Method Article

림프절 기질 세포 기원 연구를 위한 림프절 지방 패드 키메라의 생성

DOI:

10.3791/50952

⸱

December 16th, 2013

 , 
1School of Immunity and Infection, IBR-MRC Centre for Immune Regulation, College of Medical and Dental Sciences, University of Birmingham, 2Centre for Cardiovascular Sciences, University of Edinburgh

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

림프절 기질 세포 기원 연구를 위한 림프절/지방 패드 키메라의 생성이 설명됩니다. 이 방법은 신생아 마우스와 배아 지방 패드에서 림프절을 분리하고, 키메라 림프절 지방 패드를 생성하고, 숙주 마우스의 신장 캡슐 아래로 림프절을 옮기

는 것입니다.

Abstract

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기질은 림프절 구조와 기능의 핵심 구성 요소입니다. 그러나 그 기원, 정확한 세포 구성 및 그 형성을 지배하는 메커니즘에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 림프절은 항상 지방 조직에 캡슐화되어 있으며, 우리는 최근에 림프절 기질의 형성에 대한 이러한 관계의 중요성을 입증했습니다. 지방세포 전구세포는 발달 과정에서 림프절로 이동하며, 림프세포(Lymphotoxin-b) 수용체가 관여하면 지방형성을 끄고 지방형성을 차단하고 림프구 기질세포(lymphoid stromal cell)로 분화한다(Bénézech et al.14). 지방 조직의 림프구 기질 전위를 기반으로 림프절 기질 세포 전구체의 계통 추적을 가능하게 하는 림프절/지방 패드 키메라를 사용하는 방법을 제시합니다. 신생아 림프절과 EYFP+ 배아 지방 조직을 분리하고 LN/EYFP+ 지방 패드 키메라를 만드는 방법을 보여줍니다. 숙주 마우스의 신장 캡슐 아래로 이식된 후, 림프절은 국소 지방 조직 전구 세포를 통합하고 형성을 마칩니다. 생성된 림프절에서 EYFP+ 지방 패드 세포의 자손 분석은 효소로 분해된 림프절의 유세포 분석 또는 림프절 동결절편의 면역형광 분석을 통해 수행할 수 있습니다. 다양한 knockout 마우스 모델의 지방 패드를 사용함으로써, 이 방법은 다양한 림프절 기질 세포 집단의 기원을 분석하는 효율적인 방법을 제공할 것입니다.

Introduction

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림프절(LN)은 림프 혈관 구조망을 따라 신체의 전략적 위치에 위치한 면역 체계의 핵심 기관입니다. 그들은 항원과 병원체의 여과를 가능하게 하고 림프구에 항원을 제시하고 적응 면역 반응을 유도할 수 있는 장소를 제공합니다. LN의 기본 구조를 형성하고 적응 면역 반응의 다양한 조혈 참가자의 움직임을 조율하는 기질은 이러한 기관의 기능에 중심적인 역할을 합니다. 기질 세포의 다양한 집단은 면역 체계의 조혈 구성 요소의 이동, 국소화, 생존, 증식 및 성숙에 대한 필수적이고 구체적인 단서를 제공합니다1-3. 성인 LN 기질 세포는 혈액 내피 세포, 림프 내피 세포 및 섬유아세포의 세 가지 범주로 나뉩니다. 이 세 가지 범주는 이질적인 인구를 포함합니다. 섬유아세포 집단은 섬유아세포 망상 세포(FRC), 여포 수지상 세포(FDC), 변연 망상 세포(MRC)를 포함하는 반면, 캡슐을 형성하는 섬유아세포, 수질 및 아직 확인되지 않은 기타 세포1-5를 포함합니다. 서로 다른 LN 기질 세포 집단의 성숙을 지배하는 기원과 메커니즘은 불분명하며, 특정 LN 기질 세포 집단의 운명 매핑을 가능하게 하는 특정 마커가 없기 때문에 연구가 특히 어렵습니다. 그러나 LN 기질 세포의 개체발생에 대한 완전한 이해는 적응 면역 반응, 내성에 기여하는 메커니즘의 이해를 위해 필요....

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Protocol

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마우스는 영국 내무부 및 지역 윤리 위원회 규정에 따라 버밍엄 대학의 생물 의학 서비스 부서에서 SPF 조건으로 사육 및 유지되었습니다. 이 프로토콜에 설명된 모든 절차는 지역 윤리 위원회와 내무부에서 승인한 프로젝트 라이선스에 따라 적용됩니다.

1. 신생아 LN의 격리

  1. 갓 태어난 쥐를 경추 탈구로 희생시킵니다.
  2. 머리를 절개하고 흉부 위쪽에서 복부 아래쪽까지 가위로 몸을 열고 복강에서 모든 내장(심장, 폐, 간, 장, 신장, 방광)을 조심스럽게 제거합니다.
  3. RF10 배지(10% 소 태아 혈청, 100U/ml 페니실린, 100mg/ml 스트렙토마이신 및 2mM L-글루타민이 보충된 RPMI1640 배지)가 포함된 90mm 페트리 접시에 시신을 옮깁니다. 이 단계부터 조직은 멸균 상태로 유지되고 조직 배양 후드에서 처리됩니다.
  4. RF90이 들어있는 새로운 10mm 페트리 접시로 본체를 옮깁니다.
  5. 해부 현미경으로 서혜부 피부에서 복막을 조심스럽게 분리합니다. 서혜부 LN은 지방 패드에 있는 세 개의 혈관이 교차하는 지점에 위치합니다.
  6. LN을 조심스럽게 제거합니다. 모든 지방 조직이 제거되었는지 확인하십시오. LN을 RF10 매체가 들어 있는....

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Results

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이식 후 3주가 지나면 LN/지방 패드 키메라가 신장에서 회수됩니다. 키메라는 이제 자체 지방 패드에서 정상 LN과 매우 유사하며, LN은 지방 조직의 중심에서 볼 수 있습니다(그림 1). LN을 확인할 수 없는 경우, 신장 이식 중에 소실되었을 가능성이 있습니다. LN 발달에 잠재적으로 중요한 유전자의 역할을 평가할 때, 회수된 LN은 매우 작게 유지되어 찾기가 더 어려울 수 있습니다. 이는 LTβR-/- 마우스의 지방 조직이 신생아 LN과 재결합하는 경우입니다14.

LN을 조심스럽게 분리하면 EYFP+ 지방 유래 세포의 자손을 추가로 분석할 수 있습니다. LN의 동결절편 및 면역형광 분석은 EYFP+ 지방 유래 세포가 LN으로 이동하여 Gp38+ERTR-7+ LN 기질 세포 네트워크에 기여하는 것을 보여줍니다(그림 .......

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Discussion

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이 기사에서 우리는 발달 중인 LN에 대한 지방 조직 전구 세포의 기여도를 분석하고 정량화하는 방법과 자손을 분석할 수 있는 두 가지 기술을 제시했습니다. 배아 지방 패드 및 신생아 LN의 해부는 섬세하며 실제 LN-지방 패드 키메라를 생성하기 전에 많은 연습을 통해 얻은 수동 기술이 필요합니다. 해부의 품질을 제어하기 위해 지방 패드와 LN에 대해 유세포 분석을 수행할 수 있습니다. 배아 지방 패드 준비에는 림프절이 없어야 하며 CD45+CD4+IL-7Ra+ 림프 조직 유도 세포를 포함해서는 안 됩니다. 신생아 LN 제제는 지방 조직이 전혀 없어야 하며 높은 비율의 CD45-CD31-ICAM-1 높은VCAM-1높은 림프 조직 조직자 세포6,13-14를 포함해야 합니다. 오염 위험을 줄이기 위해 조직 배양 및 수술을 위한 표준 멸균 기술을 따라야 합니다.

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Disclosures

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저자는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 동물 서식지를 돌봐준 버밍엄 대학의 생물 의학 서비스 부서 직원들에게 감사합니다. 이 작업은 EU FP7 통합 프로젝트 INFLACARE to JC의 지원을 받았습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2-메르캅토에탄올시그마M3148
50mm 스테릴린 페트리 디쉬Appleton WoodsSC265
90mm 스테릴린 페트리 디쉬Appleton WoodsSC260
접착 슬라이드Surgipath00202
안티 마우스 CD31 eFluor 450eBioscience48-0311
안티 마우스 CD4 Alexa 647eBioscience51-0041
안티 마우스 CD45 PerCP-Cy5.5eBioscience45-0451
안티 마우스 IgM 로다민 레드스트라텍715-296-020-JIR
안티 마우스 Podoplanin PE/Cy7Biolegend127411
안티 마우스 Podoplanin 정제eBioscience14-5381
콜라겐분해효소 DRoche
DMEM 미디엄시그마D5671
DNase I시그마DN25-1G
Dumont #5 집게 Inox BiologieFST11252-20배아 및 신생아 박리용 초미세 집게
EDTA 용액 0.5 MSigmaE7889
ERTR-7Biogenesis
소 태아 혈청SigmaF9665
경화 파인 아이리스 가위 스트레이트 11 cmFST14090-11해부용 소형 가위
HEPES 용액SigmaH0887
Isopore 멤브레인 필터 0.8 μ m ATTPMilliporeATTPO 1300
L-글루타민 용액SigmaG7513
MEM 비필수 아미노산 용액(100x)SigmaM7145
O.C.T. 화합물Tissue-Tek4583
페니실린-스트렙토마이신SigmaP4458
뚜껑이 있는 플라스틱 상자Watkins and DoncasterE6052in vitro 장기 배양을 위한 샌드위치 상자. CO2 인큐베이터에서 가스를 교환할 수 있도록 뚜껑에 두 개의 구멍을 뚫습니다.
RPMI 1640 미디엄시그마R0883
스폰지 Vulkan 언더랩Patterson 의료004383
실체 현미경LeicaLEICA MZ95줌
모믹서Eppendorf5436
Vectashield 마운팅 배지 DAPIVector LaboratoriesH-1200
11088858001 써

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mueller, S. N., Germain, R. N. Stromal cell contributions to the homeostasis and functionality of the immune system. Nat. Rev. Immunol. 9, 618-629 (2009).
  2. Roozendaal, R., Mebius, R. E. Stromal cell-immune cell interactions. Annu. Rev. Immunol. 29, 23-43 (....

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