 결합하여 안정적인 thioether 결합을 통해 커버 글라스 표면과 캔틸레버에 단백질을 연결하는 데 사용되었습니다. CBM-cohesin 및 xylanase-dockerin 융합 단백질 모두에 설계된 cysteine 잔기는 cohesin-dockerin 결합 인터페이스에서 떨어진 단백질의 N-말단 쪽에 위치하였습니다11. 단백질 고정에 채택된 화학적 결합에 대한 상세한 개요는 그림 1B에 나타나 있습니다.

1. 시료 준비

  1. 완충액
    1. 칼슘이 첨가된 Tris 완충 식염수(TBS)를 준비합니다: 25 mM TRIS, 75 mM NaCl, 1 mM CaCl2, pH 7.2
    2. 붕산나트륨 완충액을 준비합니다: 50 mM Na2B4O7, pH 8.5
      시료 준비 단계를 보여주는 공정 흐름도는 그림 2에 나와 있습니다.
      캔틸레버와 커버 글라스를 다룰 때는 셀프 락킹 핀셋 사용을 권장합니다.
  2. 커버 글라스의 아미노실란화(약 1.5시간)
    1. 커버 글라스(직경 24 mm, 두께 0.5 mm)를 PTFE 홀더에 놓습니다.
    2. 에탄올 : 초순수 (v/v) 1:1 혼합액에서 커버 글라스를 15분 동안 초음파 처리합니다.
    3. 커버 글라스를 초순수로 헹굽니다.
    4. 피라냐 용액(1:1 H2SO4 (농축액) : H2O2 (30%) (v/v))에 커버 글라스를 30분 동안 담근 후, 초순수로 철저히 헹굽니다. N2 기류 하에서 커버 글라스를 건조합니다. 주의: 피라냐 용액은 부식성이 매우 강하므로 안구 및 피부 보호 장구가 필요합니다.
    5. 에탄올 : 초순수 : 3-아미노프로필 디메틸 에톡시실란 (v/v) 45:5:1 혼합액에 커버 글라스를 침지합니다. 상온(RT)에서 쉐이커 위에 놓고 60분 동안 반응시킵니다(약 50 rpm).
    6. 에탄올과 초순수에 커버 글라스를 순차적으로 침지합니다(각 2회). N2 기류 하에서 커버 글라스를 건조합니다.
    7. 오븐에서 커버 글라스를 가열합니다(80 °C에서 30분).
    8. 실란화된 커버 글라스는 아르곤 가스 하에서 최대 6주 동안 보관할 수 있습니다.
  3. 캔틸레버의 아미노실란화(약 1.5시간)
    참고: 제시된 팁 기능화 프로토콜은 실리콘 캔틸레버 팁에 적합합니다.
    1. 캔틸레버를 깨끗한 유리 슬라이드 위에 놓습니다. UV-오존 처리를 15분 동안 수행합니다.
    2. 촉매량(0.25%, (v/v))의 초순수가 포함된 1:1 에탄올 : 3-아미노프로필 디메틸 에톡시실란 (v/v) 혼합액에 캔틸레버를 3분 동안 침지합니다.
    3. 톨루엔, 에탄올, 초순수가 담긴 비커에서 캔틸레버를 순차적으로 60초 동안 부드럽게 저어 헹굽니다. 세척 단계 사이에 캔틸레버를 거름종이 위에서 조심스럽게 건조합니다.
    4. 레버를 깨끗한 유리 슬라이드 위에 놓고 가열합니다(80 °C에서 30분).
  4. 단백질 이황화 결합 환원(약 3시간)
    모든 용액은 캔틸레버당 약 30 µl, 커버 글라스당 약 20 µl의 희석된 단백질을 얻을 수 있도록 준비해야 합니다. 단백질 용액은 Tris(2-카복시에틸)포스핀(TCEP) 이황화 환원 젤과 1:2 (v/v) 비율로 혼합해야 합니다.
    1. 마이크로 튜브에 TCEP 이황화 환원 비즈를 분주하여 준비합니다. TCEP 비즈 슬러리를 피펫팅할 때는 가위로 마이크로피펫 팁을 잘라 구경을 넓히는 것이 좋습니다.
    2. TCEP 비즈 슬러리를 1 ml TBS 완충액으로 헹구고 850 rcf에서 3분 동안 원심 분리합니다.
    3. 마이크로피펫으로 상층액을 조심스럽게 제거하고 버립니다.
    4. 단계 1.4.2-1.4.3을 2회 반복합니다.
    5. 농축 단백질 용액(1-10 mg/ml)을 TCEP 비즈에 적용(단백질 : TCEP 비즈 슬러리 1:2 (v/v))하고 마이크로피펫 팁으로 부드럽게 저어 혼합합니다. 공기 방울이 생기지 않도록 주의합니다.
    6. 단백질/TCEP 비즈 슬러리 혼합물을 로테이터 위에 놓고 2.5시간 동안 반응시킵니다.
  5. 커버 글라스 및 캔틸레버의 PEG화(약 1.5시간)
    1. NHS-PEG-maleimide 링커로 수식하기 전에, 표면의 1차 아민 그룹을 탈양성자화하기 위해 아미노실란화된 캔틸레버와 커버 글라스를 나트륨 붕산 완충액(pH 8.5)에 45분 동안 담급니다.
    2. 캡을 열고 25 mM 용액에 필요한 양을 측정하기 전에 NHS-PEG-maleimide 분말이 상온(RT)까지 가온되었는지 확인합니다. 사용하지 않은 NHS-PEG-maleimide는 아르곤 가스 하에 -20 °C에서 보관해야 합니다. 캔틸레버당 약 30 µl, 커버 글라스 2장(샌드위치 형태로 겹침)당 90 µl의 폴리머 용액이 필요합니다.
    3. 5 kDa NHS-PEG-maleimide의 무게를 측정한 후, 나트륨 붕산 완충액을 넣고 볼텍싱하여 25 mM 용액을 만듭니다.
      참고: pH 8.5에서 NHS의 반감기가 매우 짧으므로 용액을 가능한 한 빨리 사용해야 합니다. 볼텍싱과 캔틸레버/커버 글라스로의 용액 전송은 1-2분 이내에 완료해야 합니다.
    4. 페트리 접시에서 30 µl의 NHS-PEG-maleimide 용액 방울 속에 캔틸레버를 넣어 배양합니다. 커버 글라스의 경우, 단일 커버 글라스 위에 90 µl의 NHS-PEG-maleimide 용액을 떨어뜨리고 그 위에 두 번째 커버 글라스를 덮어 가운데에 NHS-PEG-maleimide 용액이 들어있는 커버 글라스 샌드위치를 만듭니다.
    5. 상온(RT)의 수포화 분위기에서 캔틸레버/커버 글라스를 NHS-PEG-maleimide 용액과 함께 1시간 동안 배양합니다.
  6. 단백질 접합(약 2시간)
    중요: PEG화된 캔틸레버와 커버 글라스의 공기 노출을 최소화하십시오.
    1. TCEP-비즈/환원 단백질 용액을 100 rcf에서 1분 동안 원심 분리하고 상층액을 수집합니다.
    2. 단백질 용액을 TBS로 희석합니다. 표면 접합 시 단백질 농도가 0.5-2 mg/ml 범위가 되도록 합니다. 캔틸레버와 커버 글라스를 헹구는 동안 환원 및 희석된 단백질 용액을 잠시 둡니다.
    3. 초순수가 담긴 세 개의 비커에서 캔틸레버와 커버 글라스를 순차적으로 헹굽니다.
    4. N2 기류 하에서 커버 글라스의 가장자리를 거름종이에 조심스럽게 접촉시켜 잔류 액체를 제거합니다. 캔틸레버 역시 거름종이에 접촉시켜 잔류 액체를 조심스럽게 제거합니다. 즉시 희석된 단백질 용액을 적용합니다.
    5. AFM 기기와 호환되는 적절한 시료 홀더에 커버 글라스를 장착합니다.
    6. PEG화된 커버 글라스와 캔틸레버를 각각의 희석된 단백질 용액과 함께 상온(RT)에서 1-2시간 동안 배양합니다.
    7. 결합되지 않은 단백질을 제거하기 위해 캔틸레버를 TBS가 담긴 세 개의 비커에서 순차적으로 헹굽니다. 커버 글라스는 피펫을 사용하여 최소 10회 이상 헹굽니다.
    8. 측정 전까지 캔틸레버와 커버 글라스를 TBS 하에 보관합니다.

2. 데이터 획득

본 연구에서는 Asylum Research의 MFP-3D AFM 컨트롤러와 맞춤형으로 작성된 Igor Pro 소프트웨어로 제어되는 자체 제작 AFM28을 사용하였습니다. 캔틸레버의 굴곡은 광학 빔 편향법29을 통해 측정됩니다. 여기서 제공하는 시료 준비 및 데이터 분석 프로토콜은 사용된 AFM 모델에 관계없이 적용 가능합니다. 다만, AFM 모델은 액체 내 측정이 가능해야 하며, z-piezo의 속도 범위를 약 200-5,000 nm/sec 수준으로 조절할 수 있어야 합니다.

  1. 기능화된 캔틸레버와 유리 표면을 AFM에 장착하십시오. 전체 과정 동안 표면은 버퍼로 덮여 있어야 합니다. 캔틸레버를 장착할 때 공기 노출을 최소화하십시오. 레이저 빔을 정확하게 조정한 후, 드리프트 효과를 줄이기 위해 시스템을 최소 30분 동안 평형 상태로 유지하고 필요 시 다시 조정하십시오.
  2. 캔틸레버를 표면에서 멀리 떨어진 상태로 두어 열 잡음 스펙트럼을 기록하십시오. 즉 감쇠 효과가 없는 상태에서.
  3. 측정 전 캔틸레버 팁에 손상을 주지 않고 표면을 찾기 위해 음향 방식과 같은 최소 침습적 방법을 사용하십시오. 가능하다면 캔틸레버를 이용해 수동으로 표면에 접근하며, 헤드폰을 통해 AFM 컨트롤러의 원시 굴곡 출력(raw deflection output)에서 발생하는 열잡음을 청취하십시오. 캔틸레버가 표면에 근접하는 즉시 소리가 뚜렷하게 변하는 것을 들을 수 있습니다.
    참고: 이제 캔틸레버 팁은 2- 이내에 위치해야 합니다.5 µm 표면의. 소리 변화의 특성은 사용된 캔틸레버에 따라 달라집니다. 본 연구에서 사용된 캔틸레버의 공진 주파수는 수중에서 약 25 kHz로, 인간의 가청 범위 위에 있습니다. 표면 근처에서의 감쇠 효과로 인해 공진이 더 낮은 주파수 쪽으로 이동하며, 이로 인해 캔틸레버 공진이 가청 범위 내로 들어오게 됩니다. 따라서 주파수와 소리 강도가 겉보기에 증가하는 것으로 인지됩니다.
    편향 신호(deflection signal)의 오디오 출력을 사용할 수 없는 경우, 편향 신호에 대한 능동 피드백(active feedback)을 활성화한 상태에서 z-피에조(z-piezo)를 이용해 표면에 접근할 수 있습니다. 표면의 압입으로 인해 편향 신호가 정해진 양만큼 증가하는 즉시 접근이 중단됩니다.
  4. 볼트 편향 신호당 팁 변위 거리(nm)를 나타내는 역 광학 레버 민감도(InvOLS)를 결정하십시오. 캔틸레버 팁으로 표면을 압입하여 이를 수행합니다. 캔틸레버 팁 변위 약 3 nm에 해당하는 편향 설정점 전압을 권장합니다.
  5. 에너지 등분배 정리에 따라 열 잡음 스펙트럼에 단순 조화 진동자 응답 함수를 피팅하여 캔틸레버의 용수철 상수를 결정하십시오.30,31.
  6. 실험 루틴을 초기화하십시오. 본 연구에서는 다음과 같은 측정 파라미터 세트가 사용되었습니다: 접근 속도: 3,000 nm/sec; 압입 힘: 180 pN; 표면 체류 시간: 10 msec; 후퇴 속도: 0.2, 0.7, 2.0, 5.0 µm/sec 샘플링 속도는 각각 2,000, 5,000, 15,000, 20,000 Hz이며, 후퇴 거리는 500 nm입니다.
    참고: 오버샘플링을 방지하고 데이터 크기를 적절하게 유지하기 위해 샘플링 속도를 10 points/nm보다 높게 설정해서는 안 됩니다.
  7. 각 힘-거리 추적(force-distance trace) 후에 x축 및 y축 피에조 스테이지를 작동시켜, 매 힘-거리 곡선마다 캔틸레버가 새로운 표면 위치에 노출되도록 합니다. 이 기술은 장기 측정 시 커버 글라스 표면의 더 넓은 영역을 샘플링할 수 있게 합니다.
  8. 편향 스테이지(deflection stage)를 주기적으로 영점 조절(rezeroing)하여즉 (포토다이오드 위치) 및 편향 신호가 범위를 벗어나거나 표면과의 접촉이 끊어지는 경우, 장기 측정 중 z-피에조 섀시의 높이.
  9. 측정 런을 완료한 후, 이전 측정 시 사용했던 것보다 상당히 더 높은 압입력을 가하여 InvOLS 측정을 다시 수행함으로써 더욱 정밀한 InvOLS 값을 얻으십시오.
  10. 표면에서 멀리 떨어진 곳에서 열 잡음 스펙트럼을 추가로 기록하십시오. 실험 과정의 마지막 단계에서 용수철 상수를 결정하십시오.

3. 데이터 분석

그림 3의 흐름도는 데이터 분석 과정을 보여줍니다. Igor Pro 또는 MATLAB과 같은 적절한 소프트웨어 패키지를 사용하여 모든 데이터 조작을 수행하십시오. 먼저 검출기에서 얻은 원신호를 힘의 단위로 변환하고, 오프셋과 드리프트를 보정합니다. 이어서, 생분자 탄성 모델을 사용하여 언폴딩 경로의 에너지 장벽 위치를 찾고 단백질 하위 도메인을 식별합니다. 마지막으로, 수용체-리간드 상호작용의 속도론적 및 에너지 매개변수를 얻습니다.

  1. 단위 변환 및 데이터 보정
    1. 검출기 전압을 힘의 단위로 변환하려면 원시 굴절 신호(V)에 InvOLS(nm/V)와 용수철 상수(pN/nm)를 곱하십시오.
    2. 먼저 힘-거리 트레이스의 마지막 10% 영역(표면에서 가장 멀리 떨어진 지점에서 획득한 영역)의 힘 값들을 평균한 뒤, 해당 평균값을 데이터 트레이스의 모든 힘 값에서 빼줌으로써 부하가 걸리지 않은 캔틸레버의 힘 값이 0 pN이 되도록 데이터를 오프셋하십시오.
    3. 각 트레이스의 x방향 오프셋을 조정하여, 거리 축과의 첫 번째 교점이 0 nm 거리에서 나타나도록 하십시오.
    4. InvOLS는 캔틸레버 상의 레이저 스폿 위치에 따라 달라집니다. 캔틸레버의 풋프린트가 레이저 스폿 크기와 비슷할 경우, 광학 판독 시스템에서 발생하는 아주 적은 양의 드리프트만으로도 InvOLS에 눈에 띄는 변화가 생길 수 있습니다. 이는 제로 포스(zero force) 상태에서 굴곡 신호의 노이즈를 분석함으로써 보정할 수 있습니다. 주변 조건이 일정하다고 가정할 때, 굴곡 신호의 노이즈는 InvOLS에 정비례합니다.
      1. 각 힘-거리 곡선(force-distance trace)의 마지막 10% 구간에서 루트 평균 제곱(RMS) 편차 값(영력 상태에서의 노이즈 수준)을 측정하십시오.
      2. 노이즈 대 곡선 번호를 그래프로 나타내고 적절한 피팅을 적용하십시오. 일반적으로 다음과 같은 형태의 지수 피팅을 사용합니다. Exponential decay formula, N(n_i)=N_0 * e^(-kn_i), mathematical representation. N은 노이즈, ni는 곡선 번호, N0와 k는 피팅 매개변수일 때 가장 효과적일 것입니다. 특정 데이터 세트의 경우 선형 피팅이 적절할 수도 있습니다.
      3. 각 곡선에 대한 스케일링 인자(scaling factor, SF)를 결정하십시오.

        식 1:
        static equilibrium equation; (SF)=(N₀e^(-knᵢ)+C)/(N₀e^(-knₓ)+C); mathematical formula
        여기서 ni는 곡선 번호, nf는 최종 곡선 번호, C는 오프셋이다.
      4. 다음으로 각 개별 곡선의 모든 힘 값을 스케일링 인자로 나눕니다. 이 절차는 현재 곡선의 RMS 노이즈 값과 InvOLS 측정 직전에 획득한 최종 트레이스의 RMS 노이즈 값의 비율로 각 곡선을 스케일링합니다.
      5. 거리 축(z)을 분자 신장(z*)으로 변환하기 위해 굴절 보정을 수행하십시오. 이는 힘에 의해 캔틸레버가 휘어짐으로써 z-피에조 센서 위치에서 보고된 값보다 캔틸레버 팁과 시료 사이의 거리가 짧아지는 현상을 보정하기 위한 것입니다.

        식 2:
        Static equilibrium equation, z* = z - F/k, formula; physics calculations, force analysis
        어디에 z 측정된 z-센서 위치이며, F 캔틸레버에 작용하는 힘과 k 용수철 상수
  2. 윤곽 길이 분석
    단백질의 컨투어 길이(contour length)는 폴리펩타이드 사슬이 최대로 신장되었을 때의 길이를 의미합니다. 단백질의 접힘 상태(folding state)는 2차 및 3차 구조에 의해 결정되는 기하학적 구조와 양 끝단 사이의 거리를 나타냅니다. 단백질의 컨투어 길이는 해당 단백질의 접힘 상태와 직접적인 연관이 있습니다.9,25,32힘-신장 곡선(force-extension traces)에서 특정 파단 지점의 위치는 PEG 링커의 다분산성과 더불어 온도, 버퍼 특성 및 가력 속도와 같은 외부 변수로 인해 크게 다양하게 나타납니다. 이는 직접적인 데이터 분석을 어렵게 하지만, 힘-신장 데이터를 등고선 길이(contour length) 공간으로 변환함으로써 해결할 수 있습니다. 이 기술을 통해 방대한 데이터셋에 대한 평균화가 가능하며, 자동 패턴 인식 기능을 사용하여 특징적인 언폴딩(unfolding) 이벤트를 식별할 수 있습니다. 따라서 나타나는 상호작용의 유형에 따라 개별 힘 곡선을 분류하는 것이 가능합니다. 이전에 기술된 다음의 절차는25 힘-신장 데이터를 등고선 길이 공간으로 변환하는 데 사용됩니다.
    1. WLC 모델(식 3) 풀이23 윤곽 길이에 대하여 L 고정된 지속 길이에서 p 식 4의 결과로 윤곽 길이(contour length)가 제공됩니다. L(x,u)여기에서, 입력값이 제공되지 않았습니다. 번역할 텍스트를 입력해 주세요. 거리와 u=F*p/kBT, 여기서 kB 볼츠만 상수를 나타내며 T는 온도를 나타냅니다. 실수해(real solutions)만을 고려할 수 있습니다. 추가 제약 조건은 다음과 같습니다. 제공된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요., F>0, L>0, x>0;

      식 3:
      Force-extension formula, F(x,L), polymer physics equation, illustrates entropic elasticity.

      수식 4:
      Static equilibrium, L(x,u), complex formula, educational diagram, analytical expression interpretation.
      여기서,
      Polynomial function \( g(u) \) equation, mathematical analysis, symbolic computation.
    2. 변환된 데이터 지점들을 힘 대 윤곽 길이(force vs. contour length) 그래프에 표시하십시오. 노이즈를 제거하기 위해 약 10 pN의 힘 임계값을 적용하십시오. 롱패스 길이 필터(long-pass length filter)를 적용하여 비특이적 상호작용을 제외할 수 있습니다. 윤곽 길이의 히스토그램을 작성하십시오.
    3. 상호 상관 분석하다33 획득한 히스토그램을 템플릿 히스토그램과 비교하고, PEG 다분산성을 보정하기 위해 x축을 따라 오프셋을 적용합니다. 결과로 얻은 상관관계 값을 사용하여 개별 데이터 트레이스의 유사성을 측정합니다. 이를 통해 데이터 트레이스를 사전에 정의된 클래스로 분류하여 향후 분석을 단순화할 수 있습니다.
    4. 자기상관(autocorrelation)을 이용해 단일 트레이스 내의 반복되는 특징을 찾는 유사한 기술을 사용하십시오. 예: 다중 Ig 도메인 언폴딩을 위해.
    5. 다른 언폴딩 이벤트를 조사하기 위해 트레이스를 수동으로 분류하십시오.
  3. 하중 속도 분석
    포스 스펙트럼(force spectrum)에 적절한 모델을 적용하여 수용체-리간드 해리(receptor-ligand dissociation)에 관한 키네틱 및 에너지 정보를 추출하십시오. 즉 파단력 대 ln(로딩 속도) 그래프.
    1. 특정 견인 속도에 대하여, 분석 대상이 되는 파단 이벤트의 파단력과 하중 속도를 결정하십시오.
      1. 관심 있는 파열 이벤트 인근의 힘-시간 추적선(force-time trace)에 대해 직선 피팅을 수행하십시오. 피크에 피팅된 직선의 기울기로부터 로딩 속도를 결정하십시오. 관심 있는 파열 이벤트가 나타나는 모든 추적선에 대해 이 절차를 반복하십시오.
      2. 파열력의 히스토그램에 가우시안 피팅을 적용하여 가장 확률이 높은 파열력을 결정하십시오. 다른 피팅 함수를 사용할 수도 있습니다.
      3. 가장 가능성이 높은 로딩 속도를 결정하십시오.
    2. 모든 인장 속도에 대해 단계 3.3.3.1 - 3.3.3.3을 반복하십시오.
    3. 힘 스펙트럼을 얻기 위해 가장 확률 높은 파열력(most probable rupture forces)을 가장 확률 높은 부하 속도(most probable loading rates)의 자연로그에 대해 도식화하십시오.
    4. 포스 스펙트럼에 적절한 이론적 모델을 적용하여 역학 및 에너지 매개변수를 추출합니다 (그림 4C). 많은 경우, 선형 Bell-Evans 모델은20,34 사용 가능하며, ~에 대해 양호한 추정치를 제공할 것입니다 해리 속도 상수(koff), 힘이 없을 때의 해리 속도, 그리고 Dx, 식 5에 표시된 바와 같이, 반응 좌표를 따라 전이 상태까지의 거리.

      식 5:
      static force equation ⟨F⟩, k_B T/Δx, formula analysis for thermal fluctuation experiments

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결과

우리는 C. thermocellum 유래의 type I cohesin-dockerin 쌍을 조사하기 위해 기술된 절차를 사용하였습니다. cohesin-dockerin 쌍이 성공적으로 결합함에 따라, 기록된 힘-거리 트레이스(force distance traces)에서 특징적인 피크 패턴이 나타났습니다. 전형적인 트레이스는 그림 4a에 표시되어 있습니다. 트레이스의 각 피크는 하나의 단백질 서브도메인의 언폴딩(unfolding)을 나타내며, 마지막 피크는 수용체-리간드 복합체의 해리를 의미합니다.

본 연구에서 조사한 CBM-cohesin-dockerin-xylanase 복합체의 경우, 초기 힘의 상승은 PEG 링커 분자의 신장에 해당합니다. 이후 최대 3회까지 나타나는 일련의 하강 힘 강하(force dips)는 xylanase 도메인의 언폴딩(unfolding)을 반영합니다. 마지막 피크는 cohesin-dockerin 결합 인터페이...

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토론

단일 분자 힘 분광법 실험에서 의미 있는 데이터를 얻으려면 잘 정의되고 재현 가능한 당김 형상을 달성하는 것이 중요합니다. 여기에 사용된 프로토콜은 정의된 당김 형상에서 단백질 복합체의 부위 특이적 고정화를 초래합니다.

이 연구에 사용된 캔틸레버는 물에서 힘 민감도와 높은 공진 주파수 때문에 선택되었습니다. 또한, 약 10nm의 작은 팁 곡률은 다중 상호 작용의 가능성이 감소하기 때문에 단일 분자 실험에 유리합니다. 그러나 캔틸레버 암의 작은 설치 공간(38x16μm2)은 광학 편향 방법(29)을 사용할 때 레이저 빔의 조정을 복잡하게 만듭니다. 이 연구에 사용된 설정에서 집중된 레이저 빔의 직경은 캔틸레버의 너비와 비슷합니다. 결과적으로 일정한 합계 신호를 얻는 것이 어려울 수 있습니다. 캔틸레버의 레이저 드리프트는 우리가 설명한 것처럼 역광학 레버 감도를 수정하기 위해 데이터 곡선 전체의 노이즈 분석을 사용하여 부분적으로 보상할 수 있습...

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공개 사항

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

저자는 유럽 연구 위원회(European Research Council)가 헤르만 가우브(Hermann Gaub)에게 준 고급 보조금의 자금 지원을 인정한다. 마이클 A. 내쉬(Michael A. Nash)는 브랑코 바이스 펠로우십 프로그램인 소사이어티(Society in Science)의 자금 지원에 감사를 표합니다. 저자들은 이 연구에 사용된 단백질을 관대하게 제공한 와이즈만 과학연구소(Weizmann Institute of Science)의 에드워드 A. 바이어(Edward A. Bayer), 요아브 바락(Yoav Barak), 다니엘 B. 프리드(Daniel B. Fried)에게 감사를 표한다. 저자는 도움이 되는 토론을 해준 Hermann E. Gaub, Elias M. Puchner, Stefan W. Stahl에게 감사를 표합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
3-Aminopropyl dimethyl ethoxysilaneABCR GmbHAB110423
5 kDa NHS-PEG-maleimideRapp Polymer13 5000-65-35
TCEP 디설파이드 환원 겔Thermo Scientific, Pierce77712www.thermoscientific.com/pierce
Tris(hydroxymethyl)aminomethane
BioLever 미니 질화규소 캔틸레버OlympusBL-AC40TS-C2소프트 배치
XYZ 압전 액추에이터Physik Instrumente GmbH
적외선 " 광범위한 스펙트럼" IR 레이저Superlum
MFP-3D AFM 컨트롤러망명 연구
이고르 프로 6.31웨이브 메트릭데이터 수집 및 분석
염화나트륨
염화칼슘 pH 측정기
붕산나트륨
핀셋
커버 안경Thermo Scientific, Menzel-Glä ser직경 24mm, 두께 0.5mm,
PTFE 샘플 홀더맞춤형
초음파 발생기 욕조
에탄올분석 순도
, 황산(농축),분석 순도
, 과산화수소(30%), 분석 순도
오비탈 셰이커
톨루엔분석 순도
필터 페이퍼
유리 슬라이드
마이크로 튜브
마이크로 피펫
원심 분리기마이크로 튜브
회전자
페트리 접시
비커
광학 현미경
염화칼슘 , , , ,

참고문헌

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