진핵 생물에 본 것과 달리, 주로 작은 크기로 박테리아의 세부 막 탈분극 및 이온 농도 변화 측정 어려운 종래의 방법을 만드는 것이 연구의 소수가있다. 여기, 우리 형광 기술을 이용하여 중요한 그람 양성 병원균 폐렴 구균에 이러한 이벤트를 모니터링하기위한 세부 프로토콜.
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방법 논문
막 극성, 멤브레인 무결성 및 세포 내 이온 농도의 모니터링 변경
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
막 탈분극과 이온 플럭스로 인해 깊이 지학 및 신호 transductions 등의 세포 기능을 영향을 미칠 수있는 능력을 생물학적 시스템에서 광범위하게 연구 된 이벤트입니다. 전극 사용량 및 패치 클램프 등 모두 형광 및 전기 생리 방법은, 잘 진핵 세포에서 이러한 이벤트를 측정하기 위해 개발되었지만, 미생물의 유사 이벤트를 측정하기위한 방법은 더 복잡와 함께 그들의 작은 크기 관련 개발하기 위하여 도전 입증 멤브레인을 차폐 박테리아의 외면. 폐렴 구균 (폐렴 구균)의 죽음을 시작으로 우리의 연구 기간 동안, 우리는 극성의 변화, 무결성, 세포 내 이온 농도 등의 막 이벤트의 역할을 명료하게하고 싶었다. 문헌 검색, 우리는 거의 연구가 존재하는 것으로 나타났습니다. 다른 연구자들은 이온 독감을 측정하는 방사성 동위 원소의 흡수 또는 평형을 모니터링했다XES과 막 잠재력과 주로 그람 음성균에있는 연구의 제한된 수의, 막 전위를 측정하는 carbocyanine 또는 옥소 놀 형광 염료를 사용, 또는 (AM) 에스테르 버전 세포 투과 아세와 박테리아를로드하는 일부 성공을 볼 수 없었다 이온 성 형광 표시기 염료. 따라서 우리는 그람 양성 유기체 S.에서 막 전위, 파열, 이온 수송을 측정하기위한 프로토콜을 설립 최적화 폐렴. 우리의 방법이 최적의 비율 적 염료 AM 에스테르와 폐렴 구균을로드로 각각 막 탈분극 및 파열을 측정뿐만하는 비스 - 옥소 놀 염료 DiBAC 사 (3) 및 휴대 impermeant 염료 프로피 듐 요오다 이드를 사용하는 프로토콜을 개발 의 Fura-2, PBFI 및 BCECF은 형광 검출 플레이트 리더를 사용하여, 칼슘 2 +, K +, H +를 각각의 세포 내 농도의 변화를 검출한다. 이러한 프로토콜은 폐렴 구균에 대한 자신의 종류의 첫번째입니다이들 염료의 대부분은 다른 세균 종에 사용되지 않았다. 우리의 프로토콜은 S.에 최적화되어 있지만 폐렴, 우리는 이러한 접근 방식이 다른 종의 박테리아에서 유사한 연구를위한 훌륭한 출발점을 형성해야한다 생각합니다.
서론
우리 연구실은 종양 세포의 세포 사멸을 유도 (종양 세포에 치명적인 만든 인간의 알파 - 락트 알부민을위한) 햄릿이라는 인간의 우유에서 단백질 지질 복합체를 확인뿐만 아니라, 세균 종 1,2의 다양한 죽일 수있다. 특히 민감한 것으로 발견 된 종은 최대 감도와 죽음 2,3의 세포 사멸과 같은 표현형을 표시하는 폐렴 구균 (폐렴 구균)와 호흡 기관을 대상으로 그들이었다. 막 탈분극과 특정 이온 전송 이벤트는 잘 설명하고 방사성 TPP + 이온과 JC-1과 TMRE 등의 형광 염료는 미토콘드리아 막 3의 탈분극을 설명하는 데 사용 된 미토콘드리아, 특히 진핵 세포에서 세포 사멸 중에 중요한 이벤트 -5. 따라서, 우리는 우리가 우리의 노력을 집중으로 폐렴 구균 이러한 막 관련 기능에 햄릿의 효과에 대한 자세한 내용을 보려면 모색그 과정에서 새로운 항균 치료 또는 백신 후보를 식별하기위한 큰 잠재력을 가진 박테리아의 세포 사멸과 같은 표현형의 기계적 구성 요소의 더 나은 이해를 개발할 수 있습니다.
우리 역학적 연구를위한 프로토콜을 확립하고자, 우리는 진핵 시스템에서 잘 설명 된 방법론 달리 박테리아 막 6,7의....
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프로토콜
1. 세균 배양을 준비
- 실험에 사용하기 위해 문화를 성장
- 37 ° C에서 가열 블록에서 S.의 고정 된 주식 병을 녹여 폐렴과 신선한 9 ml의 내용을 추가, 유리 문화 튜브에 10 ㎖의 총 볼륨의 0.5 % 효모 추출물 (THY)와 토드 휴이트 국물을 데워진.
- 문화가 중반 로그 단계 (상승률의 600 ㎚ ≈ 0.5 ~ 0.6)에 도달 할 때까지 37 ° C에서 정적으로 품어.
2. 막 탈분극과 파열을 검출
- 준비 시약
- DiBAC 4의 50 μm의 주식 (3) 100 % DMSO에서, 그리고 DDH 2 O.에서 PI의 2 ㎎ / ㎖ 재고를 준비 DiBAC 4 (3) 주식은 6 개월 이상 -20 ° C에서 안정적이다. PI의 주식은 6 개월 이상 4 ° C에서 안정적이다.
- 빛으로부터 보호하기 위해 호일 주식을 감싸십시오.
- 로딩박테리아
- 실온에서 10 분 동안 2....
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결과
모든 실험의 경우, 하나의 샘플과 각각의 웰에 존재하는 조건의 집합이 있습니다. 따라서, 각각의 추적은 시간이 지남에 박테리아의 전체 인구의 형광 강도를 나타냅니다. 결과는 처리 샘플 및 치료 컨트롤의의 형광 사이에 명확한 구분으로, 쉽게 해석 할 수 있어야합니다. 형광의 관찰 된 변화의 속도론 및 정도는 모니터되는 이벤트의 가능한 메커니즘과 범위에 대한 정보를 제공 할 수 있었다.
멤브레인의 극성을 탐색 할 때, 박테리아는 치료 전 꾸준한 감소 및도 1a에 형광 후속 수평으로 나타낸 바와 같이, 멤브레인 위에 염료의 평형을 허용하기 위해 약 40 분 동안 DiBAC 함께 배양 할 필요가있다. 그림 1B에서와 같이 자사의 형광 신호가 처음 40 분 배양, BU에 걸쳐 꾸준로, PI는 평형을 필요로하지 않습니다DiBAC과 함께 자신의 존재를 톤은 극성과 동시에 막 파열을 모니터링하는 것이 도움이된다. .......
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토론
크기 및 극성 막 및 박테리아 내 이온 농도의 변화의 무결성의 변화를 감지하는 전기 생리학 고전적인 방법을 사용하기 위해 제시 제한에도 불구하고, 우리는 S. 이러한 이벤트를 측정하는 방법을 설명했다 폐렴은 형광 염료를 사용. 우리의 프로토콜은 폐렴 구균 및 일반 세균 종에 대해 설명 된 몇 가지 중 하나에 대해 설명 자신의 종류의 첫번째이다. 형광 검출 플레이트 판독기를 사용하여 이러한 이벤트들은 시간이 지남에 박테리아의 개별 모집단으로부터 검출 형광성 박테리아의 소형, 200 μL 부피의 샘플을 측정 할 수있다. 형광 강도의 반응 속도와 변화는 질적으로 극성 또는 무결성을 막에 무슨 일이 일어나고 있는지를 결정하는 데 사용 될 수있다, 또는 칼슘 2 +, K +, 또는 박테리아 내에서 H +의 수준. 정량적으로 말하면, 형광 강도 값도 DEP의 정도를 계산하는데 사용될 수있다olarization, 파열, 칼슘 흡수, 칼륨 유출, 또는.......
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공개 사항
저자는 선언 할 경쟁 금전적 이해 관계가 없습니다.
감사의 글
이 작품은 빌과 멜린다 게이츠 재단 (보조금 53,085), JR Oishei 재단과 미국 폐 협회 (부여 RG-123721-N) APH, 그리고 EAC에 NIH (NIDCD) 화목 F31DC011218에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Todd-Hewitt 육수 | Bacto, BD Diagnostics | 249240 | |
| 효모 추출물 | Bacto, BD Diagnostics | 212750 | |
| 인산염 완충 식염수(PBS, pH 7.2) | 인비트로겐(GIBCO) | ||
| 디메틸설폭사이드 | 시그마-알드리치 | D5879 | DMSO |
| DiBAC4(3)(bis-(1,3-dibutylbarbituric acid)트리메틴 옥소놀) | Molecular Probes | B-438 | |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | Make up in deionized |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | ||
| PowerLoad | Molecular Probes | P10020 | 100x concentrate |
| Probenecid | Molecular Probes | P36400 | 77mg 바이알 1개에 PBS 1ml를 첨가하여 100배 스톡 만들기 |
| Fura-2/AM | Molecular Probes | F1221 | 특수 포장(50 &마이크로; g 부분 표본) |
| PBFI/AM | Molecular Probes | P1267 | Special packaging (50 µ g 분취) |
| 니게리신 | 시그마-알드리치 | N7143 | |
| KH2PO4 | JT Baker | 3246-01 | monobasic |
| NaOH | JT Baker | 5565-01 | |
| K2HPO4 | JT Baker | 4012-01 | 이염기성 |
| BCECF/AM | 분자 프로브 | B1170 | 특수 포장(50 &마이크로; g 분취량) |
| CCCP | 시그마-알드리치 원시체(Sigma-Aldrich | Protonophore)는 H+를 세포질로 유입시켜 전위와 H+ 구배를 소멸시킵니다. | |
| 문화 튜브 | VWR | 53283-802 | Spectronic 분광 광도계에 적합합니다. 붕규산 유리 |
| 분광 광도계 | Thermo Scientific | Spectronic 20D + | |
| 15 ml 플라스틱 원뿔형 튜브 | Corning | 430790 | |
| 투명 96-웰 폴리스티렌 마이크로 타이터 플레이트 | Fisher Scientific | 12-565-501 | |
| 플레이트 리더 | BioTek | Synergy 2 다중 모드 | |
| Gen5 소프트웨어 | BioTek | Gen5™ 소프트웨어 |
참고문헌
- Hakansson, A., Zhivotovsky, B., Orrenius, S., Sabharwal, H., Svanborg, C. Apoptosis induced by a human milk protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (17), 8064-8068 (1995).
- Hakansson, A., et al. A folding variant of alpha-lactalbumin with bactericida....
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재인쇄 및 허가
