세균의 생물 발광 유전자 카세트를 표현하는 포유 동물 세포 ( 룩스) 자율적으로 빛을 생산하고 있습니다. 화학 물질에의 노출에 따라 결과 발광 역학은이 세포에게 쉽게 높은 처리량 자동화에 적용 할 수있는 저렴하고, 연속, 실시간 독성 검사 도구를 만드는 세포의 성장과 신진 대사에 치료 효과를 반영하기 위해 입증되었습니다.
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이 논문에서
요약
초록
포유류 세포 기반 생체 분석에 널리 독성 연구를위한 동물 실험의 대안으로 채택되었지만 인해 반딧불 루시 페라 기반 검사 방법의 파괴 특성에 필요하게되는 병렬 샘플 준비의 높은 금융 및 시간 비용으로 인해 제한되어있다 . 이 비디오는 그 화합물의 세포 독성 효과를 모니터링하기위한 저렴하고 손쉬운 방법으로, 루시페린 기판의 파괴적인 추가를 필요로하지 않는 자율적으로 발광 포유 동물 세포의 활용을 설명합니다. 안정적 전체 세균의 생물 발광 (luxCDABEfrp) 유전자 카세트를 표현 포유 동물 세포는 자율적으로 광 신호를 생성하는 외부 에너지 원, 또는 전통적 시료의 파괴에 의한 비용과 가능한 간섭 루시페린 기판, 여기의 첨가없이 490 nm에서 피크 광학 이미징 절차 동안 수행의. 외부 자극으로부터이 독립 결과 신호 만 활성화 신진 대사 감지 될 것을 의미, 전적으로 셀 발광 반응을 유지하기위한 부담을 배치합니다. 발광 생산의 변화가 세포의 성장과 신진 대사에 악영향을 나타내는 때문에이 특성은 럭스 발현 세포주 세포 독성 효과에 대한 biosentinel로 사용하기위한 최상의 후보합니다. 마찬가지로, 필요한 샘플 파괴의 자율적 인 성격과 부족은 독성 물질 노출의 기간 동안 실시간으로 동일한 샘플의 반복 이미징을 허용하고 자동화 된 방식으로 기존 영상 장비를 사용하여 여러 샘플을 통해 수행 할 수 있습니다.
서론
그들은 식품 의약청 (Food and Drug Administration) 소비자의 사용이 승인되기 전에 미국에서, 인간의 소비를위한 의약품 및 기타 제품은 광범위한 평가를 필요로합니다. 이 테스트를 수행하기위한 재정 부담이 크게 소비자를위한 비용 증가로 새로운 화합물을 개발하기 때문에 번역의 비용을 증가 개발자 1에 배치됩니다. 이 검사 전통적으로 많은 인간의 호스트에 대한 프록시 역할을하는 동물의 과목을 활용했지만,이 (독극물 / ADME 흡착, 분배, 대사, 배설 및 독성에 연간 소요 추정 2,800,000,000달러로, 큰 재정 부담이 될 입증되었습니다 ) 단독 심사 2과 동물 모델을 안정적으로 인간 학적 반응에게 3 예측할 수없는 것을 제안 증거 확보. 따라서 체외 인간의 세포 배양 기반의 테스트 때문에 상대적으로 지난 20 년 동안 인기를 얻고있다비용, 높은 처리량, 그리고 인간의 생체 이용률 및 독성 4의 좋은 표현입니다. 현재 셀 문화 기반의 독성 스크리닝 방법은 세포 생존에게 5을 평가하기 위해, 세포막의 무결성을 프로빙, 또는 미토콘드리아 활동의 수준을 추적, 내생 가능한 세포질 효소의 활동을 심사, 이러한 ATP 수준의 측정 등 다양한 엔드 ....
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프로토콜
1. 세포의 준비
- 액체 질소 냉동 재고 발광 HEK293 세포의 병을 복구하고 Dulbecco의 수정 이글의 10 % 태아 소 혈청과 보충 배지 (DMEM), 0.01 mM의 불필요한 아미노산, 1X 항생제 항진균 및 T 0.01 밀리미터 나트륨 피루브산에서 그들을 성장 37 75 조직 배양 플라스크 ° C와 5 % CO 2.
참고 : 미디어 및 보조 구성 요소는 세포 라인에 따라 달라질 수 있으므로 그에 따라 선택해야합니다. - 새로 고침 중간마다 도달 할 때까지 2~3일 ~ 80 % 합류.
참고 : 필요한 세포의 양이 실험 설계를 기반으로합니다. 필요한 경우, 더 많은 세포를 계대 배양하여 얻을 수 있습니다. - 테스트를 위해 수확 세포.
- 매체를 제거하고 인산염 세포를 씻어 부드럽게 플라스크를 소용돌이 후 폐기 PBS를 소비하여 식염수 (PBS)를 버퍼.
- 2 분 동안 37 ° C에서 트립신과 부화를 추가또는 셀 때까지 플라스크에서 분리했다.
- PBS에서 분리 된 세포를 수집하고 깨끗한 원심 분리기 튜브로 전송할 수 있습니다.
참고 : nonadherent 세포 라인을 원심 분리하여 별도의 셀을 사용하고 PBS로 한....
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결과
본 연구에서는 autobioluminescent HEK293 세포의 역학은 항생제 노출 (그림 1)에 대한 응답으로 24 시간 동안 지속적으로 감시 하였다. 에 바인딩하고 DNA 13 쪼개서 살아있는 세포를 죽이는 것으로 알려져 블레오 마이신 가족의 구성원이 항생제의 독성 효과는 사색 이미지를 직접 시각화 할 수있는 치료 세포에 비해 발광 생산 감소를 통해 입증되었다 (그림 2). 다양한 처리 조건 하에서 시료의 반복 병렬 검사를 허용 이러한 세포의 autobioluminescent 성격은 쉽게 용량 - 반응 분석을위한 어떤 주어진 시점에서 서로 다른 농도의 비교를 허용했다. 예를 들어, 생물 발광은 증가하고 항생제 치료 resul로 보여주는 그림 3에서 화학 물질의 농도에 대하여 플롯되고, 15 일 이후 세포에서 18 시간, 치료의 20 시간을 시간을 생산용량 - 반응 방식으로 발광 생산의 감소 테드.
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토론
이 방법은 살아있는 세포가 지속적으로 자신의 일생을 통해 모니터링 할 수 있습니다 체외 독성 스크리닝 검사에서와 같은 자율적으로 발광 포유 동물 세포를 사용하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 유연하고 필요에 따라 특정 실험 조건에 맞게 수정할 수 있습니다. 예를 들어, 실험은 급성 독성을 추적에 적합 여기서 제시하지만, 반복적으로 증가 시간 간격 (예 : 매 24 시간)에서의 영상 간의 표준 배양 조건에서 세포를 유지하여 천천히 연기 또는 장기 효과를 평가하기 위해 적용 할 수 있습니다 독서. 또한, 통합 시간은 발광 세포 라인에 따라 조정할 수 있습니다. 다양한 통합 시간과 영상의 예비 실험은 최적의 읽기 창을 결정하기 위해 수행 할 수 있습니다. 이 예제에 사용 된 10 분 통합은 모든 트리트 걸쳐 발광 생산의 동적 범위를 강조하기 위해 선택되었다T 조건은, 그러나 짧은 독서 프레임은 애플리케이션에 따라 적용 할 수 있습니다. 24 - 웰 플레이트이 예제에서는 데모에 사용.......
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공개 사항
DM 닫기, SA RIPP 및 GS Sayler 490 생명 공학, 주식 회사의 설립자 및 소유자이다
감사의 글
이러한 연구 노력은 화학, 생물, 환경, 보너스 번호 CBET-0853780 및 CBET-1159344 및 건강의 국립 연구소, 환경 건강 과학 국립 연구소 (NIEHS)에 따라 전송 (CBET) 시스템의 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 부문에 의해 지원되었다 보너스 번호 1R43ES022567-01, 그리고 국립 암 연구소, 보너스 번호 CA127745-01에 따라 암 이미징 프로그램에 따라. 이 연구에서 사용 된 IVIS 루미나 계기는 미국 육군 국방 대학 연구 계측 프로그램에서 얻은 것입니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| IVIS Lumina | PerkinElmer | 다른 IVIS 모델 및 PMT 기반 플레이트 리더도 사용할 수 있습니다 | |
| Living Imaging 2.0 | PerkinElmer | 이 소프트웨어의 최신 업데이트를 사용할 수 있습니다 | |
| 75 cm2 세포 배양 처리 플라스크 | Corning | 430641 | |
| 6-well tissue culture treated plates | Costar | 07-200-83 | |
| 블랙 24웰 플레이트 | Greiner Bio-One | 662174 | 96 또는 384웰 플레이트는 처리량이 높은 응용 분야에 사용할 수 있습니다 |
| 인산염 완충 식염수 | Hyclone | SH30910 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM), 페놀 레드가 없는 | Hyclone | SH30284 | |
| 소 태아 혈청 | Hyclone | SH3091003 | |
| Nonessential 아미노산, 100x | Life Technologies | 11140050 | |
| 항생제-항진균제, 100x | Life Technologies | 15240062 | |
| 피루브산 나트륨, 100mM | Life Technologies | 11360070 | |
| Zeocin, 100mg/ml | Life Technologies | R25001 | |
| Tripsin, 0.05% | Life Technologies | 25300062 |
참고문헌
- U.S. Food and Drug Administration. Is it really FDA approved? FDA Consumer Health Information. 2, (2009).
- Hartung, T. Toxicology for the twenty-first century. Nature. 460, 208-212 (2009).
- Olson, H., et al.
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