방법 논문

야생 동물의 기생충 수집 및 식별

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⸱

DOI:

10.3791/51000

⸱

2013년 12월 14일

 , 
1Department of Forestry and Natural Resources, Purdue University, 2Helm West Laboratory

이 논문에서

요약

야생 동물은 일반적으로 다양한 기생충에 의해 기생합니다. 기생충의 네 가지 주요 유형은 "회충"(선충), "가시 머리 벌레"(acanthocephalans), "흡충"(trematodes) 및 "촌충"(cestodes)입니다. 여기에서는 척추 동물에서 기생충을 수집하는 방법과 그들이 어떻게 보존되고 분류학적으로 식별되는지에 대해 설명합니다.

초록

야생 동물은 일반적으로 다양한 기생충에 의해 기생합니다. 기생충의 4가지 주요 유형은 "회충"(선충), "가시 머리 벌레"(acanthocephalans), "흡충"(트레마토데스) 및 "촌충"(cestodes)입니다. 기생충을 수집하는 최적의 방법은 대부분의 기생충이 아직 살아 있기 때문에 4-6시간 이내에 죽은 숙주를 검사하는 것입니다. 철저한 부검을 실시하고 모든 주요 장기를 검사해야 합니다. 장기는 흐르는 물에 106μm 체로 세척하고 실체 현미경으로 내용물을 검사합니다. 모든 기생충이 계산되고 대표 숫자가 고정됩니다(70% 에탄올, 10% 완충 포르말린 또는 알코올-포르말린-아세트산). 종 식별을 위해 기생충은 락토페놀(선충 및 작은 아칸토세팔란)에서 제거되거나 Harris의 헤마톡실린 또는 Semichon의 카민을 사용하여 염색(트레마토데스, 세스토데스 및 큰 아칸토세팔란)됩니다. 기생충은 다양한 구조(예: 선충의 수컷 스피큘 또는 세스토데스의 장미꽃)를 검사하여 종의 열쇠가 됩니다. 여기에 설명된 프로토콜은 모든 척추 동물에 적용할 수 있습니다. 그들은 다른 장기를 인식하고 다른 조직 파편이나 내장 내용물과 기생충을 구별할 수 있는 능력에 대한 약간의 전문 지식이 필요합니다. 수집, 보존 및 염색은 최소한의 장비와 시약이 필요한 간단한 기술입니다. 특히 종에 대한 분류학적 식별은 시간이 많이 소요될 수 있으며 전문가 또는 DNA 분석에 표본을 제출해야 할 수 있습니다.

서론

척추동물은 4개의 주요 기생충(벌레) 그룹에 의해 기생합니다. 그 중 두 그룹, 즉 trematodes 또는 flukes와 cestodes 또는 촌충은 Phylum Platyhelminthes에 속합니다. 다른 두 그룹은 선충 또는 회충 (Nematoda)과 acanthocephalans 또는 가시 머리 벌레 (Acanthocephala)입니다. 이러한 기생충의 대부분은 야생 조류와 포유류의 질병 및 사망률의 원인으로 기록되어 있습니다1,2.

대부분의 기생충은 하나 이상의 숙주를 포함하는 복잡한 수명주기를 가지고 있습니다1,2 . 예를 들어, 트레마토데스에는 하나 또는 두 개의 중간 숙주(보통 무척추동물)와 최종 숙주가 있습니다. 모든 숙주는 주기가 완료되기 위해 사용 가능해야 하며, 따라서 성충이 최종 숙주에 존재할 수 있어야 합니다(이 원고의 주제입니다). 따라서 일부 기생충 종의 유병률과 강도에 계절적 변동이 발생할 수 있음을 명심하는 것이 중요하며 특정 숙주의 기생충을 완전히 포착하기 위해서는 장기적인 모니터링이 바람직합니다.

기생충을 채취하는 최적의 방법은 안락사된 숙주를 검사하는 것입니다. 이것은 기생충이 아직 살아있는 동안 모을 수 있게 해주고 적절한 휴식과 고정을 가능하게 합니다. 죽은 지 24시간 이상 지났거나 검사를 위해 냉동 및 해동된 숙주의 물질은 종종 품질이 떨어지고 식별하기 어렵습니다. 얼어붙거나 공식화된 숙주에서 유래한 트레마토데스(trematodes)와 세스토데스(cestodes)는 종종 심하게 수축되어 있으며, 트레마토데스(trematodes)의 구강 가시(oral spines) 또는 촌충의 스콜렉스(scolex)에 있는 갈고리와 같이 식별에 중요한 구조를 잃어버렸습니다. 그러나 현실은 요즘 척추동물 숙주에서 구할 수 있는 대부분의 물질이 얼거나 보존되어 있다는 것입니다.

기생충에 대한 DNA 염기서열 정보를 포함하는 데이터베이스는 빠르게 성장하고 있으므로 이미 많은 종에 대한 분류학적 식별이 가능합니다. 따라서 잠재적인 DNA 분석을 위해 기생충을 가능한 한 많이 보존해야 합니다. 그러나 표본이 포르말린에 고정되어 있으면 좋은 품질의 DNA가 불가능합니다. 기생충을 수집하고 죽이기 위해 여기에 설명된 방법은 DNA 추출 및 유전자 분석에 적합한 물질을 얻을 수 있습니다.

아래에서는 기생충 채취를 위해 척추동물(양서류, 파충류, 조류 및 포유류, 어류의 단일유전자 트레마토드는 포함되지 않음)을 부검하는 방법에 대한 자세한 방법을 설명한 다음 분류학적 식별을 위해 이를 보존하고 처리하는 방법에 대한 절차를 설명합니다.

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프로토콜

다음 실험에 사용된 동물들은 로드킬로 죽은 채로 발견되었다.

1. 기생충 채취를 위한 동물 부검 및 주요 장기 스크리

닝
  1. 동물을 평평한 표면에 놓고 돋보기로 귀, 구강 및 눈을 포함한 모든 외부 개구부를 검사하여 선충(원형)과 트레마토즈(평평하고 분절되지 않음)의 존재 여부를 확인합니다(그림 1 참조).
  2. 새와 함께 작업하는 경우 해부하기 전에 깃털을 적셔 수돗물로 씻으십시오.
  3. 날카로운 칼날이나 칼을 사용하고 한 쌍의 절개 집게를 사용하여 장기가 파열되지 않도록 주의하면서 복강을 절개합니다. 딱딱한 갑각을 가진 거북이의 경우, 휴대용 톱을 사용하여 가슴과 복부 사이의 다리 부위에서 뼈를 자릅니다.
  4. 위와 같이 흉강을 엽니다. 큰 동물의 경우 갈비뼈를 절단하기 위해 뼈 절단기나 작은 휴대용 톱이 필요할 수 있습니다.
  5. 새와 함께 일하는 경우 장기를 제거하기 전에 현장에서 공기 주머니를 검사하십시오. 필요한 경우 돋보기를 사용하십시오.
  6. 양쪽 충치에 filarial 회충과 큰 trematodes가 있는지 검사합니다.
  7. 복강에서 위장관을 제거하기 전에 식도의 시작 부분에 실을 묶고 대장(직장) 끝에 다른 실을 묶습니다.
  8. 실체 현미경(10-30X)으로 검사할 수 있도록 다음 흉부 장기를 페트리 접시(또는 장기가 너무 큰 경우 유리 쟁반)로 분리합니다: 심장 및 주요 혈관, 기관 및 폐.
  9. 간, 담낭 및 관, 췌장, 비장, 신장 및 방광을 제거하고 1.8단계에 설명된 대로 검사합니다.
  10. 완전한 소화 시스템을 제거하고 각 섹션을 유리 접시/트레이에 넣습니다.
  11. 장기를 제거한 후 0.9% 식염수를 채운 호스나 분무기로 체강을 106μm 메쉬 체에 세척하고 실체 현미경으로 체 내용물을 검사하여 필라리아 기생충 또는 혈액 트레마토드의 존재 여부를 확인합니다.
  12. 가위로 각 소화관 섹션을 열고 점막을 긁어 내고 큰 기생충 (>1cm)의 존재를주의 깊게 검사하십시오. 필요한 경우 돋보기를 사용하십시오. acanthocephalans의 주둥이는 종종 장 벽에 깊숙이 박혀 있으며 집게 및/또는 작은 가위로 조직에서 조심스럽게 놀려야 할 수도 있습니다.
  13. 열린 각 부분을 흐르는 물에 놓고 106단계에서 설명한 대로 모든 내용물을 1.11μm 체로 세척합니다.
  14. 심장과 주요 혈관(폐, 대동맥), 기관, 요로 및 담낭을 열고 같은 방법으로 내용물을 검사합니다.
  15. 날카로운 칼날과 집게를 사용하여 폐, 간, 신장, 비장, 췌장과 같은 단단한 장기를 자르고 떼어냅니다. 1.11단계에서 설명한 대로 흐르는 물에 106μm 체로 세척합니다.
  16. 발견된 기생충의 종류, 각 유형의 수, 기생충이 발견되는 기관을 기록하십시오. 정착 및 염색 방법은 다음과 같습니다.
  17. 연필로 쓴 일반 색인 카드의 작은 조각을 놓아 바이알/항아리에 라벨을 붙입니다(잉크와 괘선 색인 카드는 알코올 및 염색 표본에서 "실행"됩니다).

2. 기생충의 보존

  1. 추후 유전 연구를 위해 보존해야 하는 기생충의 경우 80-90% 에탄올(글리세린 제외)에 직접 넣으십시오. 에탄올은 95% 에탄올을 희석하여 제조해야 하며, 바람직하게는 시약 등급(표 1)을 사용해야 합니다. 포르말린은 DNA를 사용할 수 없는 상태로 분해하므로 이러한 표본이 포르말린에 노출되지 않도록 하십시오.
  2. 살아있는 트레마토드를 유리 현미경 슬라이드에 식염수 한 방울에 놓고 유리 덮개 슬립을 놓고 식염수를 끓이지 않고 슬라이드를 화염 위로 통과시킵니다.
    1. AFA(알코올-포르말린-아세트산, 표 1 참조)가 들어 있는 페트리 접시에 슬라이드를 떨어뜨리고 덮개를 띄우십시오.
    2. AFA에서 하루에서 며칠 동안 고정하고 수돗물로 헹구고 장기 보관을 위해 70% 에탄올로 채워진 5ml 유리 바이알(또는 기생충의 크기와 양에 따라 더 큰 유리 바이알/항아리)에 옮깁니다.
  3. 죽은 트레마토드를 AFA 또는 10% 완충된 포르말린에서 48시간 동안 고정한 다음 장기 보관을 위해 70% 에탄올로 채워진 바이알/병으로 옮깁니다.
  4. 페트리 접시에 거의 끓는 물을 부어 살아있는 cestodes를 편안하게 한 다음 장기 보관을 위해 70% 에탄올로 채워진 바이알/병으로 옮깁니다.
  5. 주둥이가 완전히 터질 때까지(최대 24시간이 소요될 수 있음) 냉장고의 수돗물(~4°C)에 페트리 접시에 넣어 1시간에서 몇 시간 동안 넣어 살아있는 아칸토두팔란을 이완시킵니다. 장기 보관을 위해 70% 에탄올 또는 AFA로 채워진 바이알/용기로 옮깁니다.
  6. 죽은 cestodes 및 acanthocephalans를 죽은 trematodes와 동일하게 취급하십시오 (위 참조).
  7. 살아있는 작은(<5mm 또는 깨지기 쉬운 선충(예: 트리코스트롱길리드, 모세관류)을 뜨거운(거의 끓는) 70% 에탄올로 죽이고 증발 시 기생충을 보존하기 위해 5% 글리세린(표 1)을 첨가한 70% 에탄올로 채워진 바이알/항아리에 보존합니다.
  8. 차가운 빙초산(표 1)이 든 페트리 접시에 넣고 15분 후에 70% 에탄올과 5% 글리세린으로 채워진 바이알/항아리로 옮겨 중형에서 대형(예: >5mm) 선충(예: 아스카리드, 스피루리드, 옥시우리드, 필라리드)을 죽이십시오. 아세트산은 이러한 방식으로 반복적으로 사용할 수 있습니다.
  9. 죽은 선충을 70% 에탄올과 5% 글리세린으로 채워진 바이알/병에 직접 넣습니다.

3. 기생충의 분류학적 식별

  1. 헤마톡실린을 알코올에 용해시키고 황산알루미늄암모늄을 열에 용해시켜 Harris' hematoxylin을 준비합니다. 두 용액을 섞고 끓입니다.
    1. 요오드산나트륨을 넣고 실온으로 돌아간 후 필터(541 여과지) 용액을 2-3분 동안 끓입니다.
  2. trematodes, cestodes 및 acanthocephalans를 희석된(1:10) Harris' hematoxylin 또는 Semichon's carmine에 밤새 방치하여 덧칠합니다(표 1 참조).
    1. 장기가 보일 때까지 70% 산성 에탄올을 사용하여 염색을 제거합니다(몇 초에서 한 시간 이상 걸릴 수 있으며 자세히 관찰해야 함).
    2. 검체를 70% 염기성 에탄올로 최소 30분 동안 옮겨 염색을 중단합니다. 다음으로, 일련의 눈금이 매겨진 에탄올(80%, 95%, 100%)로 탈수하고 자일렌 또는 메틸 살리실레이트로 제거합니다.
    3. 캐나다 발삼 한 방울과 커버 슬립을 추가한 후 현미경 슬라이드에 표본을 장착합니다. 밤새 말리십시오.
  3. 중소형 선충과 아칸토두팔란(acanthocephalan)을 15-30분 동안 락토페놀(lactophenol)의 임시 마운트에서 커버 슬립이 있는 현미경 슬라이드로 제거합니다.
    1. 큰 선충류(아스카리드 및 스피루리드) 및 아칸토세팔란에 대해 최대 60분 동안 80% 페놀을 사용하십시오. 더 작은 구조(수컷 스피큘 및 갈고리)를 평가하기 위해 광학 현미경(40-400X)으로 검사합니다.
  4. 특수 구조를 검사하려면 다음 방법을 사용하십시오.
    1. cestodes의 경우, scolex를 잘라내고 lactophenol에 담긴 현미경 슬라이드에 놓고 rostellar hooks를 측정하고 계산하기 위한 커버 슬립으로 "스쿼시"합니다(그림 1B 참조).
    2. 선충의 경우 앞쪽 끝을 잘라내고 락토페놀 몇 방울(커버슬립 없음) 또는 글리세린 젤리(커버 슬립 포함)를 현미경 슬라이드에 정면으로 장착하고 광학 현미경(35-400X)으로 입 부분을 관찰합니다(그림 1D 참조).
    3. 큰 선충의 꼬리를 잘라내고 커버 슬립으로 락토페놀 소재의 현미경 슬라이드에 장착하여 광학 현미경으로 수컷의 복부 유두와 가시 형태를 관찰합니다(그림 1D 참조).
  5. 다음과 같은 1차 문헌과 표준 분류학 참고 문헌의 조합을 사용하여 종에 대한 기생충을 식별합니다.
    1. Trematodes: Yamaguti (1958, 1971)3,4 및 Gibson et al. 5-7
      2. 명
    2. 아칸토세팔란: 야마구티8
    3. 세스토데스: Yamaguti9, Schmidt10, and Khalil et al. 11
      4. 세
    4. 선충류: Yamaguti12 및 Anderson et al. 13
      5. 세

4. 미국 국립 기생충 컬렉션의 기생충 보관소

  1. 대표적인 기생충 표본을 미국 국립 기생충 컬렉션(USNPC)에 기탁합니다. 이것은 대부분의 기생충 저널에 필수입니다. 제출 후, 각 기생충 종은 원고에 포함될 수 있는 등록 번호가 할당됩니다.
  2. 검체를 제출할 때 다음 정보를 포함하십시오: 1) 기생충의 학명; 2) 숙주 정보(종, 지리적 위치의 경도/위도 좌표); 3) 숙주에서 발견되는 기관; 4) 표본을 수집한 사람의 이름 및 수집 날짜; 5) 사용된 고정제, 얼룩 또는 청소/장착 매체의 유형; 6) 추가 표본이 다른 곳에 제출된 경우 다른 컬렉션(박물관 및 등록 번호)의 위치; 7) 출판물 및 저널에 대한 정보. 이러한 데이터는 또한 표본과 함께 별도의 덮개로 보내야 합니다.
  3. 시편을 충격 방지 흡수성 재질로 된 강력한 용기에 포장하십시오. 테이프/파라필름으로 유리 바이알의 캡을 조이고 각 바이알을 별도의 비닐 봉지에 넣습니다. 슬라이드를 종이로 싸서 충격 흡수 재료가 있는 슬라이드 상자에 넣습니다.
  4. 표본 및 표본에 대한 정보가 포함된 별도의 서신을 U.S. National Parasite Collection, USDA, ARS, ANRI, Bldg. 1180, BARC-East, 10300 Baltimore Avenue, Beltsville, MD 20705-2350으로 보내주십시오.

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결과

위에서 설명한 방법들을 사용하여 2007-2011년 사이 몬태나주 미줄라 카운티에서 땃쥐(Sorex cinereus)의 기생충 조사를 실시하였다. 피트폴 트랩(pitfall trap)으로 총 56마리의 땃쥐를 포획하여 사후 2시간 이내에 검사하였다. 전체 감염률은 96%였으며, 단 2마리의 땃쥐만이 기생충이 없었다. 조충류 9종과 선충류 6종을 포함하여 총 15종의 기생충이 확인되었다. 조충속 Staphylocystoides의 한 종은 이전에 보고되지 않은 신종이었다. 감염이 확인된 장기는 소장(조충 9종, 선충 3종), 위(선충 1종), 폐(선충 1종) 및 방광(선충 1종)이었다. 감염된 숙주당 총 감염 강도는 7-234마리였다. 종 풍부도(감염된 숙주당 기생충 종 수)는 1-8종이었으며 평균은 4.1종이었다(그림 2).

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토론

열악한 자료를 기반으로 속으로 기생충 기생충을 식별하는 것은 극히 어렵습니다. 특히 Cestodes와 흡충류는 숙주가 죽은 후 상당히 빠르게 죽고 악화되는 경향이 있습니다. cestodes의 분류는 냉동 물질에서 종종 손실되는 rostellar 갈고리의 수, 크기 및 모양에 크게 의존합니다. 극피류(echinostomes) 및 이구균류(heterophyids)와 같이 구강 빨판 주위에 가시가 있는 특정 흡충류에도 동일하게 적용되며, 이도 자주 손실됩니다. 큐티클이 두껍기 때문에 선충류와 극두류는 조금 더 단단하지만 여전히 수축되거나 코가 수축될 수 있습니다. 따라서 가능한 가장 신선한 재료를 얻는 것의 중요성은 아무리 강조해도 지나치지 않습니다. 최적으로는 살아있는 숙주를 포획하여 안락사시키고 즉시 검사해야 합니다. 그렇지 않으면 숙주를 사망 후 3-4시간 이내에 검사하거나 가능한 한 빨리 냉동해야 합니다. 숙주를 채취한 직후 장관을 제거하고 액체 질소로 급속 냉동하면 우수한 물질이 생성되었습니다. 몇 마리의 숙주라도 새로 검사...

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공개 사항

우리는 공개할 것이 없습니다

감사의 글

저자는 퍼듀 대학의 인디애나 USDA APHIS 야생 동물 서비스 프로그램의 질병 생물학자인 Joe N. Caudell 박사에게 이 비디오 제작을 위해 기생충 수집에 사용되는 표본을 제공한 것에 대해 감사를 표합니다. Jennifer Serafin은 모든 화학 용액을 준비했습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
<강한>고정
알코올-포르말린-아세트산(AFA)Fisher ScientificA407-1(에탄올)
F75F-1GAL(포름알데히드)
BP2401500(빙초산)		에탄올 85%(85ml) + 포름알데히드 37%(10ml) + 빙초산(5ml)
살해 및 장기 보존을 위한 에탄올Fisher ScientificA407-1에탄올 100%(70ml) + 증류수(30ml)
고정 및 DNA 연구용 에탄올Fisher ScientificAC61511-0010에탄올 80-90%(80-90ml) + 증류수(20-10ml) 각각
포르말린 완충Fisher ScientificSF100-4포르말린 10%(10ml) + 증류수(90ml)
글리세린-알코올Fisher ScientificA407-1(에탄올)
AC15365-1000
(글리세린)		에탄올 70%(95ml) + 글리세린(5ml)
<강력>세척, 염색 및 장착
염색 중 탈수를 위한 에탄올Fisher ScientificA407-1에탄올 80%, 95%, 100%(80ml, 95ml, 100ml) + 증류수(20ml, 5ml, 0ml)
락토페놀Fisher ScientificR400-27-
페놀Fisher ScientificA931I-1 (페놀)
A407-1 (에탄올)		페놀 100%(80 ml) + 에탄올 100%(20 ml)
Harris' HematoxylinFisher ScientificS25347 (hematoxylin)
A407-1 (에탄올)
A567-500 (암모늄 알루미늄 황산염) S25553 (sodium iodate)		Hematoxylin (5 g) + ethanol 100% (50 ml) + 암모늄 알루미늄 황산염 (100 g) + 나트륨 요오드화물 (0.37 g) + 증류수 (1,000 ml)   
세미촌 s 아세트산 카민Fisher ScientificBP2401500 (빙초산)
S25236 (카민)
A407-1 (에탄올)		빙초산 (100ml) + 카민 (1.5g) + 증류수 (100ml). 끓는 물에 15분 동안 가열하고 식힙니다. 원액을 만드는 필터. 염색을 위해 70% 알코올과 1:2를 혼합합니다.
XyleneFisher ScientificX4-4화학 흄 후드 아래에서만 사용하십시오.
메틸 살리실레이트Fisher ScientificS25437-
에탄올 염기성Fisher ScientificA407-1(에탄올)
S25159A(진한 수산화암모늄)		에탄올 70%(100ml) + 수산화암모늄(0.1ml)
에탄올 산Fisher ScientificA407-1(에탄올)
SA9233-100(염산)		에탄올 70%(99.5ml) +  염산(0.5ml)
캐나다 발삼피셔 사이언티픽B10-100-

참고문헌

  1. Atkinson, C. T., Thomas, N. J. Parasitic Diseases of Wild Birds. Hunter, D. B. , John Wiley & Sons, Blackwell Press. Hoboken, New Jersey, USA. (2009).
  2. Parasitic Diseases of Wild Mammals. Samuel, W. M., Pybus, M. J., Kocan, A. A. , Second Edition, Iowa State University Press. Ames, Iowa, USA. (2001).
  3. Yamaguti, S. Parts 1 and 2. The Digenetic Trematodes of Vertebrates. Systema Helminthum. I, Interscience Publishers Inc. New York, New York, USA. (1958).
  4. Yamaguti, S. Synopsis of Digenetic Trematodes of Vertebrates. I and II, Keigaku Publishing Company. Tokyo, Japan. (1971).
  5. Gibson, D. I., Jones, A., Bray, R. A. Keys to the Trematoda. 1, CAB International Publishing and The Natural History Museum. Wallingford, Oxfordshire, UK. (2002).
  6. Jones, A., Bray, R. A., Gibson, D. I. Keys to the Trematoda. 2, CAB International Publishing and The Natural History Museum. Wallingford, Oxfordshire, UK. (2005).
  7. Bray, R. A., Gibson, D. I., Jones, A. Keys to the Trematoda. 3, CAB International Publishing and The Natural History Museum. Wallingford, Oxfordshire, UK. (2008).
  8. Yamaguti, S. Acanthocephala of Vertebrates. Systema Helminthum. V, Interscience Publishers Inc. New York, New York, USA. (1963).
  9. Yamaguti, S. The Cestodes of Vertebrates. Systema Helminthum. II, Interscience Publishers Inc. New York, New York, USA. (1959).
  10. D, G. Keys to the Cestode Parasites of Vertebrates. CRC Handbook of Tapeworm Identification. , CRC Press Inc. Boca Raton, Florida, USA. (1986).
  11. Khalil, L. F., Jones, A., Bray, R. A. Keys to the Cestode Parasites of Vertebrates. , CAB International Publishing and The Natural History Museum. Wallingford, Oxfordshire, UK. (1994).
  12. Yamaguti, S. The Nematodes of Vertebrates. Parts 1 and 2. Systema Helminthum. III, Interscience Publishers Inc. New York, New York, USA. (1961).
  13. Anderson, R. C., Chabaud, A. G., Willmott, S. Keys to the Nematode Parasites of Vertebrates: Archival Volume (Nos). 1-10. , CAB International Publishing and The Natural History Museum. Wallingford, Oxfordshire, UK. (2009).

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