방법 논문

막 극성, 멤브레인 무결성 및 세포 내 이온 농도의 모니터링 변경 폐렴 구균 형광 염료를 사용

DOI:

10.3791/51008

⸱

2014년 2월 17일

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University at Buffalo, State University of New York, 2Witebsky Center for Microbial Pathogenesis and Immunology, University at Buffalo, State University of New York, 3New York State Center of Excellence in Bioinformatics and Life Sciences, University at Buffalo, State University of New York

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

진핵 생물에 본 것과 달리, 주로 작은 크기로 박테리아의 세부 막 탈분극 및 이온 농도 변화 측정 어려운 종래의 방법을 만드는 것이 연구의 소수가있다. 여기, 우리 형광 기술을 이용하여 중요한 그람 양성 병원균 폐렴 구균에 이러한 이벤트를 모니터링하기위한 세부 프로토콜.

초록

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막 탈분극과 이온 플럭스로 인해 깊이 지학 및 신호 transductions 등의 세포 기능을 영향을 미칠 수있는 능력을 생물학적 시스템에서 광범위하게 연구 된 이벤트입니다. 전극 사용량 및 패치 클램프 등 모두 형광 및 전기 생리 방법은, 잘 진핵 세포에서 이러한 이벤트를 측정하기 위해 개발되었지만, 미생물의 유사 이벤트를 측정하기위한 방법은 더 복잡와 함께 그들의 작은 크기 관련 개발하기 위하여 도전 입증 멤브레인을 차폐 박테리아의 외면. 폐렴 구균 (폐렴 구균)의 죽음을 시작으로 우리의 연구 기간 동안, 우리는 극성의 변화, 무결성, 세포 내 이온 농도 등의 막 이벤트의 역할을 명료하게하고 싶었다. 문헌 검색, 우리는 거의 연구가 존재하는 것으로 나타났습니다. 다른 연구자들은 이온 독감을 측정하는 방사성 동위 원소의 흡수 또는 평형을 모니터링했다XES과 막 잠재력과 주로 그람 음성균에있는 연구의 제한된 수의, 막 전위를 측정하는 carbocyanine 또는 옥소 놀 형광 염료를 사용, 또는 (AM) 에스테르 버전 세포 투과 아세와 박테리아를로드하는 일부 성공을 볼 수 없었다 이온 성 형광 표시기 염료. 따라서 우리는 그람 양성 유기체 S.에서 막 전위, 파열, 이온 수송을 측정하기위한 프로토콜을 설립 최적화 폐렴. 우리의 방법이 최적의 비율 적 염료 AM 에스테르와 폐렴 구균을로드로 각각 막 탈분극 및 파열을 측정뿐만하는 비스 - 옥소 놀 염료 DiBAC 사 (3) 및 휴대 impermeant 염료 프로피 듐 요오다 이드를 사용하는 프로토콜을 개발 의 Fura-2, PBFI 및 BCECF은 형광 검출 플레이트 리더를 사용하여, 칼슘 2 +, K +, H +를 각각의 세포 내 농도의 변화를 검출한다. 이러한 프로토콜은 폐렴 구균에 대한 자신의 종류의 첫번째입니다이들 염료의 대부분은 다른 세균 종에 사용되지 않았다. 우리의 프로토콜은 S.에 최적화되어 있지만 폐렴, 우리는 이러한 접근 방식이 다른 종의 박테리아에서 유사한 연구를위한 훌륭한 출발점을 형성해야한다 생각합니다.

서론

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우리 연구실은 종양 세포의 세포 사멸을 유도 (종양 세포에 치명적인 만든 인간의 알파 - 락트 알부민을위한) 햄릿이라는 인간의 우유에서 단백질 지질 복합체를 확인뿐만 아니라, 세균 종 1,2의 다양한 죽일 수있다. 특히 민감한 것으로 발견 된 종은 최대 감도와 죽음 2,3의 세포 사멸과 같은 표현형을 표시하는 폐렴 구균 (폐렴 구균)와 호흡 기관을 대상으로 그들이었다. 막 탈분극과 특정 이온 전송 이벤트는 잘 설명하고 방사성 TPP + 이온과 JC-1과 TMRE 등의 형광 염료는 미토콘드리아 막 3의 탈분극을 설명하는 데 사용 된 미토콘드리아, 특히 진핵 세포에서 세포 사멸 중에 중요한 이벤트 -5. 따라서, 우리는 우리가 우리의 노력을 집중으로 폐렴 구균 이러한 막 관련 기능에 햄릿의 효과에 대한 자세한 내용을 보려면 모색그 과정에서 새로운 항균 치료 또는 백신 후보를 식별하기위한 큰 잠재력을 가진 박테리아의 세포 사멸과 같은 표현형의 기계적 구성 요소의 더 나은 이해를 개발할 수 있습니다.

우리 역학적 연구를위한 프로토콜을 확립하고자, 우리는 진핵 시스템에서 잘 설명 된 방법론 달리 박테리아 막 6,7의 전기 생리학 및 이온 수송 메커니즘을 상세히 거의 발표 된 연구가 있다는 것을 발견했다. 이것은 주로 작은 미생물의 크기와 그 표면 구조, 거 원형질체를 사용하여 일부 연구는 혼합 성공적으로 수행되었지만 특히 칸막이 벽의 존재, 즉, 패치 클램프 같은 종래 진핵 방법의 사용을위한 멤브레인의 접근성을 제한에 기인 8,9. 그것은 사람을 필요로하기 때문에 이러한 거대한 원형질체와 작업은 대부분의 세균 종을위한 이상적인 또는 실용적인 방법이 아니므로ipulated 박테리아 부자연 및 비 생물 적 상태에서 수행 된 박테리아 막 극성의 한정된 연구는 주로 유세포 분석기를 사용하고 형광 시아닌 및 옥소 놀 염료의 사용은 10-16.

하나의 시점에 하나의 박테리아에서 개별 형광 판독 값을 수집하는, 유동 세포 계측법 대신에, 우리는 시간이 지남에 따라 96 - 웰 플레이트 형식으로 세균 현탁액의 형광 강도를 검출하는 형광 검출 플레이트 판독기를 사용하여 선택 하였다. 이것은 훨씬 더 단순 다양한 시점에서 박테리아의 인구를 치료하고 완화, 지속적으로 유동 세포 계측법 사용하여 달성하기 어려운 시간의 연장 기간에 전체 인구의 형광 반응 속도를 모니터링 할 수있었습니다. (미토콘드리아와 함께 사용하기 위해 상기 언급 된 것 등) 전위에 민감한 형광 염료의 다양한 테스트 후에, 우리가 사용하는 최상의 기술 및 실제 성공을 달성DiBAC 4라는 비스 - 옥소 놀 염료 (3) (비스 - (1,3 - dibutylbarbituric 산) trimethine의 옥소 놀) 극성의 변화를 모니터링 할 수 있습니다.

우리는 또한 귀중한 동시에 요오드화 프로피 듐 (PI)을 사용하여 멤브레인의 무결성을 모니터링하기 위해 중단되었다고. 이 염료는 핵산에 결합에 형광하지만, 세균 세포막의 무결성이 그 라이브 죽은 염색 분석에 죽은 세포를 감지하는 데 사용되는 인기있는 구성 요소 만들기, 손상되었을 때 그렇게 만 할 수 있습니다. PI 이외에, SYTOX 녹색과 TO-PRO-1 액션 유사하며, 이전에 검출 방법 17 유동 세포 계측법을 사용하여 몇 가지 연구에서 박테리아에 사용 된 형광 염료이다. 우리는 때문에 우리는 주어진 샘플에서 DiBAC과 동시에 자사의 형광을 모니터링 할 수는 여기 파장에 PI를 사용하기로 결정했습니다.

우리의 연구에서, 우리는 햄릿뿐만 아니라 살균 작용을 가진 다른 관련 단백질 - 지질 복합체를 관찰폐렴 구균 3,18,26의 치료시 두 염료의 형광의 증가로 표시된 바와 같이 세균 막 ELOA 유도 탈분극과 파열로 알려져 있습니다. 두 착물을 위해, 우리는 DiBAC (4)의 형광 강도 (3) 탈분극 파열 이전에 발생했음을 나타내는 전에 PI의 강도 증가로 증가하고 있음을 관찰 그러므로, 우리의 살균성 단백질 - 지질 복합체에 의해 유도 된 특정 이벤트 관심. 이 구별은 막의 파열 자체가 특이 탈분극을 일으킬 수 있도록하는 것이 중요합니다. DiBAC 4를 모두 측정 및 분석 (3) 및 PI 형광 반응 속도는 동시에 우리는 형광 측정을 사용하는 대신에 유동 세포 계측법의 추가 이점이 두 개의 막 이벤트 사이의 관계를 조사 할 수 있었다.

세균 이온 플럭스를 모니터링하기 위해,의 이해를 측정하는 등의 방사성 동위 원소를 사용하여 몇 가지 이전의 성공이 있었다45 카 우리는 또한 우리의 최근의 연구 (18), (21)에 사용한 폐렴 구균 19, 20, 2 +. 그러나 이러한 방사성 이온으로 작업하는 몇 가지 단점이 있습니다. 그들은 비용이 많이들 수 있습니다, 시간이 많이 소요하고, 지저분한, 또한 관심의 동위 원소에 따라, 해를 실험을 수행하는 개인을 노출 할 수 있습니다. 또한, 시간이 지남에 급격한 변화를 모니터하는 것은 곤란하다. 따라서, 우리는 이온 성 형광 표시기 염료의 아세 (AM) 에스테르 버전을 사용 측정하는 다른 방법을 향하고. 그 자체로, 지시 염료가 충전되어 쉽게 막을 통과하지 않지만, 친 유성 에스테르 기의 추가와 함께, 현재 대전 된 분자는 세균의 세포막을 통과 할 수있다. 내부에 들어 서면, 세균 에스 테라 제는 충전을 다시 크게 셀을 종료 할 수있는 능력을 둔화 및 허용 염료 T 세포 내부 무료 염료를 떠나, 에스테르 그룹을 절단하고O는 시간이 지남에 따라 내부에 축적된다. 그러나 이러한 에스테르 염료의 사용은로드, 감지, 성공의 다양한 방법으로, 세포 내 칼슘 2 + 22 ~ 24과 H + 16의 변화를 감지하는 몇 종의 박테리아에 설명되어 있습니다.

세포 내 칼슘의 변화를 모니터하는 욕망 2 +와 S.에도 K +와 H + 레벨 폐렴은 햄릿과 다른 화합물과 치료에, 우리는 성공적으로 효율적으로 박테리아 세포에 형광 표시기 염료를로드하는 프로토콜을 만들었습니다. 음이온 수송 및 PowerLoad, 적재 효율을 증가 생명 기술의 독점적 인 화합물을 차단하여 색소 보존을 증가 모두 프로 베네 시드를 요구 박테리아에 효과적인로드. (K +을 검출)은 fura-2/AM 중 (Ca 2 +을 검출), PBFI / AM, 및 BCECF / AM (H의 +를 검출)을 성공적으로 캡슐화 및 캡슐화 모두 폐렴 구균 성으로로드 된형광 검출 플레이트 리더 18, 21을 사용하여 (K + uncoupler)와 CCCP (H + uncoupler을) 발리 노마 이신 (Valinomycin) 등 이오 노마 이신 (칼슘 2 + uncoupler) 등 ionophores, 첨가 한 후, 그 결과 형광 패턴의 측정을 가능하게 비.

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프로토콜

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1. 세균 배양을 준비

  1. 실험에 사용하기 위해 문화를 성장
    1. 37 ° C에서 가열 블록에서 S.의 고정 된 주식 병을 녹여 폐렴과 신선한 9 ml의 내용을 추가, 유리 문화 튜브에 10 ㎖의 총 볼륨의 0.5 % 효모 추출물 (THY)와 토드 휴이트 국물을 데워진.
    2. 문화가 중반 로그 단계 (상승률의 600 ㎚ ≈ 0.5 ~ 0.6)에 도달 할 때까지 37 ° C에서 정적으로 품어.

2. 막 탈분극과 파열을 검출

  1. 준비 시약
    1. DiBAC 4의 50 μm의 주식 (3) 100 % DMSO에서, 그리고 DDH 2 O.에서 PI의 2 ㎎ / ㎖ 재고를 준비 DiBAC 4 (3) 주식은 6 개월 이상 -20 ° C에서 안정적이다. PI의 주식은 6 개월 이상 4 ° C에서 안정적이다.
    2. 빛으로부터 보호하기 위해 호일 주식을 감싸십시오.
  2. 로딩박테리아
    1. 실온에서 10 분 동안 2,400 XG에서 원심 분리 단계 1.2.2에서 박테리아 세포 펠렛 및 2400 XG에서 다시 1X 인산 완충 생리 식염수 (PBS), 및 원심 분리기 10ml에 펠렛을 재현 탁, 상청액을 제거하여 두 번 씻어 10 분.
    2. 원래 볼륨에 PBS에 뜨는에 resuspend 펠렛을 제거합니다. 이 밀리리터 당 세균의 약 10 8 집락 형성 단위에 제공 할 것입니다. 세척 세포 (5 샘플에 대한 충분한) 1 ㎖를 제거하고 microcentrifuge 관에 배치합니다.
    3. 이 세포에 25 mM의 포도당의 최종 농도 포도당의 1 M 필터 살균 원액 (DDH 2 O에서 제조 및 0.45 μm의 필터를 통해 여과)의 25 μl를 추가하고 37 ° C 가열 블록에 품어 십오 분. 참고 :이 모든 ATP 의존 막 채널과 세포 성분을위한 에너지를 제공합니다. 이 단계에 대한 필요성은 실험에 따라 다를 수 있습니다.
    4. 50 μM DiBAC 4 (3) 주식의 5 μL 및 2 ㎎ / ㎖ PI 주식의 10 μl를 추가합니다. 이 각각 250 nM의 최종 농도 20 ㎍ / ㎖를 제공한다. 피펫 팅에 의해 여러 번 아래 철저하게 섞는다. 분명 96 - 웰 플레이트의 각 샘플 아니라이 세포 현탁액 200 μl를 추가합니다.
  3. 형광 검출
    1. 예비 가온 (37 ℃) 형광 검출 플레이트 리더의 장소 접시.
    2. 적절한 필터 DiBAC 4 (3) (490 nm의 여기, 516 nm의 방출)와 PI (535 nm의 여기, 617 nm의 방출) 검출 위치에 있는지 확인합니다.
    3. 독서가 안정 될 때까지 (3) 막에 약 30 ~ 40 분 동안 모든 분 형광 측정을 수행 할 수있는 리더를 설정하거나 DiBAC 4의 평형을 (그리고 동시에 모니터링)을 허용하기 위해,이는 "전처리"독서 역할을합니다.
    4. 접시를 꺼내 선택의 실험 에이전트를 추가하고 IMMEDiately DiBAC 4 원하는 시간에 대한 (3) 및 PI 형광 모니터링을 계속 독자에 다시 접시를 놓습니다. 멀티 채널 피펫을 사용하여 한 번에 여러 개의 샘플을 처리하는 것은 모든 우물에 동시에 에이전트를 추가하는 것이 도움이 될 수 있다면.
    5. Microsoft Excel과 같은 데이터 분석 프로그램으로 측정 값을 내 보냅니다. 막 탈분극과 파열을 평가하는 시간에 플롯 형광. DiBAC와 PI의 증가 형광 탈분극과 파열이 발생하고 있음을 나타냅니다.

3. 세포 내 칼슘 2 + 또는 K + 농도의 변화를 감지

  1. 준비 시약 및 로딩 버퍼
    1. 다음과 같은 시약을 준비 이온에 민감한 형광 염료의 5 mM의 재고 (fura-2/AM을 또는 PBFI / AM는, 염료의 50 μg을 포함하는 튜브에 DMSO의 적절한 금액을 추가), "100 배는"프로 베네 시드 (추가 1 77 mg을 유리 병에 PBS의 ML). 가용화염료는 -20 ° C 한 번에 냉동과 프로 베네 시드 6 개월 -20 ° C에서 용액에 안정되어있는 반면, 3 개월, 솔루션에 안정 될 수있다.
    2. 다음과 같이 2 배는 버퍼로드 1 ㎖를 준비 : 15 ML 플라스틱 원뿔 관의 바닥에, 5 mM의 이온 2 μL 다음 (6 개월 2-8 ° C에서 안정적) 100X PowerLoad 농축의 20 μl를, 분배 직접 PowerLoad에 민감한 염료. 소용돌이 간략하게 혼합한다. 100 배 프로 베네 시드 20 ㎕ 다음 PBS 960 μl를 추가합니다. 혼합 한 마지막 시간을 소용돌이. 빛으로부터 보호하기 위해 호일에 싸.
  2. 염료와 박테리아를로드
    1. 펠렛 및 2.2.1에 설명 된대로 중반 로그 단계 박테리아 문화를 씻는다. "2 배"세포 현탁액을 만들기 위해 PBS 5ml에 뜨는에 resuspend 펠렛을 제거합니다.
    2. 배 로딩 버퍼에 2 배의 세포 현탁액 1 ML을 추가합니다. 이는 2 ㎖의 최종 부피, 최종 concentr을 제공합니다1X PowerLoad, 5 μm의 형광 염료 및 1X의 프로 베네 시드의 관리 포인트. 참고 : 측정을 위해 각 샘플도 200 μl를 포함하는 것이기 때문에이 정지 10 샘플에 대한 충분한 음량을 제공합니다.
    3. 빛으로부터 보호 75 분 동안 37 ° C의 물을 욕조에 품어. 주 : 염료가 임의의 당분 해 기판 ​​부재와 염료의 유출을 최소화하는 프로 베네 시드의 존재 하에서 박테리아 세포에로드된다.
    4. WASH 1 : 10 분 2,400 XG에서 원심 분리하여 펠렛은 세포 상층 액을 제거하고, 2 ㎖의 PBS에 재현 탁은 1X 프로 베네 시드를 포함. WASH 2, 3 단계를 반복 3.2.4 배. 또 다른 30 ​​분 동안 37 ° C에서 알을 품다. 이 세균 에스 테라 제 시간 거리에 내면화 형광 염료의 AM 에스테르 그룹을 가수 분해 할 수 있습니다.
    5. WASH 4 : 10 분 2,400 XG에서 원심 분리하여 펠렛은 세포 상층 액을 제거하고에 resuspend 1X 프로 베네 시드를 포함하는 PBS 2 ㎖에. 참고 : experime에 따라NT, 포도당은 다시 활력을 불어 박테리아에 여기에 다시 추가 할 수 있습니다.
  3. 형광 검출
    1. 37 ° C.에 형광 검출 플레이트 리더 플레이트 리더를 Prewarm
    2. 원하는 각 샘플의 경우, 96 - 웰 플레이트의 우물 (단계 3.2.8에서)로드 셀 200 μl를 추가합니다. (한 번에 하나의 잘 / 샘플 완료 다음 단계를 수행).
    3. 의 ( "값 1"과 "값 2"에 대한 380 nm의 여기 / 510 nm의 방출을 위해 340 nm의 여기 / 510 nm의 방출) 형광을 측정하는 형광 검출 플레이트 리더에 잘 장소 접시 독서 기준을 설정하려면 1 분간 모든 초.
    4. 접시를 꺼냅니다 (약 5 μL의 작은 볼륨)이 아니라에 선택의 처리를 추가, 신속하게 피펫 몇 번 아래로 혼합하고, 즉시 원하는마다 초를 읽을 형광 검출 플레이트 리더에 다시 배치 시간의 길이. (만약에플레이트 리더와 관련된 젝터)이도 완벽하게 읽기를 중지하고 판을 배출 할 필요없이, 원하는 치료를 추가하는 데 사용할 수있는, 사용할 수 있습니다.
    5. Microsoft Excel과 같은 데이터 분석 프로그램으로 측정 값을 내 보냅니다. 값이 값 1로 분할하여 각각의 시간 지점에 대한 형광 값의 비율을 계산하고, 그래프의 비율 값을 플롯.

4. 세포 내 pH의 변화 감지

  1. 준비 시약 및 교정 버퍼
    1. 다음과 같은 시약을 준비 BCECF / AM의 5 mM의 주식은 (. 염료의 50 μg을 포함하는 튜브에 DMSO의 적절한 금액을 추가이 재고 3 개월 -20 ° C에서 안정), 100 배 프로 베네 시드 (1 ㎖의 추가 PBS 77 mg을 유리 병에). 에탄올 nigericin의 1 ㎜ 주식 준비는 주변 버퍼의 pH의 세포 (세포의 pH (산도 나는 평형 필수)이 주식들입니다6 개월 -20 ° C)에서 테이블;. DMSO (양성자 동기가되는 힘을 풀다하는 protonophore 카보 닐 시안화 3 chlorophenylhydrazone (CCCP)의 0.5 mM의 주식이 주식은 6 개월 -20 ° C에서 안정)
    2. 135 밀리 KH 2 PO 4 / 20 밀리미터의 NaOH (염기), 110 mM의 K 2 HPO 4 / 20 밀리미터의 NaOH (이염) : 다음과 같은 높은 칼륨 버퍼 10 ㎖를 준비합니다. 필터는 0.45 μm의 필터를 사용하여 멸균. (이 버퍼를 사용할 때까지 4 ° C에 저장할 수 있습니다.)
    3. 6.5-8.0까지 적어도 5-6 pH 값과 높은 칼륨 버퍼를 생성하기 위해 필요한 비율에 높은 칼륨 버퍼를 섞는다.
    4. 다음과 같이 2 배는 버퍼로드 1 ㎖를 준비 : 15 ML 플라스틱 원뿔 관의 바닥에 직접 PowerLoad에 5 mM의 이온 성 염료 20 ㎕ 다음에 100 배 PowerLoad의 40 μl를, 분배. 소용돌이 간략하게 혼합한다. 100 배 프로 베네 시드의 40 μL 다음 PBS 900 μl를 추가합니다. Vort예 혼합 한 마지막 시간. 빛으로부터 보호하기 위해 호일에 싸.
  2. 염료와 박테리아를로드
    1. 펠렛 및 2.2.1에 설명 된대로 중반 로그 단계 세균성 문화의 8 ㎖를 씻어. "배"세포 현탁액을 만들기 위해 PBS 2 ml의 상층 액에 resuspend 펠렛을 제거합니다.
    2. 배 로딩 버퍼에 4 배의 세포 현탁액 1 ML을 추가합니다. 이는 2 ㎖의 최종 부피, 배 세포의 최종 농도 2 배 PowerLoad, 50 μM 형광 염료 및 배 프로 베네 시드에 제공 할 것입니다.
    3. 빛으로부터 보호 40 분 동안 30 ° C의 물을 욕조에 품어. NOTE : 염료가 30 ° C의 낮은 온도에서 염료의 유출을 최소화 할 수있는 당분 해 기판의 부재하에 세균 세포에로드된다.
    4. WASH 1 : 펠렛 10 분 2,400 XG에 원심 분리하여 세포가 과잉 색소를 제거하는 상층 액을 제거하고, 4 ㎖의 PBS에 재현 탁 2 배 프로 베네 시드의를 포함차 1 mM의 포도당 (박테리아를 재 활성화하기 위해). WASH 2, 3 배 프로 베네 시드와 10 mM의 포도당을 함유하는 (1X 세포의 최종 농도) 4 ㎖의 PBS의 최종 재 부상과 두 단계를 반복합니다 4.2.7.
    5. 5 분 동안 37 ° C에서 알을 품다. 이것은 세포가 완전히 재충전 멀리 내재화 BCECF에서 AM 에스테르기를 절단하는 세균 에스 테라위한 시간을 허용하는 것을 허용 할 것이다.
  3. 배경 형광을 수립하고 생체 내 보정 곡선
    1. 37 ° C.에 형광 검출 플레이트 리더 플레이트 리더를 Prewarm
    2. 배경 형광을 확인하려면, 박테리아를 제거한다 (단계 4.2.7에서)로드 및 통전 세균 현탁액 500 μl를 필터 소독, 및 96 - 웰 플레이트의 웰에 여과 액을 200 μl를 추가합니다.
    3. (490 nm의 여기 / 530 nm의 방출 형광을 측정하는 형광 검출 플레이트 리더의 판을 놓습니다"값 1"1 분 "값 2")에 대한 440 nm의 여기 / 530 nm의 방출. 이 배경 형광이 검량선 및 실험 샘플 모두에 대한 비율을 계산하기 전에 감산한​​다.
    4. 생체 내 보정 곡선을 얻으려면 (6.5-8.0까지) 다른 pH 값에서 높은 칼륨 버퍼에서 한 번에 resuspend 단계 4.2.7에서로드 및 통전 세포를 500 ㎕의 분취 액을 씻어.
    5. 주변의 버퍼의 pH에​​ 세포의 세포 내 pH가 평형을 5 분 동안 37 ° C에서 배양 샘플에 20 μM의 nigericin를 추가합니다. 96 - 웰 플레이트의 우물에 세균 / pH 완충 조합의 200 μl를 추가합니다.
    6. 각 웰에 대한 꾸준한 독서를 확립하기 위해 몇 분 동안 형광을 측정하는 형광 검출 플레이트 리더 접시를 놓습니다. Microsoft Excel과 같은 데이터 분석 프로그램으로 측정 값을 내 보냅니다.
    7. 학사 학위를 뺀 후ckground 형광 값,이 값에 의해 값 1을 분할하여 형광 값의 비율을 계산한다. 검량선을 작성하기 위해 각각의 pH 완충액에 대한 비율 값을 플롯. (박테리아에로드되는 형광 염료의 양마다 다를 수 검량선은,로드 셀의 각 새로운 배치에 대해 생성되어야한다.)
  4. 세포 내 pH의 변화 측정
    1. 원하는 각 샘플의 경우, 96 - 웰 플레이트의 우물 (단계 4.2.7에서)로드와 활력 세포를 200 μl를 추가합니다.
    2. 형광 검출 플레이트 리더 접시를 놓고 5 분 동안 매 5 초마다 샘플의 형광을 측정합니다.
    3. 접시를 꺼내서 잘 하나 (세포 내 산도를 감소시키는 긍정적 인 제어 역할을) 다른 우물에 관심있는 실험 에이전트 (들)에 10 μM의 CCCP를 추가합니다. 정확하게, 시간이 지남에 따라 자신의 효과를 비교 오전를 사용하여 동시에 CCCP 선택의 에이전트를 추가하려면ultichannel 피펫.
    4. 즉시 플레이트 리더로 ​​판을 반환하고 형광 10 분 동안 매 5 초마다 측정을 계속합니다. 추가 컨트롤과 같은 접시를 꺼내 주변의 버퍼의 pH에 박테리아의 pH 나는 평형을 모든 샘플에 20 μM Nigericin을 추가하고 5 분 동안 읽습니다.
    5. 배경 형광 값을 뺀 후, 각 샘플에 대한 형광의 비율을 계산합니다. 검정 곡선의 각 읽기의 pH 나 보간.

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결과

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모든 실험의 경우, 하나의 샘플과 각각의 웰에 존재하는 조건의 집합이 있습니다. 따라서, 각각의 추적은 시간이 지남에 박테리아의 전체 인구의 형광 강도를 나타냅니다. 결과는 처리 샘플 및 치료 컨트롤의의 형광 사이에 명확한 구분으로, 쉽게 해석 할 수 있어야합니다. 형광의 관찰 된 변화의 속도론 및 정도는 모니터되는 이벤트의 가능한 메커니즘과 범위에 대한 정보를 제공 할 수 있었다.

멤브레인의 극성을 탐색 할 때, 박테리아는 치료 전 꾸준한 감소 및도 1a에 형광 후속 수평으로 나타낸 바와 같이, 멤브레인 위에 염료의 평형을 허용하기 위해 약 40 분 동안 DiBAC 함께 배양 할 필요가있다. 그림 1B에서와 같이 자사의 형광 신호가 처음 40 분 배양, BU에 걸쳐 꾸준로, PI는 평형을 필요로하지 않습니다DiBAC과 함께 자신의 존재를 톤은 극성과 동시에 막 파열을 모니터링하는 것이 도움이된다. ...

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토론

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크기 및 극성 막 및 박테리아 내 이온 농도의 변화의 무결성의 변화를 감지하는 전기 생리학 고전적인 방법을 사용하기 위해 제시 제한에도 불구하고, 우리는 S. 이러한 이벤트를 측정하는 방법을 설명했다 폐렴은 형광 염료를 사용. 우리의 프로토콜은 폐렴 구균 및 일반 세균 종에 대해 설명 된 몇 가지 중 하나에 대해 설명 자신의 종류의 첫번째이다. 형광 검출 플레이트 판독기를 사용하여 이러한 이벤트들은 시간이 지남에 박테리아의 개별 모집단으로부터 검출 형광성 박테리아의 소형, 200 μL 부피의 샘플을 측정 할 수있다. 형광 강도의 반응 속도와 변화는 질적으로 극성 또는 무결성을 막에 무슨 일이 일어나고 있는지를 결정하는 데 사용 될 수있다, 또는 칼슘 2 +, K +, 또는 박테리아 내에서 H +의 수준. 정량적으로 말하면, 형광 강도 값도 DEP의 정도를 계산하는데 사용될 수있다olarization, 파열, 칼슘 흡수, 칼륨 유출, 또는...

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공개 사항

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저자는 선언 할 경쟁 금전적 이해 관계가 없습니다.

감사의 글

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이 작품은 빌과 멜린다 게이츠 재단 (보조금 53,085), JR Oishei 재단과 미국 폐 협회 (부여 RG-123721-N) APH, 그리고 EAC에 NIH (NIDCD) 화목 F31DC011218에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Todd-Hewitt 육수Bacto, BD Diagnostics249240
효모 추출물Bacto, BD Diagnostics212750
인산염 완충 식염수(PBS, pH 7.2)인비트로겐(GIBCO)
디메틸설폭사이드시그마-알드리치D5879DMSO
DiBAC4(3)(bis-(1,3-dibutylbarbituric acid)트리메틴 옥소놀)Molecular ProbesB-438
Propidium IodideSigma-AldrichP4170Make up in deionized
D-(+)-GlucoseSigma-Aldrich
PowerLoadMolecular ProbesP10020100x concentrate
ProbenecidMolecular ProbesP3640077mg 바이알 1개에 PBS 1ml를 첨가하여 100배 스톡 만들기
Fura-2/AMMolecular ProbesF1221특수 포장(50 &마이크로; g 부분 표본)
PBFI/AMMolecular ProbesP1267Special packaging (50 µ g 분취)
니게리신시그마-알드리치N7143
KH2PO4JT Baker3246-01monobasic
NaOHJT Baker5565-01
K2HPO4JT Baker4012-01이염기성
BCECF/AM분자 프로브B1170특수 포장(50 &마이크로; g 분취량)
CCCP시그마-알드리치 원시체(Sigma-AldrichProtonophore)는 H+를 세포질로 유입시켜 전위와 H+ 구배를 소멸시킵니다.
문화 튜브 VWR53283-802Spectronic 분광 광도계에 적합합니다. 붕규산 유리
분광 광도계Thermo ScientificSpectronic 20D +
15 ml 플라스틱 원뿔형 튜브Corning430790
투명 96-웰 폴리스티렌 마이크로 타이터 플레이트Fisher Scientific12-565-501
플레이트 리더BioTekSynergy 2 다중 모드
Gen5 소프트웨어BioTekGen5™ 소프트웨어
water 는

참고문헌

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  1. Hakansson, A., Zhivotovsky, B., Orrenius, S., Sabharwal, H., Svanborg, C. Apoptosis induced by a human milk protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (17), 8064-8068 (1995).
  2. Hakansson, A., et al. A folding variant of alpha-lactalbumin with bactericidal activity against Streptococcus pneumoniae. Mol. Microbiol. 35 (3), 589-600 (2000).
  3. Hakansson, A. P., Roche-Hakansson, H., Mossberg, A. K., Svanborg, C. Apoptosis-Like Death in Bacteria Induced by HAMLET, a Human Milk Lipid-Protein Complex. PLoS One. 6 (3), (2011).
  4. Kohler, C., Gogvadze, V., Hakansson, A., Svanborg, C., Orrenius, S., Zhivotovsky, B. A folding variant of human alpha-lactalbumin induces mitochondrial permeability transition in isolated mitochondria. Eur. J. Biochem. 268 (1), 186-191 (2001).
  5. Ly, J. D., Grubb, D. R., Lawen, A. The mitochondrial membrane potential (Δψ m) in apoptosis; an update. Apoptosis. 8 (2), 115-128 (2003).
  6. Dominguez, D. C. Calcium signalling in bacteria. Mol. Microbiol. 54 (2), 291-297 (2004).
  7. Corratge-Faillie, C., Jabnoune, M., Zimmermann, S., Very, A. A., Fizames, C., Sentenac, H. Potassium and sodium transport in non-animal cells: the Trk/Ktr/HKT transporter family. Cell Mol. Life Sci. 67 (15), 2511-2532 (2010).
  8. Szabo, I., Petronilli, V., Zoratti, M. A patch-clamp study of Bacillus subtilis. Biochim. Biophys. Acta. 1112 (1), 29-38 (1992).
  9. Zoratti, M., Petronilli, V., Szabo, I. Stretch-activated composite ion channels in Bacillus subtilis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 168 (2), 443-450 (1990).
  10. Novo, D., Perlmutter, N. G., Hunt, R. H., Shapiro, H. M. Accurate flow cytometric membrane potential measurement in bacteria using diethyloxacarbocyanine and a ratiometric technique. Cytometry. 35 (1), 55-63 (1999).
  11. Novo, D. J., Perlmutter, N. G., Hunt, R. H., Shapiro, H. M. Multiparameter flow cytometric analysis of antibiotic effects on membrane potential, membrane permeability, and bacterial counts of Staphylococcus aureus and Micrococcus luteus. Antimicrob. Agents Chemother. 44 (4), 827-834 (2000).
  12. Shapiro, H. M. Membrane potential estimation by flow cytometry. Methods. 21 (3), 271-279 (2000).
  13. Shapiro, H. M. Microbial analysis at the single-cell level: tasks and techniques. J. Microbiol. Methods. 42 (1), 3-16 (2000).
  14. Bashford, C. L., Chance, B., Smith, J. C., Yoshida, T. The behavior of oxonol dyes in phospholipid dispersions. Biophys. J. 25 (1), 63-85 (1979).
  15. Suzuki, H., Wang, Z. -Y., Yamakoshi, M., Kobayashi, M., Nozawa, T. Probing the transmembrane potential of bacterial cells by voltage-sensitive dyes. Anal. Sci. 19 (9), 1239-1242 (2003).
  16. Breeuwer, P., Abee, T. Assessment of the membrane potential, intracellular pH and respiration of bacteria employing fluorescence techniques. Mol. Microb. Ecol. Manual. 8, 1563-1580 (2004).
  17. Mortimer, F. C., Mason, D. J., Gant, V. A. Flow cytometric monitoring of antibiotic-induced injury in Escherichia coli using cell-impermeant fluorescent probes. Antimicrob. Agents Chemother. 44 (3), 676-681 (2000).
  18. Clementi, E. A., Marks, L. R., Duffey, M. E., Hakansson, A. P. A Novel Initiation Mechanism of Death in Streptococcus pneumoniae Induced by the Human Milk Protein-Lipid Complex HAMLET and Activated during Physiological Death. J. Biol. Chem. 287 (32), 27168-27182 (2012).
  19. Trombe, M. C., Laneelle, G., Sicard, A. M. Characterization of a Streptococcus pneumoniae mutant with altered electric transmembrane potential. J. Bacteriol. 158 (3), 1109-1114 (1984).
  20. Trombe, M. C. Characterization of a calcium porter of Streptococcus pneumoniae involved in calcium regulation of growth and competence. J. Gen. Microbiol. 139 (3), 433-439 (1993).
  21. Marks, L. R., Clementi, E. A., Hakansson, A. P. Sensitization of Staphylococcus aureus to Methicillin and Other Antibiotics In Vitro and In Vivo in the Presence of HAMLET. PLoS ONE. 8 (5), (2013).
  22. Futsaether, C. M., Johnsson, A. Using fura-2 to measure intracellular free calcium in Propionibacterium acnes. Can. J. Microbiol. 40 (6), 439-445 (1994).
  23. Tisa, L. S., Adler, J. Chemotactic properties of Escherichia coli mutants having abnormal Ca2+ content. J. Bacteriol. 177 (24), 7112-7118 (1995).
  24. Werthen, M., Lundgren, T. Intracellular Ca2+ mobilization and kinase activity during acylated homoserine lactone-dependent quorum sensing in Serratia liquefaciens. J. Biol. Chem. 276 (9), 6468-6472 (2001).
  25. Avery, O. T., MacLeod, C. M., McCarty, M. Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types. Induction of transformation by a dexoxyribonuceic acid fraction isolated from pneumococcus type III. J. Exp. Med. 79, 137-158 (1944).
  26. Clementi, E. A., Wilhelm, K. R., Schleucher, J., Morozova-Roche, L. A., Hakansson, A. P. A Complex of Equine Lysozyme and Oleic Acid with Bactericidal Activity against. PLoS One. . 8, (2013).

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