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이 논문에서
요약
초록
동물 모델은 병원체의 고유 숙주에서 일반적으로 실용적이지 않은 것으로 간주되는 것을 달성하기 위해 연구 실험실 전체에서 일반적으로 사용됩니다. 동물의 모유를 채취함으로써 과학자들은 수직 전달, 수동 면역, 유선, 생물학 및 수유를 포함한 생식의 여러 측면을 연구할 수 있습니다. 이러한 연구를 위해 적절한 양의 우유를 얻는 것은 특히 작은 동물 모델에서 어려운 작업입니다. 여기에서는 특수 장비나 광범위한 훈련이 필요하지 않은 생쥐와 Reeves의 muntjac 사슴에서 우유를 채취하는 저렴하고 쉬운 방법을 보여줍니다. 이 특별한 방법은 두 명의 연구원이 필요한데, 한 명은 우유를 추출하고 동물을 안정시키는 것이고, 다른 한 명은 Muntjac 또는 마우스 모델에서 적절한 용기에 우유를 수집하는 것입니다. 또한 마우스 모델에는 P-200 피펫맨과 해당 피펫 팁을 사용해야 합니다. 이 방법은 비용이 저렴하고 비교적 수행하기 쉽지만, 최적의 우유 채취를 위해서는 동물을 마취해야 한다는 점을 연구자들은 알려야 합니다.
서론
동물 모델은 체외 분석에 의해 얻어 질 수없는 질병의 병리에 대한 통찰력을 제공합니다. 가장 효과적인 결과를 제공하기 위해, 밀접 질환 및 그와 관련된 종의 동물 모델을 사용하는 것이 중요하다. 예를 들어, 꿰 문착 (Muntiacus reevesi에), cervid 프리온 단백질 (CerTgPrP)를 3 표현하는 작은 아시아 사슴 1, 2, 형질 전환 마우스는 cervid 종에 유용한 동물 모델입니다. 두 종은 연중 번식을 허용 polyestrous이며, 따라서 임신 관련 조직과 체액에 대한 일관성있는 소스는 cervid 생물학의 특정 메커니즘을 연구 할 수 있습니다. 우유의 연구는 인간보다 동물 모델에서 수행 더 간단하게 (저렴하게)있는 응용 프로그램의 광대 한 배열이있다. 연구원은 1) 전염성 질병 전파의 잠재적 인 소스로 우유와 초유를 조사 수, 개발까지의 자손에게 어머니로부터 전송 2) 면역 글로불린수동 면역 4, 3) 락토페린의 pment 연구자가 현재 시도하고 수동 면역에 관련된 인간의 모유에서 발견되는 단백질은 상업적으로 5를 생산하고 있습니다.
작은 동물에서 우유의 상당한 양을 수집하는 것은 어려운 작업이 될 증명할 수 있습니다. 로저스는 이후 마우스에 사용 된 쥐 6에서 우유를 수집하는 방법을 제안했다. DePeters 및 호비는 진공 원에 부착 착유 유닛 (의 구성을 필요로 우유 컬렉션, 파스퇴르 피펫에 부착 된 고무 피펫 전구에 의해 생성 수동으로 생성 된 진공을 이용 하나, 그리고 제 두 가지 방법을 제안 그러한 마우스 우유 7을 수확 할 수있는 수도꼭지) 등. 여기에서 우리는 마우스 만 쉽게 사용할 실험실 장비 및 기본적인 기술 능력을 필요로 꿰 문착 사슴, 양에서 우유를 수집하기위한 간단하고 저렴한 방법을 제안한다. 우리의 방법은 다양한 우유의 충분한 볼륨을 생성응용 프로그램.
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프로토콜
1. 마우스 착유 프로토콜
이 프로토콜에서 설명하는 방법은 IACUC에 의해 승인되었다.
자손의 댐 1. 분리
- 착유 할 수있는 댐을 선택합니다. 8~12일 컬렉션 21 일 모든 시간 포인트 포스트 분만 업에 가능 최대 우유 컬렉션 비록 제공하기 위해 출산을 게시합니다 4 인 이상 새끼의 쓰레기와 댐을 선택합니다.
- 착유 전에 그녀의 쓰레기 최소 2 시간에서 댐을 분리합니다.
참고 : 주어진 시간에 하나 이상의 댐 우유 하나의 욕망하는 경우, 이는 적절한 음식과 물 공급과 같은 케이지에서 분리 된 댐을 집에 허용됩니다.
옥시토신, 마취 눈 윤활유의 2. 관리
- 복강 옥시토신의 2 IU / kg (IP)을 관리 할 수 있습니다. 옥시토신은 우유의 방출을 자극하는 수유의 여성의 유방 동맥에 작용하는 호르몬이다. 옥시토신은 FR을 취득 할 수있다톰 의사.
- 5 ~ 10 ㎎ / ㎏ 자일 라진의 IP와 함께 80 ~ 100 ㎎ / kg 케타민을 포함하는 마취제 혼합물을 관리 할 수 있습니다. 예를 들어, 10 밀리리터의 마취 액을 약 30 g의 무게 마우스에 대해 사전에 준비 할 수 있고, 0.1 ml의 자일 라진, 8.9 ML의 H 2 O, 1.0 ML 케타민을 포함 할 것입니다. 0.25 ㎖의 총 마취 우유 수집을위한 충분한 시간을 제공해야하는, 약 20 ~ 30 분 동안이 크기의 마우스를 마취합니다.
주의 사항 : 동물이 성공적으로 마취 된 것을 확인하려면, 부드럽게 고체 표면에 그녀와 그녀의 뱃속에 배치; 그녀는 그녀의 다리를 이동 또는 그녀가 완전히 마취하면 그녀의 발에 상승을 시도 할 수 없습니다. 완전히 원래 투여 량으로 마취되지 않은 마우스의 경우, 연구자는 다른 관리있다 ¼ 또는 마취제 혼합물 마우스 이미 달성 마우스 및 / 또는 진정 작용의 레벨의 크기에 따라 본래의 복용량의 ½ . 그러나, 이것은 내가 할 수마취 부작용의 가능성을 ncrease, 또한 마우스보다 깊게 마취 및 / 또는 시간의 긴 기간 동안 마취를 당할 수도있다.
참고 : 하나 이상의 댐을 짜는 경우는 옥시토신과 케타민 (ketamine)과 자일 라진을위한 옥시토신과 진정 작용 시간의 짧은 반감기로 인해 마취 주사를 엇갈리게 할 필요가있다. - 각 눈의 구석에 눈 소량의 윤활유를 적용하고 마취 동안 건조에서 마우스의 눈을 방지하기 위해 확산.
3. 우유 컬렉션
수동 (R1이라 함) 우유, 한 연구원 우유 (R2)를 수집하는 표현하면서 마취 마우스를 개최 한 연구원 : 우유 수집은 쉽게 두 연구원이 수행됩니다. 마우스가 피해를 방지하기 위해 평면에 고정되어있는 경우이 방법은 또한, 한 사람으로 수행 될 수있다.
- R2는 P-200 핍에게, 멸균 알코올 준비 패드를 장착해야etman, 각 마우스 깨끗한 피펫 팁, 이러한 1.5 ㎖의 에펜 도르프 튜브 또는 1.2 ㎖의 cryovial와 우유, (재료의 표 참조) 보유하는 컨테이너입니다.
- 옥시토신을 적용하는 것을 시작으로, 우유 내림 (그림 1A 참조) 마우스의 유방 영역에 표시 될 것입니다. R1 : 멸균 알코올 준비 패드의 포장을 조심스럽게 전에 착유 할 영역을 청소하려면 마우스의 유방 영역을 닦습니다. 수동으로 우유의 볼 구슬 유두의 기초에 형성하기 시작 때까지 부드럽게 상승 움직임에 유방 조직을 마사지하고 짜내는 엄지 손가락과 집게 손가락을 사용하여 젖꼭지에서 우유를 표현한다.
- 피펫 팁의 공기를 해제하고 우유 수집을 위해 준비하는 첫 번째 정지 P-200 pipetman 플런저를 누르십시오.
- 우유의 드롭의 상단에 피펫 팁을 놓고 부드럽게 천천히 플런저에 압력을 방출하여 피펫 팁에 우유를 당깁니다. (참조 유두 나 피부에 너무 가까이 팁을 넣어하지 않도록주의그림 1B). 그것은이 모든 방법 피펫 팁의 상단에 우유를 끌어와 어려운 보유 용기에 종종 점성 우유를 추방 할 것 같은 완전히 플런저를 해제 할 필요가 없습니다.
- (도 1C 참조) 첫번째 중지 지나서 플런저를 누르면 손가락을 사용하여 용기 내로 우유를 추방. 어떤 액체가 손실되지 않도록 소량의 추방을 용이하게하기 위해, 튜브의 측면에 대한 피펫 팁을 누릅니다.
- 어떤 젖꼭지를 건너하지 않도록 수동으로 시계 방향 또는 반 시계 방향으로 하나의 이동, 각 젖꼭지에서 우유를 표현하기 위해 계속합니다. 그것은 다시 와서는 다른 것보다 더 많은 우유를 생산해야 지속적으로 같은 젖꼭지에서 우유를 표현하기 위해 허용하고 유용한 모두 있습니다.
댐 4. 마취 반전
- 대부분의 경우,이 둑이 착유 프로세스 중에 일어나 시작하기 시작하는 것이 일반적이다. 이 경우가 아니라면, CAG에 댐을 배치전자 간접적으로 가열 된 순환 담요로 열원, 아래 그녀는 일어나 시작할 때까지.
참고 : 댐, 일어나 그녀가 그녀 자신에 그녀의 새장에 대해 걸을 수있을 때까지 그녀의 활동의 확대 관찰을 계속하기 시작. - 댐이 투쟁하지 않고 새장에 대해 이동하면, 그녀의 쓰레기와 함께 그녀의 원래 케이지에 그녀를 다시 배치합니다. 악영향 우유 수집 한 후 먹이 새끼의 능력에 대해 언급하지 않았습니다.
2. 문착 착유 프로토콜
이 프로토콜에서 설명하는 방법은 IACUC에 의해 승인되었다.
자손에서 미상의 1. 분리
- 착유 할 미상을 선택합니다. 리브스 '문착 사슴은 일반적으로 하나의 새끼 사슴 2를 낳을. 초유 8 필수 영양소에 대한 액세스를 얻을 수있는 새끼 사슴의 기회를 허용하는 암컷에게 출산 후 하루 우유.
참고 : 새끼 사슴은 보통 숨기고 PROC 동안 다시 나타나지edure; 어머니 - 자식 쌍의 분리는 필요하지 않습니다.
옥시토신, 마취 눈 윤활유의 2. 관리
- 근육 옥시토신의 10 IU / kg (IM)를 관리 할 수 있습니다. 옥시토신은 우유 내리기를 자극하는 수유의 여성의 유방 동맥에 작용하는 호르몬이다. 옥시토신은 수의사로부터 획득 할 수있다.
- BAM의 마취에게 IM (11)를 관리 butorphanol 0.45 ㎎ / ㎏, azaperone 0.25 ㎎ / ㎏, medetomadine 0.07 ㎎ / ㎏을 포함. BAM 마취 혼합물의 하나의 용량은 전체 우유 수집을위한 충분한 시간을 제공합니다 약 20 ~ 30 분에 대한 문착 마취를합니다. 마취에 대한 또 다른 옵션은 약 10 ~ 15 분 동안 문착 마취가 1-2 ㎎ / ㎏,에서 미다 졸람입니다. 이것은 우유 수집을위한 충분한 시간을 제공하지만 BAM 및 동물이 짧은 시간주기의 끝에서 탈출하려고 시도 할 수 않고, 마취가 더 빠르게 대사된다.
참고 : 통증에 대한 최소 응답투쟁없이 MJ를 보유하는 R1의 능력 다음에 귀를 접촉시 약간의 반사 신경, 동물이 성공적으로 마취되었음을 나타냅니다.
주 : 완전히 원래 투여 량으로 마취되지 문착의 경우, 연구자는 다른 관리있다 ¼ 또는 이미왔다 진정의 동물 및 / 또는 레벨의 크기에 따라 마취 혼합물의 일본어 도즈 ½ 달성. 그러나, 이것은 마취 부작용의 가능성을 높일 수 있고, 또한 문착 더 깊게 마취 및 / 또는 시간의 긴 기간 동안 마취를 당할 수도있다. - 마취 동안 건조에서 문착의 눈을 방지하기 위해 각각의 눈과 확산의 모서리에 윤활제의 작은 금액을 적용합니다.
3. 우유 컬렉션
우유 수집은 쉽게 두 연구자와 함께 수행됩니다 에 마취 문착을 보유하는 한 연구원랩 수동 (R1이라 함) 우유, 그리고 편안하고 안전한 위치에 문착의 머리를 유지하고 우유 (R2)를 수집하는 두 번째 연구원을 표현하면서.
- 사용되는 마취제에 따라 착유들은 (미다 졸람 유발) 또는 2) 침구없는 대기실에서 청결을 유지하기 위해 (BAM-절차를 수행하는 동안 깨어 있어야 그들에게 안전한 장소를 제공하기 위해 펜에 하나 1)을 수행해야 ) 유도.
- R1과 R2는 우유를 유지하는 에탄올을 묻힌 거즈 몇 15의 ML 원뿔 폴리 프로필렌 튜브를 장착해야한다.
- 옥시토신을 적용하는 것을 시작으로, 우유 내림은 문착의 유방 영역에 표시 될 것입니다. R1 : 장갑 낀 손과 손가락뿐만 아니라, 전체 유방 및 에탄올을 적신 거즈를 가진 동물의 각각의 유두을 제균. R2 : 호흡의 용이성을 허용하고 반추위의 역류를 방지 할 수있는 안전하고 편안한 위치에 문착의 머리를 잡아. 포집 관의 CL을 잡고 유두에 OSE는 잠재적 인 오염을 방지하기 위해 그것을 건드리지 않고 젖이 되.
- 젖꼭지는 우유 부풀어 오른 때까지 부드럽게 상승 움직임에 유방 조직을 짜내는 엄지 손가락과 집게 손가락을 사용하여 하나의 젖꼭지에서 우유를 표현하고 부드럽게 그림 2 참조 (유두에서 그리고 R2 들고 튜브에 우유를 롤 ).
- 참고 : R2가 더 우유를 거의 낭비 될 수 있도록 컬렉션 튜브가 위치해야하는 것이 중요하므로 우유, 스트림에 나옵니다.
- 문착의 유방은 사분면으로 나누어 져 있습니다. R1 : 우유가 더 이상 쉽게 흘러 나올 때까지 각 사분면에서 우유를 표현하지를 계속합니다. 우유 한 젖꼭지로부터 발현 될 수없는 경우, 제 복귀하기 전에 모든 다른 유두에서 표현. 그것은 다시 와서는 다른 것보다 더 많은 우유를 생산해야 지속적으로 같은 젖꼭지에서 우유를 표현하기 위해 허용하고 유용한 모두 있습니다.
미상 4. 마취 반전
t는 "> 그것은. 대부분의 경우, 암컷은 모든 우유가 표현되기 전에 탈출을 시도합니다 착유 과정에서 일어나 시작 미다 졸람 유도 미상 일반적입니다. 마이너 구속은 우유를 증가하기위한 노력의 일환으로 사용된다 수율은 있지만 연구자와 암컷 모두의 안전과 편안함은 똑같이 중요하다.- BAM의 빠른 반전을위한 ㎎ / medetomadine 피하 2.5 밀리그램 atipamezole 관리 미상 마취.
주 : 마취의 두 가지 유형으로, 그녀는 비틀 또는 하강하지 않고 자신의 걸을 수있을 때까지 미상의 경과 관찰을 유지하기 위해 필요하고, 흡입의 두려움이나 질식하지 않고 먹고 마실 수있다. 악영향 우유 수집 한 후 간호사 새끼 사슴의 능력에 대해 언급하지 않았습니다.
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결과
마우스
우리의 실험에서, 우리는 몇 가지 변수에 의존 한 실험 쥐에서 우유의 약 100 ~ 400 μl를 수집 할 수 있음을 확인했다. 이러한 변수는) 수집을 위해 따로 시간의 양, 2) 옥시토신의 투여 량 투여를, 1을 포함 3) 댐은 간호 및 시간 포스트 분만 4) 양이 얼마나 많은 새끼. 우리의 연구는 댐은 적어도 2 시간 동안 그들의 자손에서 분리 될 때 가장 높은 수익률을 얻을 수있는 것으로 나타났습니다, 한 시간에 적어도 45 분은 착유를위한 마우스마다 따로 설정됩니다. 최대 우유 볼륨 8~12일 옥시토신의 2 IU / kg을 사용하여 분만을 게시 수확했다. 우리의 결과는 쓰레기 크기가 긍정적으로 우유 생산량 9 (그림 3 참조)의 상관 관계를 보였다 다른 연구에 따라 대부분이다.
문착
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토론
마우스
1 등의 마우스에서 우유를 수집 할 때 고려해야 할 여러 가지 요인이) 수집을 위해 따로 시간의 양, 투여 옥시토신 2) 용량, 3) 댐은 간호 4) 양이 얼마나 많은 새끼가 있습니다 컬렉션의 분만시 이후 경과 된 시간. 지침으로 이전의 연구를 사용하여, 우리는 우유 생산 조건을 최적화하기 위해 밖으로 설정합니다.
이전 연구는 직접 산자 8 우유 생산량 상관 관계가있다. 불행하게도, 쓰레기의 크기가 제어 할 수없는 변수입니다. 그러나, 착유 포스트 분만의 시간을 제어 할 수 있습니다. 실험실 쥐 최대의 우유 분비에 따르면 8~10일 포스트 분만 9시입니다. 우리의 경험은이 문 적합성에 있습니다.
그것은 옥시토신은 우유 생산의 게시물에 바꾸어 놓을 수없는 역할을하는 것으로 밝혀졌다분만...
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 실험은 NIH 보조금 #RAI093634A의 지원을 받았습니다. 우리는 문약 착유에 도움을 준 Jenny Powers, DVM, PhD에게 깊은 감사를 표합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 재료— 마우스 | |||
| 케타민 (KetaVed 100 mg/ml) (용량: 80-100 mg/kg) | MWI/Vedco | 011075 | |
| Xylazine (TranquiVed 100 mg/ml) (용량: 5-10 mg/kg) | MWI/Vedco | NADA 139236 | |
| 눈 윤활제 | MWI/Apexa | 701013 | |
| 옥시토신 (2 IU/kg) | Vet One | 501013 | |
| Materials— Muntjac | |||
| Midazolam (1-2 mg/kg) | Amerisource Bergen Drug Corp | 924326 | 선택 사항: 연구원은 Midazolam을 단독으로 사용하거나 BAM 조합을 마취제로 사용할 수 있습니다 |
| Butorphanol 주석산염(Torbugesic)(0.45mg/kg) | Fort Dodge Animal Health | NADA 135-780 | |
| Azaperone 주석산염(0.25mg/kg) | ZooPharm | ||
| 메데토마딘 HCl(0.07mg/kg) | ZooPharm | ||
| Antipamezol hydrochloride (Antisedan) (용량: 0.25 mg/kg) | Orion Corporation | NADA 141-033 | |
| Oxytocin (10 IU/kg) | Vet One | 501013 | |
| Equipment— 마우스 | |||
| P-200 Pipetman | Gilson | F123601 | |
| 200 μ l 피펫 팁 | Light Labs | B-2004-SH | |
| 1 ml 주사기 | MWI | 005427 | |
| 27 G 바늘 | MWI | 002031 | |
| Equipment— Muntjac | |||
| 15ml 원뿔형 튜브 | VWR | 21008-918 | |
| 22G 바늘 | MWI | 873 | |
| 3ml 루어 락 주사기 | MWI | 001377 |
참고문헌
- Dueling, S. Muntiacus reevesi. Animal Diversity Web. , Available from: http://animaldiversity.ummz.umich.edu/accounts/Muntiacus_reevesi (2004).
- Pei, K., Taber, R., O'Gara, B., Wang, Y. Breeding cycle of the Formosan Reeves muntjac (Muntiacus reevesi micrurus) in northern Taiwan, Republic of China. Mammalia. 59 (2), 223-228 (1995).
- Browning, S. R. Transmission of prions from mule deer and elk with chronic wasting disease to transgenic mice expressing cervid PrP. J. Virol. 78 (23), 13345-13350 (2004).
- Van de perre, P. Transfer of antibody via mother's milk. Vaccine. 21 (24), 3374-3376 (2003).
- Maden, C. Genetically modified mice produce human milk protein. BioNews. , (2009).
- Rodgers, C. T. Practical aspects of milk collection in the rat. Lab. Anim. 29 (4), 450-455 (1995).
- Depeters, E. J., Hovey, R. C. Methods for collecting milk from mice. J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. 14 (4), 397-400 (2009).
- Knight, C. H., Maltz, E., Docherty, A. H. Milk yield and composition in mice: effects of litter size and lactation. 84 (1), 127-133 (1986).
- Hedrich, H. J., Bullock, G. R. The laboratory mouse. , 735-736 (2004).
- Nishimori, K., Young, L. J., Guo, Q., Wang, Z., Insel, T. R., Matzuk, M. M. Oxytocin is required for nursing but is not essential for parturition or reproductive behavior. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (21), 11699-11704 (1996).
- Miller, B. F., Osborn, D. A., Lance, W. R., Howze, M. M., Warren, R. J., Miller, K. V. Butorphanol-azaperone-medetomidine for immobilization of captive white-tailed deer. 45 (2), 457-467 (2009).
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