림프절 기질 세포 기원 연구를 위한 림프절 지방 패드 키메라의 생성

Summary

림프절 기질 세포 기원 연구를 위한 림프절/지방 패드 키메라의 생성이 설명됩니다. 이 방법은 신생아 마우스와 배아 지방 패드에서 림프절을 분리하고, 키메라 림프절 지방 패드를 생성하고, 숙주 마우스의 신장 캡슐 아래로 림프절을 옮기

는 것입니다.

Abstract

기질은 림프절 구조와 기능의 핵심 구성 요소입니다. 그러나 그 기원, 정확한 세포 구성 및 그 형성을 지배하는 메커니즘에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 림프절은 항상 지방 조직에 캡슐화되어 있으며, 우리는 최근에 림프절 기질의 형성에 대한 이러한 관계의 중요성을 입증했습니다. 지방세포 전구세포는 발달 과정에서 림프절로 이동하며, 림프세포(Lymphotoxin-b) 수용체가 관여하면 지방형성을 끄고 지방형성을 차단하고 림프구 기질세포(lymphoid stromal cell)로 분화한다(Bénézech et al.¹⁴). 지방 조직의 림프구 기질 전위를 기반으로 림프절 기질 세포 전구체의 계통 추적을 가능하게 하는 림프절/지방 패드 키메라를 사용하는 방법을 제시합니다. 신생아 림프절과 EYFP⁺ 배아 지방 조직을 분리하고 LN/EYFP⁺ 지방 패드 키메라를 만드는 방법을 보여줍니다. 숙주 마우스의 신장 캡슐 아래로 이식된 후, 림프절은 국소 지방 조직 전구 세포를 통합하고 형성을 마칩니다. 생성된 림프절에서 EYFP⁺ 지방 패드 세포의 자손 분석은 효소로 분해된 림프절의 유세포 분석 또는 림프절 동결절편의 면역형광 분석을 통해 수행할 수 있습니다. 다양한 knockout 마우스 모델의 지방 패드를 사용함으로써, 이 방법은 다양한 림프절 기질 세포 집단의 기원을 분석하는 효율적인 방법을 제공할 것입니다.

Introduction

림프절(LN)은 림프 혈관 구조망을 따라 신체의 전략적 위치에 위치한 면역 체계의 핵심 기관입니다. 그들은 항원과 병원체의 여과를 가능하게 하고 림프구에 항원을 제시하고 적응 면역 반응을 유도할 수 있는 장소를 제공합니다. LN의 기본 구조를 형성하고 적응 면역 반응의 다양한 조혈 참가자의 움직임을 조율하는 기질은 이러한 기관의 기능에 중심적인 역할을 합니다. 기질 세포의 다양한 집단은 면역 체계의 조혈 구성 요소의 이동, 국소화, 생존, 증식 및 성숙에 대한 필수적이고 구체적인 단서를 제공합니다^1-3. 성인 LN 기질 세포는 혈액 내피 세포, 림프 내피 세포 및 섬유아세포의 세 가지 범주로 나뉩니다. 이 세 가지 범주는 이질적인 인구를 포함합니다. 섬유아세포 집단은 섬유아세포 망상 세포(FRC), 여포 수지상 세포(FDC), 변연 망상 세포(MRC)를 포함하는 반면, 캡슐을 형성하는 섬유아세포, 수질 및 아직 확인되지 않은 기타 세포^1-5를 포함합니다. 서로 다른 LN 기질 세포 집단의 성숙을 지배하는 기원과 메커니즘은 불분명하며, 특정 LN 기질 세포 집단의 운명 매핑을 가능하게 하는 특정 마커가 없기 때문에 연구가 특히 어렵습니다. 그러나 LN 기질 세포의 개체발생에 대한 완전한 이해는 적응 면역 반응, 내성에 기여하는 메커니즘의 이해를 위해 필요하며 인공 LN 개발의 기초가 됩니다.

지금까지 LN 기질 세포 기원 및 발달에 대한 연구는 대부분 야생형 마우스와 다른 녹아웃 마우스 균주^6-9의 배아 및 신생아의 LN 발달에 대한 직접적인 평가로 제한되었습니다. 이러한 접근법은 LN 발달에 중요한 유전자에서 결실을 운반하는 일부 마우스 균주의 배아 및 주산기 치사율에 의해 제한됩니다. 더욱이, 림프조직 발달에 필수적인 유전자 중 일부는 RANK^10-11 또는 NF-κB2¹²의 경우와 같이 광범위한 생물학적 과정에 관여합니다. 이러한 문제를 해결하기 위해 숙주 마우스의 신장 캡슐 아래에 배아 LN의 분리 및 이식이 수행되었습니다^12-13. 이 기술은 예를 들어, 야생형 환경에서 유전자 변형 배아 LN을 전달하여 장기 발달과 숙주 세포의 모집 및 조직을 평가할 수 있습니다. 그러나 성체 숙주의 신장 캡슐 아래에 이식된 배아 LN의 성장이 손상되어 이 기술의 사용이 제한됩니다.

LN과 지방 침전물은 해부학적으로 밀접하게 연관되어 있으며 배발생 중에 동시에 발생합니다. 우리는 최근에 LN/지방 조직 연관이 LN을 위한 기질 세포 전구 세포를 제공하는 데 중요한 역할을 한다는 것을 입증했습니다. 특히, LTβR을 통한 신호전달은 지방형성을 차단하고 대신 LN 기질세포 표현형¹⁴를 향한 성숙을 촉진함으로써 지방세포 전구세포의 운명을 조절합니다. 여기에서는 LN-fat pad chimeras의 생성을 기반으로 하는 방법을 설명하여 개발 중인 LN에서 지방 조직 유래 세포를 추적할 수 있습니다. 이 방법은 서로 다른 LN 기질 세포 집단에 대한 지방 조직의 기여도를 결정하는 데 유용하며, 유전자 변형 마우스 균주의 조직을 사용하는 것과 결합하여 서로 다른 LN 기질 세포 하위 집합의 분화를 제어하는 메커니즘을 더 잘 이해할 수 있습니다.

Protocol

마우스는 영국 내무부 및 지역 윤리 위원회 규정에 따라 버밍엄 대학의 생물 의학 서비스 부서에서 SPF 조건으로 사육 및 유지되었습니다. 이 프로토콜에 설명된 모든 절차는 지역 윤리 위원회와 내무부에서 승인한 프로젝트 라이선스에 따라 적용됩니다.

1. 신생아 LN의 격리

1. 갓 태어난 쥐를 경추 탈구로 희생시킵니다.
2. 머리를 절개하고 흉부 위쪽에서 복부 아래쪽까지 가위로 몸을 열고 복강에서 모든 내장(심장, 폐, 간, 장, 신장, 방광)을 조심스럽게 제거합니다.
3. RF10 배지(10% 소 태아 혈청, 100U/ml 페니실린, 100mg/ml 스트렙토마이신 및 2mM L-글루타민이 보충된 RPMI1640 배지)가 포함된 90mm 페트리 접시에 시신을 옮깁니다. 이 단계부터 조직은 멸균 상태로 유지되고 조직 배양 후드에서 처리됩니다.
4. RF90이 들어있는 새로운 10mm 페트리 접시로 본체를 옮깁니다.
5. 해부 현미경으로 서혜부 피부에서 복막을 조심스럽게 분리합니다. 서혜부 LN은 지방 패드에 있는 세 개의 혈관이 교차하는 지점에 위치합니다.
6. LN을 조심스럽게 제거합니다. 모든 지방 조직이 제거되었는지 확인하십시오. LN을 RF10 매체가 들어 있는 50mm 페트리 접시로 옮깁니다. 절차를 계속하는 동안 티슈를 얼음 위에 보관하십시오.

2. E18.5 팻 패드의 절연

1. 임신 18.5일째(E18.5)에 마우스 배아를 생성하려면, 케이지당 암컷 마우스와 수컷 마우스를 하룻밤 동안 배치하여 시간 제한 임신을 설정합니다. 아침에 생쥐를 분리하고 질 마개가 있는지 확인합니다(재태일 E0.5).
   1. 임신 18.5일째에 막힌 암컷을 자궁경부 탈구로 안락사시킵니다.
   2. 배아를 제거하고 RF10이 들어있는 90mm 페트리 접시에 넣었습니다.
2. 이 단계부터는 조직 배양 후드에서 멸균 기술을 사용하여 조직을 처리해야 합니다. 해부 현미경으로 머리를 절편화하고 흉부 부위에서 복부 부위 하단까지 가위로 배아를 열고 체강에서 모든 내장(심장, 폐, 간, 장, 신장, 방광)을 조심스럽게 제거합니다.
3. 남아 있는 모든 내장 조직에서 몸을 씻고 PBS로 씻어 해부를 더 어렵게 만들 수 있는 모든 혈액 흔적을 제거합니다.
4. 깨끗한 본체를 RF90이 들어있는 새로운 10mm 페트리 접시에 옮깁니다.
5. 서혜부 피부에서 복막을 조심스럽게 분리한다. 서혜부 LN은 지방 패드에 있는 세 개의 혈관이 교차하는 지점에 위치합니다.
6. LN을 조심스럽게 제거하고 폐기하십시오. 키메라에 사용되는 지방 패드가 림프 기질 세포에 의해 오염되지 않도록 LN을 완전히 제거하는 것이 매우 중요합니다.
7. 서혜부 지방 패드를 제거하고 RF50 매체가 들어 있는 10mm 페트리 접시에 옮깁니다. 절차를 계속하는 동안 티슈를 얼음 위에 보관하십시오.

3. LN-fat Pad 키메라의 생성

1. 체외 장기 배양 시스템 준비¹⁵.
   1. 스폰지 및 필터 준비: 이것은 미리 수행할 수 있으며 스폰지와 필터는 배양 후드의 페트리 접시에 멸균 상태로 보관됩니다.
      1. Vulkan 언더 랩을 1-1.5 cm² 개 잘라
      2. 증류수에 스펀지를 2시간 동안 끓입니다.
      3. 세포 배양 후드에서 스펀지를 몇 시간 동안 말리십시오.
      4. 필터를 20분 동안 끓입니다.
      5. 세포 배양 후드에서 필터를 몇 시간 동안 건조시킵니다.
   2. 10% 소 태아 혈청, 10mM HEPES, 1x MEM 비필수 아미노산 용액, 50mM 2-메르캅토에탄올, 100U/ml 페니실린, 100mg/ml 스트렙토마이신 및 2mM L-글루타민으로 보완된 DMEM 배지를 준비합니다.
   3. 2mm 페트리 접시에 50ml의 미디어를 추가합니다.
   4. 페트리 접시 바닥에 스폰지 하나를 놓습니다. 스펀지의 양면을 미디어에 담가 적십니다.
   5. 스펀지 위에 필터 하나를 놓습니다. 필터는 액체-공기 인터페이스에 위치합니다.
2. 해부 현미경 아래에서 하나의 신생아 LN을 하나의 배아 지방 패드와 조심스럽게 다시 연결합니다.
3. LN-fat 패드 키메라를 필터 위에 놓습니다.
4. 뚜껑에 몇 개의 구멍이 있고 습도를 보장하기 위해 바닥에 물이 들어 있는 직사각형 플라스틱 상자에 페트리 접시를 옮깁니다.
5. 테이프로 상자 뚜껑을 밀봉합니다. 뚜껑에 있는 두 개의 구멍을 열어 두십시오.
6. 상자를 37°C에서 5% CO₂로 세포 배양 인큐베이터로 옮깁니다. 뚜껑의 구멍을 테이프로 밀봉하기 전에 상자를 2시간 동안 평형을 이룹니다.
7. LN이 지방 패드에 부착되고 신장 캡슐 아래로 이동할 수 있도록 최소 2일 동안 조직을 배양합니다.

4. 숙주 마우스의 신장 캡슐 아래로 LN-fat Pad 키메라의 이동

1. 필터에서 LN-fat pad 키메라를 수집하여 숙주 마우스의 신장 캡슐 아래로 옮깁니다. 신낭 이식 방법은 이미 기술되어 있다 ¹⁶.

5. 전송된 LN의 격리

1. 신장 캡슐 아래에서 3-4주가 지나면 LN-fat 패드 키메라를 수확할 준비가 됩니다. 승인된 지침에 따라 숙주 마우스를 안락사시킵니다.
2. 숙주 마우스에서 신장을 제거합니다.
3. 해부 현미경으로 LN-fat pad 키메라를 분리하고 LN을 해부합니다.

6. 유세포 분석을 위한 전송된 LN의 효소 분해

1. 효소가 장기에 침투하여 소화를 촉진할 수 있도록 작은 가위로 LN을 한 번 절개합니다.
2. 600 μl의 분해 완충액(RPMI 1% FCS, 2.5 mg/ml Collagenase D, 100 μg/ml DNase I)이 포함된 1.5 ml Eppendorf에 LN 1개를 넣습니다.
3. 37 °C에서 교반 열 블록에서 30 분 동안 배양합니다. 10분마다 조직의 해리를 돕기 위해 위아래로 피펫을 사용합니다.
4. 튜브에 6μl EDTA 0.5M를 추가하고 위아래로 피펫을 넣어 조직의 해리를 마칩니다.
5. 490 x g에서 5분간 원심분리기를 사용합니다.
6. 일차 항체 조합을 함유한 염색 용액(PBS, 0.1% BSA, 5% 랫드 세럼 및 5% 마우스 혈청)에 세포 펠렛을 재현탁합니다.
7. 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다.
8. PBS에서 두 번 세척
9. 필요한 경우 20분 동안 2차 항체로 배양합니다.
10. PBS에서 2번 세탁합니다.
11. 유세포 분석기에서 분석합니다.

7. 면역형광에 의한 전달된 LN 분석

1. 동결 및 극저온 절편 공정 중 EYFP 보존을 위한 고정: LN을 PBS, 4% PFA 및 10% 자당 용액에 넣고 3-4시간 동안 그대로 둡니다.
2. 작은 알루미늄 호일 조각에 차가운 OCT 화합물을 한 방울 떨어뜨립니다. 기포를 피하십시오. 방울 중간에 액체가 없는 LN을 조심스럽게 놓습니다.
3. 드라이 아이스에 알루미늄 호일을 올려 오르간을 얼립니다.
4. 저온 유지 장치를 사용하여 추가 접착제 유리 슬라이드에 8-10μm 섹션을 자릅니다. 슬라이드를 -20°C에서 보관하기 전에 2시간 동안 건조시키십시오.
5. 염색 절차는 사용되는 1차 항체에 따라 달라질 수 있으며 다음 프로토콜에서 최적화할 수 있습니다. 일차 항체 조합을 함유한 염색 용액(PBS, 1% BSA)으로 절편을 염색합니다.
6. 가습 챔버에서 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
7. PBS에서 5분 동안 두 번 세척합니다
.
8. 2차 항체로 1시간 동안 배양합니다.
9. PBS에서 5분 동안 두 번 세척합니다.
10. DAPI가 포함된 장착 매체에 슬라이드를 장착합니다.
11. 형광 또는 컨포칼 현미경을 사용하여 이미지를 캡처합니다.

Results

이식 후 3주가 지나면 LN/지방 패드 키메라가 신장에서 회수됩니다. 키메라는 이제 자체 지방 패드에서 정상 LN과 매우 유사하며, LN은 지방 조직의 중심에서 볼 수 있습니다(그림 1). LN을 확인할 수 없는 경우, 신장 이식 중에 소실되었을 가능성이 있습니다. LN 발달에 잠재적으로 중요한 유전자의 역할을 평가할 때, 회수된 LN은 매우 작게 유지되어 찾기가 더 어려울 수 있습니다. 이는 LTβR^-/- 마우스의 지방 조직이 신생아 LN과 재결합하는 경우입니다¹⁴.

LN을 조심스럽게 분리하면 EYFP⁺ 지방 유래 세포의 자손을 추가로 분석할 수 있습니다. LN의 동결절편 및 면역형광 분석은 EYFP⁺ 지방 유래 세포가 LN으로 이동하여 Gp38⁺ERTR-7⁺ LN 기질 세포 네트워크에 기여하는 것을 보여줍니다(그림 ...

Discussion

이 기사에서 우리는 발달 중인 LN에 대한 지방 조직 전구 세포의 기여도를 분석하고 정량화하는 방법과 자손을 분석할 수 있는 두 가지 기술을 제시했습니다. 배아 지방 패드 및 신생아 LN의 해부는 섬세하며 실제 LN-지방 패드 키메라를 생성하기 전에 많은 연습을 통해 얻은 수동 기술이 필요합니다. 해부의 품질을 제어하기 위해 지방 패드와 LN에 대해 유세포 분석을 수행할 수 있습니다. 배아 지방 패드 준비에는 림프절이 없어야 하며 CD45⁺CD4⁺IL-7Ra⁺ 림프 조직 유도 세포를 포함해서는 안 됩니다. 신생아 LN 제제는 지방 조직이 전혀 없어야 하며 높은 비율의 CD45-CD31-ICAM-1 ^높은VCAM-1^높은 림프 조직 조직자 세포^6,13-14를 포함해야 합니다. 오염 위험을 줄이기 위해 조직 배양 및 수술을 위한 표준 멸균 기술을 따라야 합니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-메르캅토에탄올	시그마	M3148
50mm 스테릴린 페트리 디쉬	Appleton Woods	SC265
90mm 스테릴린 페트리 디쉬	Appleton Woods	SC260
접착 슬라이드	Surgipath	00202
안티 마우스 CD31 eFluor 450	eBioscience	48-0311
안티 마우스 CD4 Alexa 647	eBioscience	51-0041
안티 마우스 CD45 PerCP-Cy5.5	eBioscience	45-0451
안티 마우스 IgM 로다민 레드	스트라텍	715-296-020-JIR
안티 마우스 Podoplanin PE/Cy7	Biolegend	127411
안티 마우스 Podoplanin 정제	eBioscience	14-5381
콜라겐분해효소 D	Roche
DMEM 미디엄	시그마	D5671
DNase I	시그마	DN25-1G
Dumont #5 집게 Inox Biologie	FST	11252-20	배아 및 신생아 박리용 초미세 집게
EDTA 용액 0.5 M	Sigma	E7889
ERTR-7	Biogenesis
소 태아 혈청	Sigma	F9665
경화 파인 아이리스 가위 스트레이트 11 cm	FST	14090-11	해부용 소형 가위
HEPES 용액	Sigma	H0887
Isopore 멤브레인 필터 0.8 μ m ATTP	Millipore	ATTPO 1300
L-글루타민 용액	Sigma	G7513
MEM 비필수 아미노산 용액(100x)	Sigma	M7145
O.C.T. 화합물	Tissue-Tek	4583
페니실린-스트렙토마이신	Sigma	P4458
뚜껑이 있는 플라스틱 상자	Watkins and Doncaster	E6052	in vitro 장기 배양을 위한 샌드위치 상자. CO2 인큐베이터에서 가스를 교환할 수 있도록 뚜껑에 두 개의 구멍을 뚫습니다.
RPMI 1640 미디엄	시그마	R0883
스폰지 Vulkan 언더랩	Patterson 의료	004383
실체 현미경	Leica	LEICA MZ95	줌
모믹서	Eppendorf	5436
Vectashield 마운팅 배지 DAPI	Vector Laboratories	H-1200