방법 논문

파킨슨 병에서 감수성 메커니즘을 마스크를 해제하는 유전자 환경 상호 작용 모델

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DOI:

10.3791/50960

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2014년 1월 7일

 ,  ,  , 
1Center for Health Sciences, SRI International, 2Department of Chemistry and Biochemistry, University of California-Santa Cruz

이 논문에서

요약

Lipoxygenase (LOX) isozymes 증가 또는 증가 시킬 수 있는 제품을 생성할 수 있습니다 또는 신경 염증 및 신경 변성. 유전자 환경 상호 작용 연구 LOX isozyme 특이적 효과 식별할 수 있습니다. 두 개의 LOX isozyme-결핍 형 형질 라인에서 니그로스트리아탈 손상의 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6,6-테트라하이드로피리딘(MPTP) 모델을 사용하면 도파미너기크 및 염증에 대한 LOX 이소지메의 기여도를 비교할 수 있습니다.

초록

Lipoxygenase (LOX) 활동은 알츠하이머 병과 같은 신경 퇴행성 질환에 연루되었지만 파킨슨 병 (PD) 병기 발생에 미치는 영향은 덜 이해됩니다. 유전자 환경 상호 작용 모델은 단독으로 유전 적 또는 독성 질병 모델을 사용하여 관찰되지 않을 수 있는 독성에 있는 특정 세포 통로의 충격을 마스킹해제에 있는 유틸리티가 있습니다. 뚜렷한 LOX 이소지메스가 PD 관련 신경변성에 선택적으로 기여하는지 평가하기 위해,형질전환(즉, 5-LOX 및 12/15-LOX 결핍) 마우스는 장애에서 세포 손상과 사망을 모방한 독소로 도전할 수 있다. 여기서 우리는 PD와 관련된 신경 변성에 LOX isozymes의 뚜렷한 기여를 해명하기 위해 nigrostriatal 병변을 생성하는 신경 독소, 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6 테트라 하이드로피리딘 (MPTP)의 사용을 설명합니다. 마우스에 MPTP의 사용, 비 인간 영장류, PD의 nigrostriatal 손상을 재현하기 위해 잘 설립된다. MPTP 유도 병변의 정도는 도파민의 HPLC 분석과 대사산물 및 티로신 하이드록실라제(TH)에 대한 스트리에이텀의 반정성 서양 얼룩 분석에 의해 측정되며, 도파민합성을 위한 속도 제한 효소이다. LOX 이소지메 선택적 감도를 입증할 수 있는 염증성 마커를 평가하기 위해, 글리아 세동 산성 단백질(GFAP) 및 이바-1 면역조직화학은 실질적인 니그라를 함유하는 뇌 단면에서 수행되며, GFAP 웨스턴 블롯 분석은 현저균질상에서 수행된다. 이 실험적인 접근은 nigrostriatal 변성 및 PD의 근본적인 유전자 환경 상호 작용에 새로운 통찰력을 제공할 수 있습니다.

서론

유전자 환경 상호 작용 모델의 사용은 특발성 파킨슨 병 (PD)에 영향을 미칠 가능성이 있는 위험 요소를 모방하는 접근법을 제공하고 유전적 또는 독성 시스템만1,2를사용하여 해명될 가능성이 없는 기계론적 통찰력을 분별할 수 있는 기회를 제공한다. 여기서 우리는 이 점을 설명하고 신경염증 및독성에대한 립산소증(LOX)의 선택성을 더 잘 이해하기 위해 니그로스트리아탈 변성3의 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘(MPTP) 마우스 모델의 적용을 설명한다. LOX isozymes에 대한 역할은 뇌졸중7 및 알츠하이머 병8,9를포함한 CNS 질환뿐만 아니라 말초 장애5,6에서 널리 평가되었지만, PD와 관련된 니그로스 트리아탈 기능 및 변성에서 이소지메의 가족의 역할은 잘 이해되지 않고 연구를 보증한다. MPTP 신경독소는 니그로스트리아탈 통로의 우대변성을 입증하고 PD환자(10)의운동장애를 뒷받침하는 스트루아탈 도파민 고갈 및 니그랄 도파민 세포 손실을 재구성한다. 이 모델은 비운동 및 모터 PD 행동과 솔직한 α-synuclein 양성 Lewy 신체 병리학의 전체 간부를 재현하지는 않지만, 111에 의해 안정적으로 nigral cell death를 생산할 수 있는 최고의 특성이 있는 비침범성 모델이기 때문에 nigrostriatal 손상및초기 단계 번역 테스트에 기여하는 새로운 기계성 표적을 해명하는 데 유용했습니다. 급성, 아급성에서 만성16-18에이르기까지 패러다임으로 MPTP 마우스의 광범위한 사용은 치료요법18,21,22에따라 다른 독성 메커니즘의 활성화와 함께19,20에서 심한 nigrostriatal 손상으로 가벼운 결과를 초래하는 투약의 표준화를 허용했다. 따라서, 이는23-25를활용한 치료제 또는 형질전환 모델에 따라 개선되거나 감소된 니그로스트라탈 손상을 초래할 수 있는 '병변의 창'을 허용한다.

또한 번역 및 발견 생물학 연구 결과에 필수적인 손상을 평가하는 데 사용되는 기술과 그러한 방법이 제공하는 증거입니다. MPTP 마우스 모델의 경우, 병변을 평가하기 위한 확립된 지표는 HPLC에 의한 도파민 및 대사산물을 포함한 현트리아탈 도파민의 마커, 티로신 하이드록실라제(TH), 도파민 합성의 속도 제한 효소 및 면역학적 인 비올레를 이용한 퇴행성 발생의지표이다. 이들은 고전적인 신경 화학, 생화학적, 및 조직학적 절차이지만, 기술은 nigrostriatal dopaminergic 통로 내의 손상의 정도에 중요하고 재현 가능한 판독을 제공하고, 독성의 메커니즘을 나타내며, PD의 퇴행성 사건을 이해하는 데 중요한 도구가 입증되었습니다.

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프로토콜

참고: 모든 동물 절차 및 동물 관리 방법은 기관의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받아야 합니다. 여기에서 기술된 연구는 SRI 인터내셔널의 IACUC에 의해 수립된 지침에 따라 수행되었습니다.

1. LOX 결핍 마우스의 획득 및 유지 보수

  1. 5-LOX 결핍 또는 12/15-LOX-결핍 마우스와 7-8 주에 각각의 변형 및 성일치 제어를 구입하고 도착 후 시설에 적응하기 위해 며칠을 허용하십시오.
  2. 12-h 밝은 어두운 주기에 그룹 하우징에서 마우스를 유지하고 음식과 식수 광고 리비툼을제공합니다.

2. MPTP 예방 조치, 저장, 준비, 오염 제거 및 폐기

참고: 인간에 있는 정맥 노출에서 MPTP 중독은 파킨슨증을 일으키는 원인이 되기 위하여 보였습니다10; MPTP는 매우 지평성이며 혈액 뇌 장벽(26)을쉽게 교차 할 수 있습니다. 안전한 취급, 해독 및 폐기를 보장하기 위해 예방 조치를 취해야 합니다. 그것의 물질 대사는 효소 monoamine 산화 효소 B (MAO-B)27에의하여 1-메틸-4-페닐-2,3-디하이드로피리디늄으로 변환을 포함하는 다중 단계를 포함한다. MAO-B 억제제는 우발적인 인간 중독의 경우에 이용될 수 있다.

  1. MPTP를 기관의 보건 안전 위원회의 지시에 따라 활용하기 전에 적절한 안전 및 취급 교육을 받을 수 있도록 하십시오. 각 기관은 문헌17,22에종합적으로 설명된 권장 사항을 기반으로 MPTP 사용을 위한 자체 표준 운영 절차를 수립하고 구현할 수 있다.
  2. 준비 에 앞서 일회용 실험실 코트 또는 전신 정장, 더블 니트릴 장갑, 수술 용 마스크, 헤어 커버, 안전 고글 및 일회용 신발 커버를 포함하여 적절한 개인 보호 장비 (PPE)를 착용하십시오. 적절한 PPE는 동물 및/또는 침구를 취급할 때 MPTP, 주사 패러다임 및 72 시간 후 주입의 준비 도중 착용되어야 합니다.
  3. 준비하기 전에 계산을 수행합니다. 체적 수수에 대한 제도적 지침을 따라야 합니다. 100-150 μl의 전달은 전형적으로 25-30 g 마우스에 사용된다.
    1. 식염수에 3 mg / ml MPTP 솔루션을 준비하려면 보정 계수 (1.211 MPTP-HCl : 1.0 MPTP 무료 베이스);를 적용하십시오. 식염수 차량에서 MPTP-HCl의 농도는 3.633 mg/ml입니다.
    2. 신경 독소를 처리하기 전에 MPTP 준비 및 잠재적 유출 제거에 필요한 모든 장비, 소모품 및 시약을 준비하십시오.
  4. 적절한 저장소 위치에서 MPTP-HCl 소스 바이알을 제거합니다.
    참고: MPTP는 보조 컨테이너 내의 닫힌 바이알에서 RT에서 유지 관리되어야 하며 "MPTP"라고 표시된 잠긴 캐비닛 내에 저장되어야 합니다.
    1. 포장패드 나 종이 타월로 주변 비늘을 덮어 10 % 표백제 용액으로 감쇠하여 유출 된 분말의 위험을 줄입니다. 예방 조치로 조직과 10 % 표백제 용액을 근처에 두십시오.
    2. 연기 후드에 있는 분석 균형을 사용하여, 무게 50 MPTP-HCl의 mg 유리 유리 병에 10% 표백에 젖은 조직을 포함 하는 이차 봉쇄. 유리 유리 바이알 "MPTP"에 농도 및 날짜로 레이블을 지정합니다.
    3. 소스 바이알을 닫고 10 % 표백제로 외부를 닦으셔.
  5. 13.763ml의 멸균 식염수식을 바이알에 천천히 넣고 믹싱을 위해 완전히 닫습니다. (용액은 3.633mg/ml MPTP-HCl입니다.)
    1. 후드에서 0.22 μm 필터를 사용하여 10% 표백제에 젖은 조직으로 이차 용기 내에 라벨이 부착된 주입 유리알로 여과하여 MPTP 용액을 신중하게 살균합니다. 표백제에 흠뻑 젖은 조직으로 유출을 청소하십시오.
    2. 적절하게 라벨이 부착된 생체 위험 용기에 날카로운 유리병을 조심스럽게 폐기하십시오. 동물 시술실로 운반하기 위해 표백제에 젖은 조직으로 보조 용기에 MPTP 용액을 유지하십시오.
      참고: 기화가 흡입 위험이 있기 때문에 멸균을 위한 MPTP 솔루션을 자동 clave하지 마십시오.
  6. MPTP 소스 바이알을 보조 컨테이너로 반환하고 저장 위치에 배치합니다. 10% 표백제사용으로 주걱, 분석 스케일 및 후드 표면을 10분 동안 오염 제거합니다.

3. MPTP 관리

  1. "MPTP"(와이어 푸드 그릴 제외), 일회용 케이지 라이너, 습식 식품 펠릿 및 하이드로겔을 수원으로 표시하는 폴리에스테르 여과 라이너가 포함된 표준 미세화기 천공 뚜껑이 있는 일회용 케이지를 준비합니다. 모든 동물의 무게와 기록 볼륨 3 mg/ml MPTP 식염수에 필요한 15 mg/kg 주입.
    참고: MPTP 대사산물은 주사28,29다음에 3일 동안 배설물에서 검출할 수 있습니다. 그러나, 마우스는 MPTP n-oxide, 그것의 친성 때문에 막을 교차하지 않는 비독성유도체를 배설한다 (30).
    1. 위에 나열된 모든 PPE를 착용하고 일회용 흡수 패드 위에 마우스를 들고, 일회용 26 게이지 결핵 주사기로 4 일 동안 매일 4 일 동안 15 mg / kg 용량에 대한 식염수 차량 또는 MPTP 용액을 주입합니다.
    2. 사용 후 주사기를 요약하지 마십시오. 전용 및 라벨이 부착된 MPTP 바이오 위험 샤프 용기에 넣습니다. 10% 표백제와 조직을 근처에 유지하여 우발적인 드립을 청소하십시오.
  2. 일회용 케이지에 MPTP로 주입된 동물, 케이지당 최대 5마리의 마우스를 배치하고 오픈 랙에 집을 놓습니다. 통풍이 잘 되는 랙은 사용하지 마십시오.
    1. 마지막 주입 후 72 시간까지 마우스와 하우징 룸 도어가 들어있는 랙에 MPTP를 놓습니다.
      참고: 마우스가 MPTP 중독 후 최대 12시간까지 과도 저체온증을 경험하기 때문에 하우징 룸의 온도가 22.2- 24.4oC 사이인지 확인합니다. 31
    2. 사용 후 표백제로 작업 표면을 오염 제거(단계 2.8 참조), 남은 MPTP 용액을 10%에 상응하는 부피를 첨가하여 폐기하고, 생물유해액체 폐기물로 내용물을 폐기한다.
    3. 사용된 PPE를 전용 폐기 빈에 모두 폐기하십시오. 필요한 경우 폐기 하기 전에 10% 표백제와 함께 스프레이.
  3. 동물을 정기적으로 확인하고 마지막 주입 후 72 시간 동안 주사 패러다임 동안 매일 음식과 수원을 새로 고칩니다. 참고: 케이지 외부를 둘러싼 지역에서는 오염이 예상되지 않지만, 이 지역은 예방 조치로 표백제 용액으로 처리됩니다(2.8단계에 설명된 대로). 이 기간 동안 모든 마우스와 장비를 취급할 때주의해야 합니다.
    1. 마지막 주입 후 3 일, 적절하게 라벨 바이오 위험 가방에 모든 케이지와 라이너를 폐기. 동물을위한 일반 PPE 및 일반 주택의 사용을 재개; 문과 선반 플래카드를 제거합니다.

4. 조직 수확

  1. 마지막 MPTP 주입 다음 7 일 자궁 경부 탈구에 의해 동물을 안락사. 관상 평면에 1mm 슬롯과 사전 차가운 뇌 금형을 사용하여 얼음에 즉시 뇌를 해부.
  2. 전방 분리의 수준에서 2mm 두께의 전뇌 슬라이스에서 줄무늬를 해부합니다.
    1. 메스를 사용하여 주변 피질 및 피질 영역을 제거합니다. 신경화학적 또는 생화학적 분석을 위한 별도의 1.5ml 마이크로센심분리기 튜브에서 각 반구의 스냅 동결 줄기 조직.
  3. 전방 시상 하 부 및 침지 수정 조직의 수준에서 관상 평면에서 중간 뇌 /힌뇌를 차단 4% 포름알데히드 수성 용액.

5. 조직 처리

  1. 생화학 공정
    1. 200-μL Tris-EDTA 용해 완충제(25m Tris-EDTA 베이스, 1:100 프로테아제 및 인산염 억제제 칵테일)에서 초음파 세포 파괴기를 사용하여 한 반구의 현저 조직을 10-12Hz에서 10펄스, 10-12Hz에서 10°C로 균질화하고 10분 X10에서 10°C에 10°C에 대한 원심을균질화하였다.
    2. 신중하게 슈퍼 나탄을 흡인하고, 150 μl 용해 버퍼에서 펠릿을 재구성. 분수는 SDS 페이지와 서양 블로팅에 의한 생화학 적 분석에 사용됩니다.
      참고: 수성 용액의 불안정성으로 인해 준비 의 1 시간 이내에 프로테아제 및 인산 억제제 함유 버퍼를 사용합니다.
  2. 신경화학 과정
    1. HPLC에 대해 -80°C에 저장된 각 샘플에서 다른 반구에서 해부된 줄무늬를 활용합니다. 얼음에 미세 분리 튜브에 ttriatal 조직을 해동, 500-μl 0.3N 과염소산 (PCA)를 추가하고 초음파 처리를 사용하여 균질화.
      참고: 0.3N PCA 100ml를 만들고, 90ml ddH2O를 측정하고, 100ml 졸업 실린더에 추가하고, 2.58 ml의 70% PCA를 추가하고, 100ml 마크를 넣습니다. 이 샘플 버퍼는 최대 1개월 동안 4°C로 저장할 수 있습니다.
    2. 500 μl 얼음-차가운 0.3N PCA에서 striatal 조직을 초음파 처리하여 10-12Hz에서 10 펄스를 원하고 얼음 위에 놓습니다. 균질성을 보장하기 위해 샘플을 10초 동안 두 번째로 초음파 처리한 다음 원심분리기는 16,100xg에서4oC에서 12분 동안 원심분리기를처리합니다.
    3. 즉시 1.5ml 마이크로 센트심분리기 튜브에 상신을 데칭하고 -80 ° C에 저장합니다. 후드의 펠릿 분획을 공기 건조시.
    4. 전기화학적 검출을 통해 HPLC에 의해 도파민과 대사산물, 3,4디하이드록시페닐레이스산(DOPAC) 및 호모바닐라산(HVA)을 측정하기 위해 사용할 때까지 -80°C에서 상체를 유지한다.
    5. 일단 건조되면 0.5N NaOH (500 μL)로 펠릿 분수를 재구성하고 잠시 초음파 처리합니다. 로우리 방법을 사용하여 총 단백질의 측정을 위해 사용할 때까지 재구성된 펠릿 분수를 4°C에 저장합니다.
  3. 면역 히스토케스화학 공정
    1. 침수 수정 중뇌 블록 하룻밤 4% 포름알데히드 수성 용액 및 저온 보호 등급 자당 용액 (10% 인산염 완충 식염수 (0.01 M PBS; 0.138 M NaCl, 0.0027 M KCl, ddH2O, pH 7.4) 24시간, 4°C에서 조직이 가라앉을 때까지 PBS에서 30%. 과도한 자당 용액을 제거하고 드라이 아이스를 얼리고 사용할 때까지 -80 °C에 보관하기 위해 잠시 냉동 보호 블록을 얼룩.
    2. 극저온에서 중뇌와 뒷뇌를 포함하는 뇌 블록의 미세 절개.
      1. -80°C에서 조직을 제거하고- 16°C에서 -16°C로 대화하여 극저온에서 1h로 상량화하고, 조직 포함 매체에 장착합니다.
      2. -16°C에서 40μm 두께의 관상 계면을 냉동 보호용 용액(0.01M PBS 30%, 에틸렌 글리콜 30%, pH 7.4)으로 수집합니다. 조직을 연속적으로 6 1.5ml 마이크로센심심분리기 튜브로 240m 간격으로 수집하고 -20°C에 보관하십시오.

6. 면역 블로팅

  1. BCA 분석체에 의해 현액 상피 분획(섹션 5.1에 설명된 대로 제조)에서 단백질 농도를 결정합니다.
  2. 각 샘플에 필요한 희석을 계산하여 20 μl의 부피로 잘 전달되는 우물당 10 μg를 산출합니다.
  3. 1X Laemmli 버퍼 용액에서 10 μg 단백질을 산출하기 위해 4X Laemmli 완충제 및 균질화 완충제로 상체 단백질을 희석합니다. 예제 계산:
    1. 필요한 단백질과 부피의 최종 농도를 결정합니다. 이 경우 20 μl(0.5 mg/ml)에 10 μg가 필요합니다.
    2. 필요한 단백질 용액의 최종 양을 결정합니다. 적재를 위해서는 20μl이 필요하지만 추가 부피가 30 μl을 준비해야 합니다.
    3. 최종 부피 및 농도가 공지되고, 단백질 상골 분획의 농도가 공지되기 때문에(BCA 분석체에 의해 결정됨), 방정식을 사용하여 요구되는 단백질 상피물의 부피를 계산합니다.
      V상골 = (V파이널 x C파이널)/C 상체
      따라서, 1.5 mg/ml의 상체 단백질 농도를 위해,
      V수퍼네티드 = (30 μl x 0.5 mg/ml)/1.5 mg/ml
      V상수 = 10 μl
    4. 30 μl/4 = 7.5 μl에서 1배 농도를 산출하는 데 필요한 4배 Laemmli 버퍼의 양을 계산합니다. 참고: 4X Laemmli 버퍼는 샘플 준비에서 1배 강도로 희석되어야 합니다.
    5. 부피를 30 μl로 가져오는 데 필요한 균질화 버퍼의 양을 계산하고 원하는 최종 단백질 농도0.5 mg/ml를 얻습니다.
    6. 균질화 완충제의 12.5 μl에 단백질 상류제의 10 μl을 피펫팅 한 다음 소용돌이로 샘플을 준비합니다. 30 μl 샘플 작업 용액과 0.5 mg/ml 농도에 4X Laemmli 버퍼7.5 μl을 추가합니다.
  4. 설명된 절차를 사용하여 모든 샘플을 준비하고, 소용돌이를 사용하고 5 분 동안 끓입니다.
    참고: 스크류 탑 마이크로센심분리기 튜브를 사용하여 끓는 동안 압력으로 인한 누출 및 개방을 방지합니다.
  5. 5분 후, 즉시 얼음 위에 놓습니다. 젤당 시료 작동 용액 20 μl(단백질 10μg)을 적재합니다. 12% 트리스 글리신 젤에 SDS-PAGE에 의해 별도의 단백질 샘플.
    1. 분자량의 확인을 위해 미리 얼룩진 단백질 사다리를 사용하십시오. 러닝 버퍼는 25m Tris-베이스, 192m 글리신, 0.1% SDS, ddH2O, pH 8.3이다.
    2. 전기 포고증에 의해 단백질을 분리 : 단백질을 해결하기 위해 우물 (10 분)과 125 V (약 1 시간; 단백질 사다리가 완전히 분리 될 때까지)를 취소80 V에서 실행합니다.
  6. 트리스 글리신 전달 버퍼 (25 mM Tris, 192 mM 글리신, 0.04 % SDS, 20 % 메탄올 및 ddH2O, pH 8.3)에서 0.2 μm 니트로 셀룰로오스 멤브레인을 사용하여 단백질 - 니트로 셀룰로오스 전이를 수행 4 ° C에서 40 V.
  7. 1x 트리스 식염수(TS; 25mM Tris, 0.9% NaCl in ddH2O, pH 7.4)로 씻어낸 후 Ponceau S의 lncubate에서 10분 동안 10분 동안 ddH 2 O로 헹구고 ddH2O에서 헹구고 동등한 단백질 로딩의 대략적인 검증을 제공한다. 이미지를 스캔하여 PBS를 사용하여 노트북 및 데스테인에 대한 레코드를 유지합니다.
    참고: 밀리-Q 또는 HCl을 함유한 ddH2O로 블롯을 세척(0.2%) 약 5 분 동안. 레코드를 검색합니다. 후속 배양 단계(즉, 차단 버퍼에 배치)에 의해 멤브레인에서 Ponceau S 얼룩을 제거합니다.
  8. TS에서 5% 비지방 분유에서 1시간 동안 TS에서 블로트 블롯을 차단하고 토끼 안티 티로신 하이드록실라세(1:1000), 항β-액틴(1:200)으로 4ºC에서24h를배양합니다. 안티 GFAP (1:1000) 5 % 우유 -TS.
  9. TS에서 0.05% Tween-20 및 1 x 5분으로 TS에서 3 x 5분 세척한 다음 HRP-컨쥬게이드 이차 항체(5%의 우유를 함유한 TS의 1:5000)에서 배양한 다음, RT에서 2h의 종에 일치합니다.
  10. 루미노 및 과산화수소 용액의 동일한 볼륨을 사용하여 화학 발광 기판을 준비하고 1-3 분 동안 신청하십시오. 암실에 는 필름 노출을 위해 플라스틱 슬리브에 얼룩을 놓고 필름에 노출됩니다. 그런 다음 자동 프로세서를 사용하여 필름을 개발합니다.
  11. 37°C에서 30분 동안 시판적으로 사용할 수 있는 스트리핑 버퍼가 있는 스트립 블롯은 TS에서 0.05% Tween-20으로 3x 10분, TS에서 1x 10분 세척한 다음 로딩 제어 또는 기타 관심 단백질을 다시 조사합니다.
  12. 광학 밀도 측정을 위해 Image J 소프트웨어로 신호를 정량화하고 내부 로딩 제어 β-actin으로 정규화합니다.

7. 신경화학

  1. 분석을 위한 조직은 섹션 5.2에서 상술한 바와 같이 제조된다. 모바일 위상 레시피의 표 1을 참조하십시오.
    참고: 모든 시약은 순결≥99.0%여야 하며 HPLC 등급이어야 합니다. 깨끗하고 전용 된 유리 제품 및 교반 바으로 버퍼 무결성을 보장합니다. 모바일 위상 버퍼는 준비 후 7일 이내에 활용되어야 합니다.
    1. 디수소 인산과 구연산을 계량하고, ddH2O 1L을 넣고 2L 졸업 한 실린더에 섞습니다. 0.22 μm GSTF 멤브레인을 통해 용액을 필터링합니다.
      참고: 이것은 인산염과 구연산에 있는 오염물질의 추출을 최대화합니다, 배경 전류를 최소화하는 것을 돕습니다.
    2. OSA다음에 아세토닐및 EDTA 솔루션을 추가합니다. 인산으로 pH를 3.0으로 조정하기 전에 HPLC 등급 ddH2O를 약 1900 ml에 추가합니다.
    3. HPLC 등급 ddH2O를 2-L 마크에 추가한 다음 2-L 플라스크에 붓습니다. 전용 교반바를 넣고, 진공 상태에서 10분간 교반하여 이동국을 탈가스로 >.
  2. 도파민에 대 한 표준을 준비, 그리고 표준 곡선에 대 한 DOPAC와 HVA. 표준의 재고 솔루션은 0.3 N PCA에서 1 mg / ml로 제조됩니다.
    1. 무게 12.4 도파민-HCl의 mg, 추가 10.0 0 0 ml의 0.3 N PCA 만들기 위해 1 mg/ml 도파민.
    2. 무게 10.0 DOPAC의 mg, 추가 10.0 0 0 0 0 0 N PCA의 ml 1 mg/ ml DOPAC.
    3. 무게 10.0 mg HVA, 추가 10.0 0 0 0 0 N PCA의 ml 1 mg/ml HVA.
  3. 스톡 솔루션에서 작동하는 표준 솔루션을 준비합니다. 5점 표준은 농도 곡선을 생성하는 데 사용됩니다.
    1. 줄무늬 도파민의 측정을 위해, 12.5 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml, 그리고 200 ng/ml의 표준 농도를 준비하십시오.
    2. 무액달 DOPAC의 경우 표준 농도2.5 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml 및 40 ng/ml의 표준 농도를 준비하십시오.
    3. 줄무늬 HVA의 경우 표준 농도 5 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml, 40 ng/ml 및 80 ng/ml의 표준 농도를 준비하십시오.
    4. 5점 기준 생성: 0.3N PCA를 사용하여 5 μg/ml에 1 mg/ml 도파민 스톡 용액을 희석하십시오. 0.3N PCA를 사용하여 1 μg/ml에 1 mg/ml DOPAC 스톡 솔루션을 희석하고 0.3N PCA를 사용하여 2 μg/ml에 1 mg/ml HVA 스톡 용액을 희석시 희석합니다.
    5. 5 μg/ml 도파민 1ml, 1 μg/ml DOPAC 1ml, 25ml 체피 플라스크에 2 μg/ml HVA 1 ml를 옮기고 0.3 N PCA로 25ml 마크로 볼륨을 가져옵니다.
      참고: 체피 플라스크의 혼합 표준은 5점 표준의 가장 높은 농도를 함유하고 있습니다: 도파민 200 ng/ml, DOPAC 의 40 ng/ml, HVA80 ng/ml.
    6. 혼합 기준 1ml를 깨끗한 1.5ml 마이크로센심분리기 튜브로 옮기십시오. 1:1 직렬 희석을 네 번 수행하여 후속 4점 표준을 생성합니다.
      1. 예를 들어, 혼합 표준의 250 μl에, 원래 농도의 50%에서 혼합 표준을 생성하기 위해 250 μl의 샘플 버퍼 및 소용돌이를 철저히 추가합니다. 원하는 희석이 달성될 때까지 반복프로세스를 반복합니다.
  4. HPLC 시스템(펌프, 자동 샘플러, 역상 컬럼(C18, 150×3.2mm, 3 μm)을 준비합니다. HPLC 시스템의 모든 이전 솔루션을 대체하고 갇힌 기포를 신선한 모바일 단계로 대체하기 위해 신선한 모바일 단계로 펌프를 제거합니다. 자동 샘플러를 4°C로 냉각합니다. 컬럼을 35°C로 데우면 총 압력을 줄입니다.
    1. 전기화학 검출기의 제1 및 제 2 전극에 대해 -150 mV 및 220 mV로 전압을 설정합니다. 적어도 2 h에 대 한 시스템을 평형, 이상적으로 하룻밤, 0.2 ml/min의 유량으로 이동 상.
      참고: 평형 동안 셀이 켜져야 하며 기준선 판독값을 모니터링해야 합니다. 안정적인 판독값은 시스템이 사용할 준비가 되었다는 것을 나타냅니다. 평형 단계의 2 시간 동안 이동 단계가 재순환하는 대신 폐기물 용기로 들어갈 수 있도록 하십시오. 이 기간 이후에는 이동상이 평형을 위해 밤새 재활용할 수 있습니다.
    2. 평형이 완료되면 이동상 유량속도를 0.6ml/분으로 조정합니다. 각 5점 표준에 20 μl을 주입합니다.
  5. 얼음에 striatal 샘플을 해동하고 각 샘플의 2 x 20 μl을 HPLC 시스템에 주입합니다. 각 줄무늬 샘플 집합에 걸쳐 처음부터 무작위로 표준을 활용합니다.
  6. 이 소프트웨어를 사용하여 도파민, DOPAC 및 표준 및 샘플에서 생산되는 HVA 피크 아래 영역을 분석합니다. 보존 시간별 별분과 측정을 통해 피크 아래 영역을 해당 표준에 대해 5점 곡선과 비교하여 측정합니다.
  7. 섹션 5.2.3에 설명된 대로 펠릿 분수를 준비합니다. 줄무늬 펠릿에 로우리 단백질 분석작업을 수행합니다. 참고: 이 분석은 mg/ml의 줄무늬 샘플에 존재하는 단백질의 양을 측정합니다. 이 정보는 알라바이트의 ng/mg 농도를 결정하는 데 사용됩니다.

8. 면역 작용화학

  1. GFAP/TH 이중 면역 형광
    1. -20°C 냉동고에서 단면 중뇌를 함유한 튜브를 제거하고 RT. PBS가 포함된 트레이에서 극저온방부제 용액에서 실질적인 니그라를 함유한 조직 섹션을 제거합니다.
    2. 폴리에스테르 메쉬 하의를 가진 폴리스티렌 인서트에 티슈 섹션을 배치하여 자유 부동 면역 화학작용을 합니다. PBS에서 3 x 5 분 세척하십시오.
    3. 180 μl 블록 솔루션 (5 % 일반 당나귀 혈청, 1 % PVP, 1 % BSA 및 PBS의 0.3 % Triton X-100)을 가진 96 웰 플레이트로 섹션을 전송합니다. RT에서 40분 동안 인큐베이션을 합니다.
      참고: 모든 세척 및 인큐베이션 단계는 셰이커에 가벼운 교반으로 수행됩니다.
    4. 1차 항체 용액을 함유하는 우물로 섹션을 이송한다(웰당 180 μl). 1 차 적인 항체 칵테일, 토끼 안티 GFAP (1:1000) 및 양 안티 TH (1:400) PBS에서 희석 1% BSA 와 0.3% TX-100, 4°C에서 24 시간. 1차 종의 IgG는 부정적인 면역 염색 조절의 역할을 한다.
    5. 이차 항체 칵테일 (1:200 당나귀 안티 토끼 568 및 1:200 FITC 당나귀 항양 PBS0%TX-100)에서 배양하십시오. 호일을 사용하여 준비 및 인큐베이션 중에 빛으로부터 용액을 보호합니다. 2 시간 동안 RT에서 인큐베이션하십시오.
      1. 부정적인 대조를 위해, 1차 항체에 사용되는 것과 동일한 농도로 희석된 1차 종으로부터 IgG의 섹션을 배양한다.
      2. 2 x PBS와 1 x TS를 RT. 마운트 티슈 섹션에서 각각 5분 동안 세척할 수 있으며, Hoechst 얼룩과 커버슬립이 있는 마운팅 매체의 슬라이드를 장착합니다.
    6. 이차 항체 칵테일 (1:200 당나귀 안티 토끼 568 및 1:200 FITC 당나귀 항양 PBS0%TX-100)에서 배양하십시오. 호일을 사용하여 준비 및 인큐베이션 중에 빛으로부터 용액을 보호합니다. 2 시간 동안 RT에서 인큐베이션하십시오.
    7. 2 x PBS와 1 x TS를 RT. 마운트 티슈 섹션에서 각각 5분 동안 세척할 수 있으며, Hoechst 얼룩과 커버슬립이 있는 마운팅 매체의 슬라이드를 장착합니다.
    8. 4°C의 슬라이드 박스에 보관하여 이미징까지 빛과 산화로부터 슬라이드를 보호합니다.
    9. 먼저 음극을 분석하여 형광의 배경 수준을 결정한 다음 형광 현미경 을 사용하여 양성 면역 반응성에 대해 평가하십시오.
  2. 크로마겐 강수량이 있는 이바1 면역히스토케
    1. -20°C 냉동고에서 단면 중뇌를 함유한 튜브를 제거하고 RT. PBS가 포함된 트레이에서 극저온방부제 용액에서 실질적인 니그라를 함유한 조직 섹션을 제거합니다.
    2. 무료 부동 면역 화학을 위해 폴리스티렌 인서트에 조직 섹션을 배치합니다. PBS에서 섹션 3 x 5분 세척하고, 사전 가열된 10mM 구연산 모노하이드레이트, pH 9.0, 80°C를 30분 동안 포함하는 12웰 플레이트에 직접 배치하여 에피토프 검색을 위해 하십시오.
    3. RT에서 20 분 냉각 플레이트. PBS에서 3 x 5 분 인서트 하고 세척할 수 있는 반품 섹션.
    4. 180 μl 차단 용액 (일반 염소 세럼 10 %, PBS의 1 % BSA)을 포함하는 96 웰 플레이트로 섹션을 옮기고 RT에서 40 분 동안 배양하십시오.
    5. 180-μl 희석 1차 항체를 포함하는 우물로 섹션을 이송한다(1%에서 1%BSA-PBS). 4°C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.
    6. 섹션을 삽입으로 전송합니다. 3 x 5 분 PBS를 세척하고 RT에서 1 시간 동안 바이오티니드 이차 항체 (1:200 in 1.5 % 정상 혈청-PBS)를 적용하십시오.
    7. 사용 30분 전에 ABC 솔루션을 준비하십시오. 3 x 5 분 PBS를 세척하고 RT에서 1 시간 동안 ABC 솔루션으로 전송하십시오.
    8. 후드에 DAB 솔루션을 준비합니다. PBS에서 2x 5분, TS에서 1x 5분 세척하고 DAB에서 섹션을 배양합니다.
      1. 3-4 분 동안 개발하십시오. 음수 컨트롤은 색상에 빛을 유지해야 합니다.
        참고: DAB는 알려진 발암물질이기 때문에 연기 후드에서 이 단계를 수행합니다. 오염 제거를 위해 ddH2O에서 0.2M 칼륨 퍼망가네이트의 용액은 우발적 인 드립의 경우 근접하여 유지되어야합니다.
    9. ddH2O에서 섹션을 간단히 헹구고 TS 3 x 5분에서 헹구습니다. 연기 후드에 슬라이드와 공기 건조 하룻밤에 섹션을 마운트합니다.
    10. DdH2O, 소용돌이, 연기 후드에 0.2M 칼륨 퍼망가네이트의 동일한 볼륨으로 DAB 폐기물을 오염 제거한 후 연기 후드에 적절하게 표시된 DAB 쓰레기통에 보관하십시오.
      참고: 표백제 솔루션은 DAB의 돌연변이 특성을 제거하지 않습니다.
      1. 재사용 항목(예: 폴리스티렌 인서트)을 오염 제거하고 세제로 세척합니다.
    11. 크레실 바이올렛 (CV)로 가볍게 탈수 / 카운터 스테인. 모든 탈수/세척 단계는 3분: 에탄올 70%, 95%, 100%, 95%, ddH2O, CV(30초), ddH20 x 2, 95% 에탄올 + 빙하 에이스산(0.1%) x 2, 100% 에탄올 및 자일렌.
    12. 디스티렌 톨루엔 자일렌 장착 매체및 연기 후드의 드라이의 커버슬립.
    13. 가벼운 현미경에 의해 양성 면역 반응성을 관찰하십시오. 1차 종의 IgG는 부정적인 면역 염색 조절의 역할을 한다.

9. 통계

  1. 유전자형과 독성 치료 사이의 차이를 비교하기 위해 유전자형과 양방향 ANOVA 사이의 차이를 비교하기 위해 편차(ANOVA)의 편도 분석에 의해 수단 간의 차이를 평가합니다. ANOVA테스트(p≤0.05)에 의해 차이가 관찰될 때 Tukey의 HSD 포스트 호크 분석을 활용하십시오.
    참고: 실험(n = 6-9 마우스/그룹)은 재현성을 보장하기 위해 최소 2회 수행됩니다.

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결과

이 독소 노출 패러다임은 MPTP- 대 식염수 주입 동물에서 중요하고 검출 가능한 20% 현저도 도파민 고갈을 생성할 수 있습니다. MPTP의 다른 제비는 약간 더 많거나 적은 병변을 얻을 수 있다는 것을 주의하는 것이 중요합니다; 따라서, 더 나은 정밀도를 위해, 신경 독소의 새로운 제비가 이용될 때 형질전환에서 사용하기 전에 야생형 마우스에 있는 예비 실험은 추천됩니다. 온화한 병변의 사용은 간질이 관찰될 수 있는 질유전자의 충격을 허용합니다; 심한 병변은 해로운 유전 적 변화의 효과를 가리기 위해 감쇠 또는 너무 손상에 너무 강력한 부상으로 '바닥 효과'를 생성 할 수 있습니다. TTP가 현저도 도파민에 미치는 영향은 5-LOX 이소지메 결핍 마우스에서 크게 달랐지만, 12/15-LOX 이소지메-결핍마우스(도 1)는아니었다. 더욱이, 이러한 방법으로, 우리는 식염수 처리 마우스의 5-LOX 결핍으로 인해 도파민 수준에 상당한 차이를 분별 할 수 있었다(도 1).<...

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토론

이 유전자 환경 상호 작용 연구의 디자인은 우리가 nigrostriatal 통로에 있는 5-LOX isozyme의 이중 본질에 관하여 새로운 정보를 얻기 위하여 허용했습니다. 5-LOX 이소지메와 그들의 야생형 쓰레기메이트가 결핍된 형질 성 전환기에서 식염수 또는 MPTP 처리 후에 striatal monoamines를 측정하기 위하여 HPLC를 수행해서, 우리는 그것의 결핍이 독성 조건하에서 보호되는 것처럼 보인다는 것을 주의할 수 있었습니다(그림 1),그러나 일반적인 조건하에서, 효소의 부족은 striatal 도파민 수준을 감소시키고 삭제될 수 있습니다. 따라서, 우리는 5-LOX isozyme정상 조건하에서 striatal dopaminergic 음색에 기여한다는 것을 증명할 수 있습니다, 그러나 독성 도전4다음손상에 기여할 수 있습니다.

추가 평가는 NIGrostriatal 독성에서 LOX isozymes의 역할에 새로운 ...

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공개 사항

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감사의 글

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라-하이드로피리딘 하이드로클로라이드(MPTP-HCL)PD 모델링용시그마-알드리치M0896
4% 포름알데히드(파라포름알데히드) 용액, 인산염 완충(PFA)침지 고정을 위한American MasterTech ScientificBUP0157
과염소산 ACS 시약, 70%(PCA)HPLC 산 추출
을 위한 시그마-알드리치 244252조직균질화를 위한시그마-알드리치T1503
에틸렌디아미노테트라아세트산이나트륨염 이수화물(EDTA)조직 균질화를 위한시그마-알드리치E1644
프로테아제 억제제 칵테일균질화를 위한시그마-알드리치P8340
인산가수분해효소 억제제 칵테일시그마-알드리치P5726균질화를 위한
수산화나트륨(NaOH)Sigma-AldrichS5881Lowry 단백질 분석용
자당, 분자 생물학, ≥ 99.5%(GC) Sigma-AldrichS0389동결 보호
인산염 완충 식염수, 분말, pH 7.4 (0.01 M PBS의 경우)Sigma-AldrichP3813IHC
BCA 단백질 분석 키트Pierce/Thermo23225단백질 측정용
Novex 12% Tris-Glycine Mini Gels 1.0 mm, 12-wellInvitrogen/Life TechnologiesEC60052BOXSDS-PAGE
NuPAGE LDS 시료 SDS-PAGEInvitrogen/Life TechnologiesNP0007
 Invitrogen/Life TechnologiesLC5800단백질 사다리
글리신시그마-알드리치G7126SDS-PAGE
소듐 도데실 설페이트, 전기영동, 98.5% (SDS)Sigma-AldrichL3771SDS-PAGE
메틸 알코올, 무수, 시약 American MasterTech ScientificSPM1057C전달용 메탄올
, ACS 시약Sigma-AldrichS9888식염수 및 완충액
무지방 분유 분말Carnationn/a면역 블로팅
Ponceau S 용액 5% 아세트산 블로팅을 위한Sigma-AldrichP7170
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH), 양 polyclonalChemicon/MilliporeAB1542를 위한 면역형광 
안티-티로신 하이드록실라제(TH), 토끼 다클론Pel-Freez BiologicalsP40101-0면역 블로팅
항-&베타; Actin, 면역블로팅Sigma-AldrichA2066
용토끼 다클론Chemicon/MilliporeAB5804
, 마우스 단클론Covance Inc.SMI-22R
Tween-20Sigma-AldrichP1379를 면역 블로팅하는
염소 Anti-Rabbit IgG (H+L), Peroxidase Conjugated를Fisher Scientific31462형
염소 항양, 과산화효소 접합Pierce/Thermo31480면역
염소 항마우스, 과산화효소 접합Pierce/Thermo31430형광
SuperSignal West Pico 화학발광 기판Pierce/Thermo34078블로팅
CL-XPosure 필름 7 인치 x 9.5 인치 면역 블로팅을 위한Pierce/Thermo34089
복원 웨스턴 블롯 스트리핑 버퍼 블로팅을 위한Pierce/Thermo21059
구연산 일수화물, ACS 시약, ≥ 99.0% 그마-알드리치C1909IHC
노멀 당나귀 혈청밀리포어S30-100ML
IHC 폴리비닐피롤리돈(PVP)시그마-알드리치P5288IHC
소 혈청 알부민(BSA), 동결건조시그마-알드리치A3294IHC
트리톤 X-100피셔 사이언티픽BP151-01IHC
당나귀 안티-래빗 IgG, 알렉사 플루오르 568-라벨;Invitrogen/Life TechnologiesA10042IHC
당나귀 안티-양 IgG (H+L), FITC Jackson ImmunoResearch713-095-147for IHC
VECTASHIELD 하드-세트 마운팅 미디엄 DAPIVector LaboratoriesH-1500for IHC
Normal Goat SerumMilliporeS26-100MLfor IHC
VECTASTAIN ABC Kit (Rabbit IgG ) IHC용 Vector LaboratoriesPK-4001; 10 &마이크로; l 1ml PBS 당 용액 A 및 B (지침 당)
DAB Peroxidase Substrate Kit, IHC 용 3,3'-diaminobenzidineVector LaboratoriesSK-4100; 5ml 콜드 ddH2O 당 2 방울 버퍼 스톡 용액, 2 방울 DAB 및 1 드롭 H2O2 (H2 O2 사용 직전에 바로 추가)
과산화수소, 30%Sigma-Aldrich216763IHC
Rabbit anti-Iba1Biocare MedicalsCP290A에서
Cresyl Violet Solution, Regular Strength FD NeurotechnologiesPS102-01Iba1 IHC
95% 에탄올, 시약 알코올Sigma-AldrichR8382IHC
100% 절대 에탄올Mallinckrodt7019-10IHC
아세트산Sigma-AldrichA6283탈수 IHC
XyleneSigma-Aldrich534056투명화 IHC
DPX 마운트Sigma-Aldrich06522마운팅 매체, DAB IHC
O.C.T. 컴파운드 - 냉동 섹션 임베딩 매체용 American MasterTech ScientificEMOCTCS저온 유지 절단 용 EMOCTCS embeddium 배지
과망간산 칼륨 과망간산 칼그마-알드리치223468DAB 용액
도파민 염산염시그마 알드리치H8502HPLC
3,4-디하이드록시페닐아세트산(DOPAC)시그마-알드리치850217
HPLC 호모바닐산(HVA)용 시그마-알드리치HPLCH1252
- 70%HPLC
나트륨 인산이수소 일수화물시그마-알드리치 244252 HPLC71504
HPLC용시그마-알드리치C1909
1-옥탄술폰산 나트륨 염(OSA)HPLC용시그마-알드리치O8380
EDTA시그마-알드리치E1644
HPLC 아세토니트릴EMDAX0145-1HPLC
등급 탈이온수(ddH2O)HPLC 0.22밀리포어
; m GSTF 멤브레인Millipore여과용
Corning NetwellsSigma-Aldrich CLS3477폴리스티렌 인서트와 폴리에스터 메시 바닥, IHC
초음파 세포 파괴자용 (Soniprep 150)MSEMSE.41371.274
마이크로 원심분리기Eppendorf5414R
ESA MD-150 역상 컬럼 ESA
HPLC 펌프(Ultimate 3000)DionexISO-3100BM
HPLC 자동시료주입기(Ultimate 3000)DionexWPS-3000TSL
전기화학 검출기ESACoulochem III
Guard CellESA5020
Analytical Cell, ESA5011A,
Chromeleon 소프트웨어Dionex
Eclipse E400NikonE400광/형광 현미경
일회용 마우스 케이지AncareN10HT
마이크로 필터 상단AncareN10MBT
5-LOX 결핍 마우스The Jackson Laboratory004155
12/15-LOX 결핍 마우스The Jackson Laboratory002778
트리스 베이스 조직 조직 Novex Sharp Prestained Protein Standard용 버퍼 (4x) 염화나트륨 (NaCl) 면역 , Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein(GFAP)용 토끼 , 면역형광 Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein(GFAP)은 위한 것입니다. 면역광 형광 면역 면역면역 시용 담금질 단계를 위한 IHC 탈수 륨 오염 제거 시용 과염소산(PCA)용 시그마-알드리치 용 구연산 일수화물용 시그마-알드리치 µ용 ,

참고문헌

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