쥐과 신생아에서 보존 면역 표현형과 기능으로 두피 소교 세포의 분리

요약

미세 아교 세포 생물학의 성공적인 조사에 하나의 키는 CNS의 조직으로부터 분리하는 동안 생체 미세 아교 immunofunction의 보존이다. 형광 이미징, 면역 세포 화학, 및 염증성 자극 지질 다당류 (LPS)와 팸 ₃ CSK ₄ (팸)와 ELISA 다음 미세 아교 세포의 활성에 의해 평가 매우 순수하고 immunofunctional 세포 배양에 회전 흔들림 결과를 통해 미세 아교 세포를 분리.

초록

CNS 조직에서 미세 아교 세포의 분리 생체 미세 아교 세포 생물학을 연구하는 데 사용하는 강력한 조사 도구입니다. 본 발명의 방법은 회전 쉐이커 기계 교반에 의한 신생아 쥐의 피질에서 미세 아교 세포의 분리를위한 절차를 자세히 설명합니다. 이 미세 아교 세포의 분리 방법 수율 생체 내에서 정상 nonpathological 조건에서 대기 미세 아교 세포 나타내는 형태 학적 및 기능적 특성을 나타내는 순도가 매우 높은 대뇌 피질의 미세 아교 세포. 형태 학적 변화, NF-κB (P65)의 P65 서브 유닛의 핵 전좌하고 각인 전 염증성 사이토 카인의 분비, 종양 괴사 인자-α (TNF-α의 유도에 의해 설명 된대로이 절차는 또한 미세 아교 세포 면역 표현형, 생화학 적 기능을 유지 ), 리포 폴리 사카 라이드 (LPS)와 팸 ₃ CSK ₄ (팸) 문제시. 따라서, 본 분리 절차는 대기와 함께하는 양의 면역 표현형을 유지생체 조건에서 미세 아교 세포 생물학을 연구의 실험 방법을 제공 vated의 미세 아교 세포,.

서론

미세 아교 세포는 중추 신경계의 실질의 감시 대식 세포는 성인 포유류의 뇌의 전체 세포 인구의 약 12​​ %를 차지. 미세 아교 세포는 난황 주머니 골수 전구 세포에서 유래 및 성인 CNS ^1-5에서 다른 cytoarchitectural 지역에서 세포의 밀도와 형태가 다양합니다. 건강한 성인의 뇌에서 미세 아교 세포는 미세 동적 프로세스와, 작은 분지 또는 극성 세포입니다. 그러나, 생체 영상 연구는 미세 아교 프로세스가 동적으로 "를 연상시키는 방식으로 확장하고 자신의 미세 환경을 모니터링 철회 입증, 주변 대식 세포의 형태와는 달리, 미세 아교 세포는 세포 비활성 상태로 나타날 수 있습니다 건강한 두뇌에 대기, 로우 프로파일 표현형을 보여 샘플링 및 ^"6,7를 조사.

미세 아교 세포는 스위칭, 높은 및 차동 뇌의 환경 및 병태 생리 학적 변화에 반응하는각각 음향 상태 - 일반적으로 자신의 휴식으로 간주하고 활성화 상태에 감시자에서. 정품 인증이 스위치는 병원체 - 관련 분자 패턴에 응답 수신자 같은 수용체 (TLR에), (PAMPS), 즉 세균 및 바이러스 유래 지질 단백질로 막 결합 패턴 인식 수용체 (PRRS)의 결합에 의해 매개 될 수있다 , 핵산, 탄수화물 ^8-1....

프로토콜

이전에이 프로토콜을 시작으로, 출생 후의 일에 신생아 쥐를 수집 1-3 보호와 따뜻함 원래 케이지 침구 중첩 된 멸균 용기에 (P1-3). 그것은 소교 수율을 최적화하기 위해 이러한 프로토콜을 통해 신속하고 효율적으로 작동하는 것이 중요하다. 전체 시약의 목록은 표 1을 참조하십시오.

1. 악기, 문화, 미디어 및 식기 준비

1. 10 ㎖ / 강아지 소교 완료 미디어 (MCM을 준비, 1X 최소 필수 보충 중간 얼의 [MEM] : 1 ㎜의 L-글루타민, 1 mM 피루브산 나트륨, 0.6 % V / V의 D-(+) - 포도당, 100 ㎍ / ㎖의 페니실린 / 스트렙토 마이신 (P / S), 4 % V / V 태아 혈청 (FBS), 6 % V / V 말 혈청), 각각의 T-75 플라스크 (1 플라스크 / 강아지)에 추가, 모자 및 장소에 가로, 인큐베이터 (37 ° C에서 5 % CO ₂₎ 1 시간 동안 평형합니다. 그것은 절개를 시작하기 전에 플라스크 (들)이 미디어 평형하는 것이 필수적입니다.
2. Prepa다시 나누어지는, 따뜻한 해부 (6 ㎖ / 강아지) 37 ° C의 물을 욕조의 MCM의 세포 재 부유 (2 ㎖ / 강아지)에 대한 별도의 원뿔....

결과

격리하는 동안 미세 아교 세포 생체의 면역 표현형 및 기능을 유지하는 미세 아교 세포 생물학에 대한 조사의 모델로이 세포를 활용할 수있을 것이 중요합니다. ^(-와 C57BL / 6 CX3CR1-GFP ^{+ /)} 및 LPS 또는 팸 하나와 처리 문화를 본 방법을 사용하여 미세 아교 세포의 immunofunctionality의 성공적인 보존을 설명하기 위해, 우리는 P3의 신생아에서 대뇌 피질의 미세 아교 세포를 고립.

도 1a에 도시 된 바와 같이, 회전 흔들림을 통해 교반을 통해 미세 아교 세포의 분리는 정상 생체 내 조건에서 미세 아교 세포에 의한 정지 표현형을 유지합니다. 소교 순도를 평가하기 위해, CX3CR1-GFP ^{+ / -} 세포 배양 식세포 항원 이바-1과 세포핵을 시각화하기 위해 DAPI로 염색 카운터 염색 하였다. prese를 통해 낮은 배율,.......

토론

본 절차는 신생아 쥐에서 대뇌 피질의 미세 아교 세포의 분리를위한 효과적인 방법을 제공합니다. 이 절차는 형광 이미징, 면역 세포 화학 및 ELISA에 의해 결정, 1) 보존 미세 아교 세포의 면역 표현형과 기능의 두 가지 이점을 제공하고, 2) 미세 아교 세포는 이전에 다른 glial 세포 (성상 세포 및 oligodentrocytes)의 존재로 성숙 할 수 있도록 아교 문화의 성숙 기간 동안 중요한 세포 - 세포 상호 작용을 용이하게 할 수있다 격리. 중요한 것은, 고립 된 세포가 유지 기능과 면역 표현형 생체 높은 생존 능력과 균일 성을 나타내었다.

높은 순도와 수율 미세 아교 세포의 성공적인 분리를 위해 특별한 관심과 근면으로 수행해야 할 몇 가지 단계가 있습니다. 이 단계는 다음과 같다 : 1) 전체 실험 절차를 통해 살균, 건강한 문화를 유지, 2) 고전에서 모든 수막을 제거tices 미세 절제하는 동안, 피질을 닦지 후 접시와 가위를 닦지 3) 적.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Glucose	Sigma	G8270	MilliQ 물로 20% 재고 용액을 만듭니다; 필터는 살균합니다; 4도에서 보관; C; 유통 기한: 3-6개월. MCM 및 MGM을 만드는 데 사용됩니다.
피루브산 나트륨 100 mM (100x)	Hyclone	SH30239.01	4°C에서 보관. MCM 및 MGM을 만드는 데 사용됩니다.
페니실린/스트렙토마이신 10,000 units/ml (100x)	Gibco	15140-122	-20°C에 보관. MCM, MGM, MM, DM 제조에 사용.
L-글루타민 200 mM (100x)	Gibco	25030-081	-20°C에 보관 MCM 및 MGM을 만드는 데 사용됩니다.
소 태아 세럼 (정의)	Hyclone	SH30070.03	필터는 살균합니다. -20 °C에서 보관하십시오. MCM 및 MGM을 만드는 데 사용됩니다.
최소 필수 매체 Earle's (MEM)	Cellgro	15-010-CV	. 얼염이 함유되어 있습니다. MCM, MGM, DM 제작에 사용됩니다.
호스 세럼	Gibco	16050	필터는 멸균; -20°C에서 보관. MCM 및 MGM을 만드는 데 사용됩니다.
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)	Cellgro	21-021-CV	칼슘과 마그네슘이 없습니다. 4 °C에 보관하십시오. MM을 만드는 데 사용됩니다.
HEPES 1 M	Gibco	15630-031	4 ° C.에 저장. MM을 만드는 데 사용됩니다.
T-75 플라스크	코닝	430641
4',6-디아미디노-2-페닐린돌, 딜락테이트(DAPI)	인비트로젠	D3571	세포핵을 염색하는 데 사용됩니다.
토끼 안티-IBA1	Wako	019-19741	Iba1의 ICC 염색을 위해 1/750 희석에 사용됩니다.
토끼 안티 NF&카파; B (p65)	Abcam	7970	p65의 ICC 염색을 위해 1/1,250 희석으로 사용됩니다.
Alexa Fluor 594 Goat anti-Rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A11012	ICC에서 항원:항체 복합체의 시각화를 위해 1/1,000 희석으로 사용됩니다.
10 ml 일회용 혈청 피펫	Fisher Scientific	13-678-11E
50 ml 일회용 원심 분리기 튜브	Fisher Scientific	05-539-8
15 ml 일회용 원심 분리기 튜브	Fisher Scientific	05-539-12
멸균 폴리스티렌 페트리 접시	Fisher Scientific	875713	100 mm x 15 mm
가위: 스트레이트 메쳄바움(가위 #1)	Roboz 수술	RS-6010	1; 5 인치; 머리 제거에 사용됨
가위: Vannas (가위 #2)	Fine Science Tools	15000-08	1; 비각도; 2.5 mm 절단 가장자리; 두피를 여는 데 사용
가위: Student Vannas (Scisso #3)	Fine Science Tools	91501-09	1; 곡선; 뇌 조직을 다지는 데 사용
Forcep: Dumont #7 (forcep #1)	Fine Science Tools	91197-00	2; 코를 고정하고 피질을 제거하는 데 사용됩니다
Forcep: Dumont #2 (forcep #2)	Fine Science Tools	11223-20	1; 두피 제거에 사용
Forcep: Dumont #3 (forcep #3)	Fine Science Tools	11231-30	1; 두개골 제거에 사용
Forcep: Dumont #5a (forcep #4)	Fine Science Tools	11253-21	1; 수막
Table of Specific Equipment 제거하는 데 사용>
줌 스테레오 해부 현미경	올림푸스	SZ4060	현미경은 층류 수평 흐름 캐비닛
층류 수평 흐름 캐비닛	Nuaire	NU-201-330
생물 안전 캐비닛	Labconco	3440001	Class II
Water-Jacketed CO2 인큐베이터	VWR	97025-836	37 °로 설정; C, 5% CO2
Swing-out 버킷	Fisher Scientific	75006441	Swing-out rotor
Swing-out rotor	Fisher Scientific	75006445	최대 반경: 19.2 (cm)
Sorvall Legend RT+ Centrifuge (clinical centrifuge)	Fisher Scientific	75-004-377	With Swing-out
rotor AccuSpin Micro 17 microcentrifuge ( 탁상용 마이크로 원심분리기)	Fisher Scientific	S98645	마이크로리터 로터 포함 (24 x 1.5/2.0 ml; 고양이 #: 75003524)

은 L-글루타민이 없는 용