엑소 정량화 및 크기 측정을위한 혁신적인 방법

순환하는 엑소 좀의 정확한 기능은 장기간 동안 알려지지 남았다. 지금도 엑소 좀의 전체 경로 메커니즘은 완전히 이해되지 않습니다. 엑소 좀을 가지고 있기 때문에 항원 단백질과 원산지 그들의 부모 세포, 세포 - 세포 신호 송신기로 그 기능에 관한 RNA (mRNA와 miRNA의)를 중심으로 우선 순위를 부여하고있다.

많은 다른 방법은 분리 및 ^1,2- 엑소 좀의 정량적 검출을 위해, 문헌에 기술되어있다. 그러나, '황금 표준'에 대한 합의에 도달 없습니다. 한편 엑소의 연구 분야에서 활동 과학자의 대부분은 격리의 일관된 방법은 매우 다른 보고서와 연구 사이의 비교의 높은 수준을 달성하기 위해 보증에 동의합니다.

형광 활성화 세포 분류 (FACS)는 엑소 분석 ³ 가장 일반적이고 널리 도구이다. FACS는 벤있다형광 라벨을 통해, 상이한 기원의 세포가 하나의 단계에서 비교 될 수있다을 더할. FACS의 주요 단점은 더 적은 크기를 측정하기 위해, 엑소 좀은 직경 ⁵ 30 ~ 120 nm의 사이에 일반적으로 반면이 방법은, 입자보다 작은 0.5 μm의 ^4를 식별 할 수있을만큼 민감하지 점이다.

주사 전자 현미경 (SEM) 및 투과형 전자 현미경 (TEM)은 입자 크기 및 형태의 엑소 좀의 다른 분석을위한 도구이다. 그러나, SEM 및 TEM 모두 샘플의 준비 시간이 많이 소요, 두 방법 모두 노동 집약적 인 단계를 포함 할 수있는 단점을 가지고 각각의 이슈 생성 될 위험이있다. 어느 방법은 높은 시료 처리 한 시료의 단일 입자의 수​​천의 특성에 적합하다. 더욱이, 샘플이 종종 임상 일상 용 정량 분석​​은 매우 짧은 기간에 동시에 또는 적어도된다 분석 할수행하기 어렵다. 차세대 기술은 지금 우리가 이전에 집중적 인 준비 작업 (예를 들어, 환경 SEM)없이 엑소 좀을 분석 할 수 있습니다. 이러한 최신 기술은 여전히 평균 개수 및 크기 ^분포를 결정하기 위해 ⁶ 엑소 좀을 대량 함유 현탁액을 분석 오히려 불편하다.

시각화 및 엑소 좀 분석을위한 또 다른 매우 중요한 방법은 나노 입자 추적 분석 (NTA)입니다. 이 방법은 물리학의 두 가지 원칙을 활용합니다. 먼저, 입자들이 레이저 빔이 조사 될 때 빛 산란에 의해 검출된다. 두 번째 현상은되는 따른 액체 현탁액 중의 입자들의 상이한 확산의 크기에 반비례하는, 브라운 운동으로 알려져있다. 후자의 경우, 이동도의 온도 및 액체의 점성에 의존한다. 그러나, 이러한 속도는 직접 입자 크기와 관련이 NTA에 의해 사용된다. 부드러운 사용웨어 기반의 분석은 단일 입자 산란광의 디지털 이미지가 기록됩니다. 산란 광 스폿의 플롯과 그들의 모션의 속도는 입자의 총 개수 및 크기 분포의 결정을 용이하게 데이터를 제공한다. 이 기술은 100nm 이하의 평균 입자 직경을 분석하는데 특히 강력하다.

크기와 농도 측정은 ZetaView 브라운과 전기 영동 모션 비디오 분석 현미경으로 수행됩니다. 이것은 (이하, 입자 추적기구 라 함), 액체 시료 반자동 탁상 나노 분석 도구이다. 이는 입자 분석기 추적뿐만 아니라, 데이터 분석에 사용되는 소프트웨어 노트북 이루어져있다. 이기종 생물학적 시료는 무기 입자의 더 균일 한 현탁액으로이 방법으로 적합하다. 비디오 카메라와 레이저 산란 현미경은 입자의 검출 및 obse에 사용그들의 운동의 rvation. 현미경 축이 수평 및 엑소 좀을 함유하는 현탁액으로 채워진 셀 채널에 초점을 맞추고 있지만, 레이저 빔은 수직 배향된다. 현미경 (도 1)를 통해 디지털 비디오 카메라에 의해 90 ° 아래에 기록되어, 레이저 광의 산란에 의해 조사 된 입자. 산란광 강도는 60 나노 미터보다 큰 입자 지름의 관찰을 허용한다. 이러한 설정에서 입자의 밝기 입경 용임 아니다. 어떠한 전계가인가되지 않는 경우, 입자 운동은 브라운 운동을 다음과 입경을 산출 지표로서 역할을 할 수있다. 그러나, 장비는 또한 셀의 채널을 가로 질러 전기장을인가 할 수있다. 이 필드를 실시 할 때, 전위, 극성 및 현탁 엑소 좀의 이온 전하의 레벨은 이동 방향의 상기 결정된다. 전기 영동 개월의 속도와 방향 결과내구 히스토그램.

고립 된 엑소 좀을 분석 할 수있는 최적의 방법을 찾는 것이 하나의 문제이지만, 또 다른 하나는 혈액, 복수, 소변, 우유, 양수 또는 세포 미디어 등 다양한 매체에서 엑소 좀의 효과적인 분리에있다. 다른 방법은 초 원심 ^(1)에 기초하는, 지금까지 설명되었다 (예 Exoquick 등) 산업 분리 시약 ^{(7), (8)의} 분리 또는 한외 여과를 이용한 항원 자성 비드 ^{9 단계.}

이 프로토콜에서는 초 원심 분리를 통하여 엑소의 전체 과정을 설명하고, 입자 트래킹기구를 통해 현탁액을 함유하는 생성 된 엑소 좀을 분석하는 방법을 보여준다. 인간 혈장 또는 세포 배양 배지 유래 엑소 좀의 분석에 대한 구체적인 고려 사항이 제공됩니다.

참고 :이 작업에 제시된 실험 뒤셀도르프 대학의 기관 윤리위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 엑소 준비

1. (9 ml의 총) 정맥 천자를 통해 3 구연산 튜브에 전혈을 수집합니다. 15 ㎖의 팔콘 튜브에 혈액을 붓고.
2. 플라즈마에서 세포의 분리를 시작하기 위해 4 ° C에서 20 분 동안 1,500 XG에서 샘플을 원심 분리기. 새로운 15 ㎖의 팔콘 튜브에 뜨는을 전송합니다.
3. 플라즈마에서 (; CFP 무 세포 플라즈마를) 모든 세포를 제거하기 위해 4 ° C에서 20 분 동안 2,800 XG에서 샘플을 원심 분리기. 초 원심 튜브, 튜브 당 1 ml의 CFP를 전송합니다.
4. 4 ° C에서 90 분 동안 10 만 XG에 원심 분리기 엑소 좀을 소모합니다. 상층 액 900 μl를 제거합니다. 초 원심 분리 튜브에 남아있는 100 μL에 펠릿을 다시 일시. 900 μl의 PBS를 추가합니다.
5. 원심 분리기 다시 4 ℃에서 30 분 동안 10 만 XG에. SU 900 μl를 제거pernatant. 나머지 100 μL로 펠렛을 다시 일시.
6. 전송 증류수 40㎖의 재 현탁액의 5 내지 20 μL. 큰 입자에서 엑소 좀을 분리하는 450 nm의 필터를 통해 서스펜션을 필터링합니다. 입자 측정을위한 마지막 정지를 사용합니다.

입자 추적 장비 2. 시작 절차

1. 소프트웨어 아이콘을 두 번 클릭하여 프로그램을 시작합니다. 다양한 소프트웨어 탭을 클릭 ( "셀 확인", "측정", "분석") 프로토콜을 통해 그들 사이를 전환합니다.
2. 시작 절차의 자동화 구현을 위해 화면의 지시 사항을 따르십시오. 셀 품질 검사 및 자동 정렬 모두에 대한 상자를 선택합니다.
   참고 :이 단계 중 하나가 "셀 검사 '탭 버튼 (A) 또는 (B)를 눌러 별도로 필요하다면 반복 될 수있다.
3. NTA 악기의 입구와 출구 포트를 열고 10m를 주입L은 유입구를 통해 채널 내로 세포 주사기로 증류수. 물의 양은 마지막 주입됨에 따라 출구 포트를 닫고. 폐액을 수집 출구에서 비커를 놓습니다. 측정 셀은 기포가 없는지 확인하고 시스템에 공기 방울을 주사기하지 않습니다. 바로 입구 포트를 닫습니다.
4. "OK"를 클릭하여 셀 품질 검사를 수행합니다. 소프트웨어는 몇 초 후에 셀 품질의 결과를 표시한다.
5. 모든 입자는 여전히 소프트웨어의 라이브 뷰 화면에 시각화 또는 품질 검사의 결과 만 좋거나 나쁜 경우, 나머지 입자까지 반복 스텝 2.3은 측정 셀로부터 제거하는 경우. 또한 입자의 축적을 방지하기 위해 각 측정 후 단계 2.3를 반복합니다. 증류수 주입을 반복하고 세포 검사하는 "좋은"결과를 얻을 수없는 경우에는, 2.9로 진행.
6. 균일 한 200 nm의 크기를 포함하는 POL 제어 현탁액을 제조ystyrene 입자를 레이저 현미경의 초점을 정렬하는 데 사용된다. 600 ± 100 입자가 라이브 뷰 화면 당 표시되도록 필요한 농도를 얻기 위해, 500㎖의 증류수에, 기기 제조업체에서 제공 현탁액 농축 한 방울을 추가.
7. 단계 2.3에 기재된 바와 같이 NTA 구에 정렬 현탁액을 주입한다. "OK"를 누르면 자동 정렬 시스템이 자동으로 두 초점의 최적 위치를 찾을 통해 자동화 된 루틴을 시작합니다.
8. 프롬프트는 시스템을 알리는 표시되면 측정을 시작하려면 확인을 클릭 이제 실험 준비가 된 것입니다.
9. 때때로, 에탄올 30 % 용액으로 세포를 세척하여 실험간에 수동으로 셀 채널을 청소. 소프트웨어가 자동으로 오류 보고서를 표시 할 때마다 채널을 청소합니다.

샘플 3. 측정

1. EA 전에 증류수 채널 플러시(단계 2.3에 기재된 바와 같이) CH 시료 측정.
2. 단계 2.3에 설명 된대로 채널에 (섹션 1에서 제조 된) 엑소 현탁액을 주입한다.
3. 필요에 따라 소프트웨어의 다음과 같은 주요 매개 변수를 조정합니다
   1. 감도. 최적의 감도 범위를 찾기 위해, 서로 다른 감도 레벨 화면마다 측정 입자의 곡선을 표시하려면이 단추 "감도 대 입자의 수​​"를 클릭합니다. 곡선의 최대 기울기 전에 감도 레벨을 선택했다. 감도가 높을수록 레벨이 더 작은 입자의 시각화 할 수 있습니다뿐만 아니라 배경 잡음 관련된 문제를 증가시킨다.
   2. 최소 밝기. 엑소 측정 필터로서이 기능을 사용하기위한 (20)의 출발 밝기를 선택했다. 밖으로 빈 강하게 광산란 입자까지이 매개 변수를 조절한다. 유물을 산란 약하게 증폭 아래로 조절한다. 실험을하는 동안 필요에 따라 밝기가 달라집니다.
      참고 : 라이트 - 입자너무 강하게 중첩 캐터 실수로 분석에서 제외 될 수있다.
   3. 최소 및 최대 크기입니다. 최소 및 최대 크기를 조절함으로써, 대형 입자 화소 불필요한 잡음을 제거하기 캐터 디지털 필터를 설정한다. 엑소 좀의 측정 10~500 화소의 범위를 사용한다.
   4. 셔터. 카메라가 1/300 초에 열려있는 기간을 조정합니다.
4. 읽어 매개 변수를 라이브 :
   1. "라이브 이미지"버튼을 클릭하여 임의의 지점에서 디지털 및 아날로그보기 잠정 사이를 전환합니다.
   2. 전체 실험에​​서, 색상 코드 지표로 시료의 포화 상태를 표시 산란 강도 막대를 모니터링. 산란 줄이 빨간색 인 경우 엑소 좀을 분석하지 마십시오. 이러한 경우에 더욱 이러한 현상을 피하기 위해 샘플을 희석. 실험 조건 시험 용액의 조작을 금지하는 경우, 감도를 하향 조절 또는 소프트웨어 (S)의 휘도를 조절-ettings는 측정 결과를 향상시킬 수있다.
      참고 : 입자의 매우 높은 농도의 시료를 분석 할 때 분산은 개개의 입자를 융합하고 그들은 하나의 단일 입자로 계산됩니다.
   3. 디스플레이에서 시야에서 계산 된 입자의 개수를 참고.
5. "측정"탭을 클릭합니다.
6. "실행 옵션"배열의 설정을 선택합니다.
   1. 각 인수하기 전에 반복 체크 입자 드리프트 테스트 "체크 운동 '을 선택합니다. 전체 분석을 시작하기 전에 한 번 이상 테스트를 수행합니다. 드리프트가 20㎛보다 높은 / 초이면, 샘플은 흐르지 않게되도록 측정을 계속하기 전에 대기.
   2. 실험 번호 (5)과 이들 사이의 시간 지연 (0)를 선택한다.
   3. "샘플 검사 '(필요한 경우)를 수행합니다. 이 시험은 시동 절차의 자동 정렬의 일부이며 나중에 필요에 따라 반복 될 수있다.
   4. 마지막으로 "실행 영상 획득"버튼을 클릭합니다. 새로운 윈도우에서, 사이클의 수 (15) 및 측정 위치의 수 (11)을 정의한다.
      주 : 레이저 헤드와 현미경이 상이한 위치 (11) 입자 수를 분석하기 위해 이동 될 수있다. 실험 수요에 따라, 실험에 하나의 단일 위치 또는 다른 위치에서 수행되어야하는지 여부를 결정한다.
      1. 입자 비디오 해상도 (저)를 설정하여 하나의 개별 입자로 간주 될 찾아 갈 필요가있다 최소 지속 시간을 확인한다. 더 짧은 지속 시간 트래킹 저해상도 결과.
      2. 파일 이름을 선택하고 측정을 시작하려면 "OK"를 클릭합니다.

   결과 4. 해석

   1. "결과"탭을 측정 한 후 표시하면 다음과 같은 결과와 매개 변수를보기 : 추적 입자의 (1) 총 번호, 부품 (2) 평균 수위치, 및 (3) 입자 농도 당 icles.
      1. 입자 수의 비율로 입자 크기 (직경, 표면 및 체적)의 비율에 대한 수치 결과 평균 테이블을 볼뿐만 아니라 평균 및 표준 분화의 값.
      2. 하나 이상의 피크가 그래픽 분석에있는 경우 피크 분석 테이블을 사용합니다. 이 표는 각각 제 2 피크 또는보다 작은 입자의 분포를 나타낸다.
   2. 크기에 따라 입자의 분포를 확인하기 위해 측정 한 후 계산 된 그래프를 볼 수 있습니다. 설정을 변경하는 표시 모드와 그래프 위의 아이콘을 사용.

이 데모에 사용 된 샘플은 85 %의 민감도, 감도 곡선의 최대 기울기 전에 (그림 2)와 측정을위한 최적의 설정을 보여줍니다. 프로토콜에서 권장하는대로 밝기, 분 / 최대 값이 선택되었다. 5.3 입자의 농도 / ㎖ X 입자의 평균 크기는 대부분이 0.137 μM의, 0.149 ㎛, 10 (6) 동안 측정 하였다.

측정 이후에 접수 된 값은 .pdf 인 파일 형식 또는 데이터베이스로 내보내기위한이 .txt로 보고서에 저장할 수 있습니다. 바람직한로서 프로토콜 (섹션 4)에서 기술 된 바와 같이 그래프가 조정될 수있다. 비디오 시퀀스는 저장되고 나중에 오프 - 라인 분석을 위해 다시 사용될 수있다. 하지만, 이러한 오프 - 라인 분석에서, 카메라의 사전 설정 취득 향적 변경할 수 없다.

측정을위한 최적의 파라미터 설정을 찾기 위해, 여기 설명 토륨100 nm의 폴리스티렌 표준 크기의 예에 장비 설정의 예를 최적화. 두 파라미터, 영상​​ 및 입자 크기 분포에 감도 및 최소 / 최대 크기의 영향을 상세하게 설명한다. 다른 모든 파라미터는 표 1에 요약되어있다.

아날로그 및 디지털 이미지에서 (50-94 범위)의 감도의 영향을 시각적 인상도 3에 가시화된다. 이미지로부터 유도 된 정량 정보는 표 1의 설정에 따라,도 4에 제시되어, 최소 사이즈 = 도 5 및 최대 크기 = 200 감도 대 검출 입자 수의 전형적인 관계는도 4a에 도시된다. 50과 90 사이에 감지 입자의 수​​는 감도 증가 90> 민감도에 대한 극적으로 상승했다. 감도의 최적 범위는 66, 86 (A) 사이에서 발견되었다. 입도 분포는 DIF 얻어ferent 감도 설정도 4b에 표시됩니다. 입도 분포는 세 개의 개별 측정의 평균을 나타낸다. 오히려 가난한 통계 결과 몇 입자를 분석 하였다 너무 낮은 감도 (감도 = 62, 빨간색 곡선)를 참조하십시오. 분석 입자의 수​​는 민감도 증가 70 (노란색 곡선)과 86 (황갈색 곡선) 사이의 최적에 도달했습니다. 또한 작은 크기 (감도 = 94, 파란색 곡선)을 향해 이동 적하 입자 크기 분포의 개수 입도 분포의 열화 감도 이루어져.도 4c의 수를 기반 X50 직경의 추이 (50 %를 나타낸다 입자는 감도 함수로서)이 직경보다 작다. 적색 영역이 불량 통계 (감도가 너무 낮음) 또는 넓은 DISTRI의 결과> 8 % RSD 나타내는 베이지 간격에서, 입자 크기의 RSD는 8 % 이하이고 A.에서 최적 간격에 해당작은 크기 (감도 너무 높은)에 시프트 시킴.

최소 크기, 최대 크기의 설정은 최소 크기보다 작고 최대 크기보다 큰 스폿 크기를 갖는 입자를 제거하기 위해 디지털 영상에 적용되는 필터이다. 빛을 산란 할 수있는 기능으로 인해 입자는 디지털 이미지에 특정 크기의 자리를 만듭니다. 스폿의 크기는 다수의 화소 (PX)로 측정된다. 입자가 아주 잘 (예를 들면, 입자> 200 nm의 또는 집계를) 빛을 산란 할 때, 그 자리 크기는 예를 들어,> 500 픽셀, 아주 큽니다. 스폿 크기는 입자 물질에 따라 작은 입자 (예를 들면, <20 ㎚)에 대한 (예를 들면, <10 PX) 확실히 작다. 그들이 동일하지 않은 이들 두 변수 사이에 직접적인 관계가 없기 때문에 스폿 사이즈 (PX)의 입자 크기 (㎚)로 상호 교환 될 수 없다. 최소 및 최대 크기의 최적화는 사용자가 응집체 (최대 크기) 또는 원하지 않는 작은 물체를 필터링 할 수 있도록이러한 배경 잡음 (최소 사​​이즈) 등의 개체. 100 nm의 표준 크기의 입자 크기 분포의 최대 / 최소 크기의 영향도 4d (감도 = 82)에 도시된다. 간격이 작은 스폿 크기로 설정되어있는 경우 (예를 들면, 분 = 1, 최대 = 52 주황색 곡선), 분석 된 입자의 수가 감소하고 개수를 기반 X50 직경이 약간 작은 크기쪽으로 시프트된다. 큰 반점의 설정 (분 = 40, 최대 = 1000; 붉은 곡선) 넓은 입자 크기 분포의 결과는 큰 크기를 향해 이동했다. 입자의 총 동일한 번호를 얻기 위해서, 오렌지 및 레드 모두 분포 구간 경계는 입자 (80)과 일치하도록 조정 하였다. 최적의 설정으로 분포 (분 = 5, 최대 = 200; 황갈색 곡선은) 360 입자로 구성되어 있습니다.

성공적인 일련의 실험 엑소 좀 초 원심 분리에 의해 단리하고 제시 NTA 시스템을 사용하여 측정하여 수행 하였다. 결과 데이터는 고도로 있었다일관성과 재현성의 높은 수준을 확인했다. 다른 분리 방법은 비슷한 결과를 보여 주어야한다. 그러나, 희석 단계는 특히 중요한 단계로서 식별하고, 산출 된 입자의 총 수에 미치는 영향을 재평가 할 수있다.

NTA의 설정 그림 1. 도식. 현미경 / 비디오 축과 레이저 빔은 셀 채널 단면에서 횡단 서로 직교하도록 배향된다. 입자에 의해 산란 빛이 소프트웨어의 "라이브 뷰"창에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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라이브 뷰 화면에서 입자의 아날로그 및 디지털 이미지. 시각화에 감도 그림 3. 영향은 모두 아날로그 (맨 윗줄) 50과 94 사이의 감도 표시됩니다D 디지털 (아랫 줄) 전망. 감도가 너무 낮 으면, 단 몇 입자 (왼쪽) 검출된다. 최적의 감도에서 입자는 서로 잘 (가운데)로부터 격리로 하나의 점을 나타납니다. 비교적 높은 감도 입자가 함께 이미지 품질 (오른쪽)로 이어지는 병합에. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

제어 100 nm의 폴리스티렌 입자 샘플에 대한 민감도 최소 및 최대 크기 설정 그림 4. 영향 (A) 입자의 검출 수 대비 감도의 플롯.; 최적의 간격은 66-86 곡선의 최대 기울기에 앞서있다. (B) 입자 크기 분포는 여러 감도 설정 (62 94에 얻을); (62)이 너무 낮거나 너무 높은 대한 그래프 (94) 감도는 100 nm의 폴리스티렌 대조 시료에 대한 입도 분포를 포착하지 않는다. (C) 감도 대 번호 X50 기반 직경; 베이지 간격 X50의 오차는 8 % 이하가 최적의 간격 (66)에서 입자 크기 분포에 대한 최소 및 최대 크기 (86)의 (D)에 영향이다; 최적의 매개 변수 (분 = 5, 최대 = 200) 제어 샘플에 대한 정확한 분포를 캡처합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

입자 추적 장비의 설정에 대한 사전 및 사후 인수 매개 변수 표 1. 개요.

이 작업은 HHU 의과대학 심혈관외과의 기관 기금으로 지원되었습니다. 이 연구의 출판 비용은 Particle MetrixGmbH에서 제공했습니다.