방법 논문

침전 형성 폴리에틸렌 글리콜 마이크로겔의 특성은 반응물의 분자량에 의해 제어됩니다

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DOI:

10.3791/51002

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2013년 12월 23일

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, The University of Akron, 2Saint Vincent Saint Mary's High School

이 논문에서

요약

이 작업은 광중합 침전 반응을 통해 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG) 마이크로겔의 형성을 설명합니다. PEG 분자량을 늘리면 마이크로겔 직경과 팽윤 비율이 증가했습니다. PEG 마이크로겔 침전 반응에 대한 간단한 적응은 약물 전달 매개체 및 조직 공학 골격으로서의 마이크로겔의 미래 응용을 위해 탐구됩니다.

초록

이 작업은 광중합 침전 반응을 통해 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG) 마이크로겔의 형성을 설명합니다. 침전 반응은 기존의 미세구 제조 기술에 비해 몇 가지 이점을 제공합니다. 에멀젼(emulsion), 현탁액(suspension) 및 분산(dispersion) 기법과 반대로, 침전에 의해 형성된 마이크로겔은 유기 용매 또는 안정제를 사용하지 않고 모양과 크기가 균일하며, 즉 낮은 다분산 지수(polydispersity index)를 갖습니다. 침전 반응의 온화한 조건, 마이크로겔의 맞춤형 특성, 주입을 위한 낮은 점도로 인해 in vivo 목적에 적용할 수 있습니다. 다른 제조 기술과 달리 마이크로겔 특성은 시작 고분자 분자량을 변경하여 수정할 수 있습니다. 시작 PEG 분자량을 늘리면 마이크로겔 직경과 팽윤 비율이 증가했습니다. 마이크로겔 교차결합 동안 분자를 캡슐화하는 것과 같은 추가 변형이 제안됩니다. PEG 마이크로겔 빌딩 블록에 대한 간단한 적응은 약물 전달 매개체 및 조직 공학 골격으로서의 마이크로겔의 미래 응용을 위해 탐구됩니다.

서론

정의에 따라 마이크로겔은 약 0.1-100 μm1의 등가 직경을 가진 모든 형태의 하이드로겔입니다. 그 크기와 특성으로 인해 고분자 마이크로겔은 약물 전달 및 조직 공학 시스템을 발전시키기 위한 다재다능한 도구를 제공합니다. 벌크 하이드로겔은 조직 공학 골격 및 약물 전달 매개체로 광범위하게 활용되어 큰 성공을 거두었지만2-4, 최근 골격의 마이크로 스케일 제어로의 전환은 마이크로겔이 골격 구축의 기본 재료로 사용될 수 있는 독특한 기회를 제공합니다. 또한 마이크로겔은 세포 상호 작용에 대한 표면적 대 부피 비율이 높고 용액 내 점도가 낮아 주입에 이상적입니다. 마지막으로, 마이크로겔은 원하는 마이크로겔 특성에 따라 다양한 방법으로 수많은 폴리머를 사용하여 형성할 수 있으므로 다양한 응용 분야에 맞게 고도로 맞춤화할 수 있습니다.

마이크로겔을 생산하는 기술에는 현탁액, 에멀젼, 분산 또는 침전 중합이 포함됩니다. 에멀젼 및 현탁액 중합은 일반적으로 마이크로겔을 형성하기 위해 유기 용매와 계면활성제 또는 안정제를 필요로 합니다. 이러한 방법의 특성은 매우 분산된 입자 크기 분포5를 생성합니다. 분산 및 침전 반응은 입자를 더 낮은 다분산성(polydispersity)으로 렌더링합니다6; 그러나 분산 중합에 의해 형성된 입자는 여전히 안정화제의 사용을 필요로 합니다6. 침전 반응에 의해 형성된 마이크로겔은 안정제나 계면활성제를 사용하지 않고 균일한 크기와 모양의 입자를 형성한다는 점에서 독특합니다. 마이크로겔 형성은 엔탈픽 또는 엔트로피 침전에 의해 연속상과 분리된 고분자 사슬 상을 성장시킬 때 달성됩니다7. 침전 중합은 종종 코스모트로피 염을 사용하여 낮출 수 있는 고온에서 이루어지며, 이는 용매8에서 고분자의 용해도를 감소시킵니다. 이 연구는 생물학적으로 호환되는 조건에서 광중합 침전 반응에 의해 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)로 형성된 마이크로겔에 초점을 맞추고 있으며, 마이크로겔 특성을 변경하고 약물 전달 응용 분야를 위해 분자를 캡슐화하는 변형이 있습니다.

PEG 하이드로겔에 대한 이전 연구는 중합 조건이 하이드로겔의 물리적 및 기계적 특성, 즉 하이드로겔 수분 함량 및 압축 탄성률3,9에 큰 영향을 미친다는 것을 보여줍니다. 이러한 가교 결합 물질은 Flory10에 의해 설명된 구조적 특성과 물리적 특성 간의 관계를 사용하여 특정 응용 분야에 맞게 가교 하이드로겔을 조정할 수 있기 때문에 관심이 있습니다. 이러한 원리는 마이크로겔과 유사합니다. 침전 형성된 PEG 마이크로겔은 재생 의학11에 대한 잠재력을 가지고 있는 것으로 밝혀졌지만, 미래의 생물 의학 응용 분야를 위한 레퍼토리를 향상시키기 위해 마이크로겔 특성에 대한 추가 조사가 필요했습니다. 이 보고서는 침전 반응에 의해 마이크로겔을 제조하고 약물 전달 또는 재생 의학을 위해 이러한 물질을 추가로 개발하는 데 중요한 미립자 직경, 다분산 지수(PDI), 밀도 및 팽창과 같은 특성을 변경하는 절차를 설명합니다.

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프로토콜

1. 마이크로겔 제조에 사용하기 위한 솔루션 준비

  1. 침전 반응을 시작하기 전에 필요한 용액을 만들고 37 °C로 가열하십시오. 필요한 용액에는 0.5% 광개시제, 1.5M Na2SO4, 완충 용액, 200mg/ml PEG-다이아크릴레이트(PEG-DA) 용액 및 1x 인산염 완충 식염수(PBS)가 포함됩니다. 참고: 발표된 방법에 따라 모든 PEG 전구체를 아크릴화하고 사용12까지 아르곤 아래 -20°C에서 보관하십시오.
  2. 광개시제의 무게를 측정하고 0.5 (w/v)% 용액을 위해 탈이온(DI) H2O에 용해시킵니다. 용액이 자외선에 노출되지 않도록 보호하는 것이 중요합니다.
    1. 완전히 용해된 후 0.22μm 필터를 통해 필터링합니다. 이 용액은 미리 만들어 어두운 곳에서 4 °C에서 보관할 수 있습니다. 참고: 교반하는 동안 용액을 40°C로 가열하여 교반 시간을 약 1시간으로 줄입니다.
  3. 1x PBS의 경우 1L DI H2O에 1정 PBS를 추가하고 0.22μm 필터를 통해 필터링합니다. PBS는 미리 만들어 4°C에서 보관할 수 있습니다.
  4. 39.4ml의 인산염 완충 식염수(PBS, pH=7.4)를 측정하고 612μl의 트리에탄올아민(TEOA)과 260μl의 6M 염산(HCl)을 추가합니다. 참고 : TEOA는 매우 점성이 있습니다. 피펫팅 전에 TEOA를 37°C로 예열합니다.
    1. 버퍼의 pH를 약 7.7이 되도록 조정하고 0.22μm 필터(최종 pH ~7.8)를 통해 필터링합니다. 완충 용액은 규모를 늘리고, 미리 만들고, 37°C에서 보관할 수 있습니다.
  5. 매번 반응을 시작하기 전에 PEG-DA 용액을 만드십시오. 용액을 보관하면 반응성이 감소하는 것이 관찰되었습니다. PEG-DA의 무게를 측정하고 PBS/TEOA/HCl 완충액을 최종 농도 200mg/ml에 추가합니다. 참고: PEG는 용액에서 팽창하므로 PEG 농도를 조심스럽게 제어하기 위해 완충액을 천천히 추가하십시오.
    참고: 이 솔루션은 사용자 정의가 가능합니다. 마이크로겔을 맞춤화하기 위한 옵션에는 마이크로겔 특성을 변경하기 위해 PEG의 시작 분자량을 변경하고, 분해 가능한 PEG 전구체를 사용하여 분해 가능한 마이크로겔을 제조하고, 생물학적으로 멸균된 마이크로겔에 대한 모든 용액을 멸균 여과하고, 층류 후드에서 형성 과정을 완료하고, 마지막으로 PEG 용액에 통합하여 표면에 작용기를 추가하는 것이 포함됩니다.
  6. Na2SO4 의 무게를 측정하고 1.5M 용액을 위해 DI H2O 에 용해시킵니다. 최상의 결과를 얻으려면 반응을 시작하기 직전에 황산나트륨 용액도 만들어야 합니다.
    1. Na2SO4 가 완전히 용해 될 때까지 용액을 가열하고 와류로 가열합니다. 필요에 따라 0.22μm 필터를 필터링합니다.

2. 마이크로겔 제조

  1. 127.5 μl의 PBS/TEOA/HCl 완충액, 10 μl의 0.5% 광개시제, 25 μl의 200 mg/ml PEG 용액을 마이크로겔이 형성될 튜브에 넣습니다. 일반적으로 2 ml의 마이크로 원심분리 튜브.
    1. 이 튜브를 1.5 M Na2SO4 용액과 함께 37 ° C로 가열합니다.
    2. 가열하는 동안 튜브를 섞습니다. 참고: 이 마이크로겔 프로토콜은 확장할 수 있습니다.
  2. 분자를 마이크로겔에 캡슐화하려면 원하는 분자(예: 오브알부민)를 PBS/TEOA/HCl 완충액, 광개시제 및 PEG 용액에 첨가합니다. 가교결합 후 분자는 마이크로겔 네트워크에 갇히게 됩니다.
  3. 각 마이크로겔 반응을 한 번에 하나씩 완료합니다. 첫 번째 튜브를 가져 와서 87.5 μl의 1.5 M Na2SO4를 첨가합니다.
  4. 3-5회 피펫팅으로 튜브를 혼합합니다. 또는 30초 동안 기다립니다. 혼합 후 염 농도가 고르게 분포되고 용액이 깨끗해야 합니다.
  5. 튜브를 자외선 아래에 놓고 30초 동안 가교합니다. 가교 후에는 용액 위에 흐린 층이 있어야 하며, 이 층에는 마이크로겔이 포함되어 있습니다. 반응 계획은 그림 1을 참조하십시오.
  6. 750 μl PBS를 첨가하여 원심분리시 펠릿을 형성하고 잘 혼합합니다.
  7. 4,000 x g에서 2분 동안 원심분리하여 펠릿을 형성하고 상층액을 PBS로 교환하여 마이크로겔 5 x 세척합니다. 참고: 완충액을 교체하는 동안 마이크로겔 펠릿을 방해하지 마십시오.

3. 마이크로겔 크기 및 다분산성

  1. 1ml의 DI H2O에서 원심 분리하여 형성된 펠렛에서 30 μl의 마이크로 젤을 피펫으로 만듭니다. 최상의 결과를 얻으려면 마이크로겔 용액을 수조 초음파 처리기에서 1시간(50-60Hz 및 1.4A) 동안 초음파 처리하거나 세게 혼합하여 마이크로겔을 현탁시킵니다.
  2. 마이크로겔 용액 15μl를 깨끗한 유리 슬라이드에 피펫팅하고 그 위에 #1.5 커버 슬립을 놓습니다. 슬라이드와 커버를 뒤집어 실험실 티슈에 끼워 넣고 슬라이드를 아래로 눌러 과도한 용액을 제거하고 마이크로젤이 단일 층에 있는지 확인합니다.
  3. DIC 100X 오일 대물렌즈를 사용하여 마이크로겔의 여러 이미지를 캡처합니다. 일반적으로 샘플당 5개의 이미지를 촬영하고 배치당 3개의 샘플을 사용하여 총 15개의 이미지를 촬영하는 것이 좋습니다. 참고: 현재까지 배치 간 변동은 관찰되지 않았습니다.
  4. 대표 직경을 얻기 위해 마이크로겔을 측정합니다.
  5. 다음 부피 기반 방정식을 사용하여 PDI를 계산하며, 여기서 N은 마이크로겔의 총 수이고 Vi는 마이크로겔 i의 부피입니다.

4. 마이크로겔 밀도

  1. 마이크로겔 밀도를 측정하기 위해 DI H2O에서 덱스트란 7, 6, 5, 4, 3 및 1 (w/v)% 용액을 준비합니다. 이러한 밀도는 각각 1.022, 1.020, 1.018, 1.016, 1.014 및 1.010g/cm3로 계산되었습니다.
  2. 15ml 원심분리기 튜브에 7% 덱스트란 용액 1ml를 추가합니다.
    1. 6% 덱스트란 용액 1ml를 천천히 피펫팅하여 7% 덱스트란 위에 뚜렷한 층을 형성합니다.
    2. 5분 정도 기다린 다음 5% 용액 1ml를 추가합니다.
    3. 모든 dextran 용액이 dextran 농도가 감소하는 순서로 층을 이룰 때까지 계속합니다.
  3. 마이크로겔을 1% 덱스트란 용액 위에 조심스럽게 겹쳐 놓습니다.
  4. 4,000 x g 및 5 °C에서 10분 동안 그래디언트를 원심분리합니다. 원심분리 후 마이크로겔 위치를 사용하여 밀도13을 간단하게 계산할 수 있습니다.

5. 마이크로겔 평형 팽윤

  1. 평형 팽창(48시간) 후의 질량으로 정의되는 마이크로겔의 팽창 질량(Ms)을 측정하려면 먼저 DI H2O에서 마이크로겔을 5배 세척하고 미리 계량된 마이크로 원심분리 튜브에서 최소 48시간 동안 팽창합니다.
  2. 마이크로겔을 4,000 x g에서 10분 동안 원심분리합니다.
  3. 모든 상등액을 제거하고 젖은 질량을 기록합니다. 보다 정확한 결과를 얻기 위해 여과 방법을 사용하여 과도한 물을 모두 제거하십시오.
  4. 마이크로겔을 -80°C에서 동결한 다음 건조 질량(Md)을 얻기 위해 일정한 질량으로 동결건조합니다.
  5. 마이크로겔의 수분 함량을 Water% = (Ms -M d) / Md x 100으로 계산합니다.
  6. 폴리머 함량을 Polymer% = 100 - Water%로 결정합니다.
  7. n-way ANOVA 및 Tukey 사후 검정과 함께 SAS를 사용하여 모든 데이터에 대한 통계 분석을 수행할 수 있습니다. 차이점은 p<0.05.

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결과

마이크로겔의 크기는 중합 조건에 따라 달라집니다. 그림 2A는 PEG의 초기 분자량과 가교 시간이 증가함에 따라 마이크로겔의 직경이 어떻게 증가하는지를 보여줍니다. 다양한 분자량의 마이크로겔을 사용하여 크기를 측정한 대표 이미지(30초간 가교)가 그림 2C-G에 제시되어 있습니다. 분자량이 3,000 Da인 PEG의 경우, UV 노출 시간이 30-600초로 증가함에 따라 마이크로겔의 평균 직경이 1.65±0.26에서 2.20±0.54 μm로 증가했습니다(그림 2B). UV 노출 시간을 30초로 일정하게 유지하면서 분자량을 3,000-10,000 Da로 증가시켰을 때, 마이크로겔 직경은 1.65±0.26에서 2.17±0.33 μm로 증가했습니다(그림 2A). 3,000, 4,000, 4,600 Da의 분자량 사이에서는 유의미한 차이가 관찰되지 않았습니다. 침전 방식으로 형성된 마이크로겔의 통계적으로 유의미한 차...

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토론

PEG 마이크로겔의 물리적 특성은 중합 조건의 변화에 대해 조사되었습니다. 이 침전 반응을 위해 완충 용액, 20%(w/v) PEG-디아크릴레이트(MW 3,000, 4,600 또는 6,000 Da) 용액 및 광개시제를 혼합하고 37°C로 가열했습니다. 물 분자 간의 상호 작용을 증가시키는 코스모트로피 염인 1.5M Na2SO4를 첨가하면 PEG가 첨가 시 순간적으로 침전되었습니다. 이 효과는 분자량이 높은 PEG8에서 더 두드러지며, 이는 실제 마이크로겔 형성이 사슬 성장과 침전의 조합임을 시사합니다. 마이크로겔은 자외선(UV)을 이용한 광중합으로부터 얻어졌습니다. UV 노출은 30, 90, 120, 300 및 600초에서 다양했습니다. 폴리머가 임계 분자량에 도달하면 침전되어 얽히고 가교된 마이크로겔을 형성합니다. 마이크로겔에 단백질을 캡슐화하는 것은 UV 노출 전에 용액에 분자를 첨가함으로써 달성되었습니다. 폴리머 사슬이 가교를 형성함에 따라 폴리머 네트워크...

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공개 사항

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 프로젝트에 대한 자금은 NSF CBET Award 1061834를 통해 이루어졌습니다. 저자는 광개시제 샘플에 대해 CIBA에 감사를 표합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
인산염 완충 식염수(PBS)MP 생물의학2810305
트리에탄올아민(TEOA)J.T. Baker9468-0137°C로 예열; C 피펫팅 전
염산(HCl)BDH AristarBDH3028
황산나트륨J.T. Baker3891-01
Irgacure 2959Ciba029891301PS04
Ovalbumin (OVA)Invitrogen34782
PEG 1,500Alfa AesarA16241
PEG 3,000Fluka03997-1KG
PEG 4,000Alfa AesarA16151
PEG 4,600Sigma373001-250G
PEG 6,000Fluka03394-1KG
PEG 10,000Alfa AesarB21955
덱스트란 70TCID1449

참고문헌

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