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방법 논문

배아 전뇌에서 내피 세포의 분리 및 문화

15.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/51021

⸱

2014년 1월 23일

 , 
1Department of Psychiatry, Harvard Medical School, 2Angiogenesis and Brain Development Laboratory, Division of Basic Neuroscience, McLean Hospital

이 논문에서

요약

이 비디오 10-12 일 이내에 배아 전뇌에서 내피 세포의 순수 문화의 준비를위한 간단하고 신뢰할 수있는 전략을 설명하고 뇌 혈관의 여러 측면에 초점을 맞춘 연구를 위해 도움이 될 것입니다.

초록

배아 뇌 혈관 내피 세포는 혈관 및 신경 혈관 개발 및 상호 작용의 연구에 중요한 도구 역할을 할 수 있습니다. 배아 전뇌, pial 뇌실 주위 백질의 두 혈관 네트워크는 공간적 특징이며, 서로 다른 기원과 성장 패턴이 있습니다. pial과 뇌실 주위 혈관 네트워크에서 내피 세포는 고유의 유전자 발현 프로파일과 기능을 가지고 있습니다. 여기서 우리는 배아 전뇌 (telencephalon)의 뇌실 주위 혈관 네트워크 (PVECs)에서 내피 세포의 순수한 인구의 분리, 배양 및 검증을위한 단계별 프로토콜을 제시한다. 이 방법에서는, 배아 일 15 쥐에서 얻은 pial 막의없는 telencephalon는, 다진 콜라게나 / 디스 파제로 소화, 단일 세포 현탁액으로 기계적으로 분산. PVECs은 강한 자석을 사용하여 마이크로 비드에 접합 anti-CD-31/PECAM-1 항체와 긍정적 인 선택을 사용하여 세포 현탁액에서 정제된다분리 방법. 그들이 합류하고 추가 계대 배양 될 때까지 정제 된 세포는 내피 세포 배양 배지에서 콜라겐 1 코팅 된 배양 접시에서 배양한다. 위상차 광학 현미경과 형광 현미경에 의해 시각으로 PVECs,이 프로토콜 전시 조약돌 스핀들 모양의 표현형을 얻을. PVEC 문화의 순도는 내피 세포 마커로 설립되었습니다. 우리 손에,이 방법은 확실하고 일관되게 PVECs의 순수한 인구를 산출한다. 이 프로토콜은, 전뇌 혈관 신생에 기계적인 통찰력을 얻고 PVEC 상호 작용 및 신경 세포 유형과 상호 대화를 이해하고 치료 혈관 신생에 대한 엄청난 잠재력을 보유하기위한 연구를 도움이 될 것입니다.

서론

혈관, 신경 및 신경 세포의 이주는 중추 신경계 (CNS) 개발, 수리 및 재생에 중요한 이벤트입니다. 여러 우아한 연구는 내피 세포 용해 인자의 방출을 통해 직접 접촉에 의해 신경 세포의 증식과 그 반대를 자극하는 것으로 나타났습니다. 우리는 호기심이 신경 전구 세포 / 신경 줄기 세포가 배아의 뇌에서 분리하는 동안 이러한 연구 1-3의 대부분에서, 그들은 성인의 뇌, 다른 성인 조직 소스, 또는 내피 세포 라인에서 내피 세포와 공 배양 된 것으로 나타났습니다. 이 부분에서 배아 뇌에서 혈관 내피 세포의 순수한 인구를 분리하고 배양과 관련된 기술적 인 문제로 인해 수 있습니다. 그러나, 혈관, 신경 및 신경 세포의 이동은 정상 성인의 뇌에 비해 배아 뇌의보다 강력한 규모의 명령에서 발생하는 동시 이벤트입니다. embryoni의 뇌실 주위 혈관 네트워크C의 전뇌 (telencephalon)는 기저핵 primordium 내에 위치한 용기에서 유래 및 배아 일 11 (E11) 4,5에 의해 telencephalon을 등쪽에 복부에서 질서 그라데이션의 형태로 개발하고 있습니다. 뇌실 주위 혈관 네트워크의 혈관이 혈관 따위의 기원, 해부학 적 위치, 성장 패턴 및 개발 규제 4.5에 따라 pial 혈관에서 구별된다. 뇌실 주위 혈관의 그라데이션의 전파 방향은 telencephalic 가로 neurogenetic 그라데이션과 일치합니다. telencephalon 내에서 뇌실 주위 혈관의 그라데이션 및 마이그레이션 GABA 신경 세포의 기울기가 접선 ​​방향으로뿐만 아니라 공간적으로 6 겹칩니다. 타이밍에 대하여, 혈관 신생 구배는 약 하루 neurogenetic 구배 및 GABA 뉴런 구배 앞서있다. 따라서, 뇌실 주위 내피 세포는 공간적이며 시간적 잘 telencephalic 신경을 지원하는 중요한 단서를 제공하는 위치 결정신경 세포의 이주 4,6. 따라서, 신경 전구 세포 및 / 또는 신경 세포와 공 배양 실험에서 배아 뇌실 주위 내피 세포의 사용은 뇌 혈관의 상호 작용을 공부하고 신경 퇴행성 질환이나 허혈성 / 외상성 뇌 손상의 치료를위한 새로운 수단을 개발하기위한보다 유리한 모델을 제공 할 것이다.

우리는 상피 세포의 오염을 제한 할뿐만 아니라, 분자 및 뇌실 혈관 네트워크 4,6 (pial되는 EC 구별하기 칭했다 PVECs)의 내피 세포에서 기능적으로 구별되는 pial 내피 세포를 분리하는 것뿐만 아니라, pial 막 제거의 중요성을 강조 . 여기에서, 우리는 우리가 일상적으로 PVECs의 풍부하고 순수한 수율을 얻을 수 있도록 실험실에서 사용하는 방법에 대해 설명합니다. 이 내피 세포는 하나의 정해진 임신 마우스에서 분리 된 배아 forebrains에서 준비가되어 있습니다. 그들은 나중에 사용하기 위해 성공적으로 확장 계대 배양, 아래로 고정 할 수 있습니다.

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프로토콜

1. 시약 및 솔루션의 준비

  1. 35mm 문화 요리의 코팅 : 콜라겐 타입 1 용액은 20 mM의 아세트산 (~ 100 mg의 단백질 / 유리 병)의 수용액으로 공급된다. 무균 조직 배양 등급의 물을 사용하여 0.01 %의 작업 농도로 콜라겐 용액의 적절한 볼륨을 희석. 1 실온 (RT)에서 3 ~ 4 시간 동안 콜라겐 솔루션의 ML 37 ° C, 또는 밤새 2-8 ° C에서와 코트 요리 코팅 접시에서 여분의 용액을 제거하고 밤새 건조 할 수 있습니다. 미디어를 추가하기 전에 조직 문화 등급 물 또는 PBS와 함께 요리를 씻어. 코팅 요리는 한 달 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
  2. 완전한 둘 베코의 수정 이글 중간 (DMEM)을 준비합니다. (, 1 ml/100 ML 1X 농도) 10 % FBS와 항생제 항진균 솔루션 DMEM (500 ㎖) 보완. 전체 DMEM는 두 달 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
  3. 분취 DNA 분해 효소 I (0.001 ㎎ / ㎖)과의 DMEM (50 ㎖)을 준비하고, (D라고도MEM-DNA 분해 효소 I).
  4. 콜라게나 제와 디스 파제 (DMEM-collagenase/dispase라고 함) (1 ㎎ / ㎖)로 DMEM의 또 다른 분취 액 (10 ㎖)을 준비한다.
  5. EGF (5 μg)로 보충 내피 세포 배양 매체 (ECCM, 500 ㎖), 준비, 심전도 (100 mg)을하고 항생제 항진균 솔루션의 5 μL. ECCM은 두 달 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
  6. 사용하기 전에 모든 미디어를 Prewarm.
  7. 0.5 % BSA, 2 mM의 EDTA와 PBS, pH를 7.2 : 정화 버퍼를 준비합니다. 차가운 버퍼를 유지 (2-8 ° C).

2. Telencephalon의 태아 및 해부 제거

실험 동물을 사용하는 모든 실험은 맥린 병원의 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 및 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH의 지침을 준수하고 있습니다.

  1. 시간이 초과 임신 CD1 마우스 (배아 일 15)를 사용합니다. 질 플러그 발견의 날은 배아 일 0 (E0)로 간주됩니다. CD1 댐은 일반적으로 큰 새끼를 생산, 그래서 10 ~ 12 배의는 임신 댐에서 예상된다.
  2. 자궁 절개술의 경우, 케타민 (100 ㎎ / ㎏) / 자일 라진 (5 ㎎ / ㎏)의 복강 내 주사로 임신 한 쥐를 마취. 쥐 20 ~ 30의 G, 10 ㎖ / kg 케타민 / 자일 라진 마취 솔루션의 0.3 ML를 제공하고 그 고통을 확인하고 조난 마취의 복강 내 주사시 최소한의 것입니다. 주사를 손 구속을 사용합니다.
  3. 발가락 핀치에 의해 깊은 마취를 확인합니다. 깊이 마취 생쥐에서 배아를 제거합니다. 바로 어머니로부터 제거시 각각의 배아 목을 벨. 얼음 차가운 PBS의 멸균 페트리 접시에 배아 머리를 놓습니다.
  4. 2013 판 : 마취제를 과다 복용 (130 ㎎ / ㎏ 펜토 바르 비탈, IP), 동물의 안락사에 대한 AVMA 가이드 라인과 일치 안락사를위한 방법으로 즉시 안락사에 의해 자궁 적출술을 따르십시오.
  5. 스테레오 현미경, 미세 마이크로 팁 가위와 미세 집게로 머리에서 뇌를 제거합니다. 참고 : 높은 품질의 해부를이온 성공적으로 배아 뇌에서 pial 막을 제거하는 것이 필수적입니다. 이것은 연습에 의해 달성된다. 미세 집게와 마이크로 팁 가위는 좋은 해부를 가져 오기위한 중요한 도구입니다.
  6. pial 막을 벗겨하는 두뇌와 마이크로 팁 가위에 확고한 그립을 얻을 수있는 집게를 사용합니다. 중뇌와 metencephalon를 제거하고 telencephalon을 격리 할 것. 얼음에 2 ㎖의 PBS와 35mm 배양 접시에있는 모든 배아에서 pial없는 telencephalon을 전송합니다.

3. 세포 격리

  1. 메스 블레이드 1-2 밀리 조각으로 telencephalon을 말하다하고 완전한 DMEM 2 ㎖를 포함하는 15 ML 팔콘 튜브에 조직을 수집합니다.
  2. 수풀이 사라지고 유백색 현탁액을 얻을 때까지 1 ㎖ 피펫으로 부드럽게하지만 철저하게 조직을 떼어 놓다.
  3. 원심 분리기는 RT에서 5 분 동안 800 ~ 1,000 XG에서 세포를 분해.
  4. 조심스럽게 CE 해리 부드럽게 DME​​M-DNA 분해 효소 I.에서 뜨는에 resuspend 펠렛을 제거LLS 다시 실온에서 5 분 동안 800 ~ 1,000 XG에서 1 ㎖ 피펫과 원심 분리기를 사용하여.
  5. 따뜻한 완전한 DMEM에서 펠렛을 재현 탁. 멸균 70 μm의 나일론 메쉬 필터를 통해 세포. 필터링 된 세포를 수집하고 얼음에 보관.
  6. 메시에 보관 세포 일부를 수집하고 실온에서 1 ~ 2 분 동안 DMEM-collagenase/dispase (2 ml)로 더 소화. RT에서 5 분 동안 800 ~ 1,000 XG에서 원심 분리를 통해 DMEM-DNA 분해 효소 나 세포 배를 씻으십시오. 단계 3.5에서 수집 한 필터링 된 세포와이 세포 해변. 완전한 DMEM에 한 번 전체 세포를 씻으십시오. 휴대폰 번호 및 자기 라벨 단계를 결정하기 위해 진행합니다. 주 : 자기 라벨링 전에 단일 세포 현탁액을 얻는 것이 중요하다.

4. 자기 레이블

  1. 이 프로토콜은 10 7 세포의 자기 라벨을 보여줍니다. 세포 수의 경우보다 낮은 10 7은 동일한 시약 볼륨을 사용하는 세포 수에 대한보다 큰 10 7, 모든 시약 볼륨과 전체 볼륨을 확장이에 따라 (예를 들어, 2 × 10 7 합계 셀에 대한 모든 지시 시약의 두 배 볼륨을 사용). 얼음의 모든 시약 및 세포를 유지합니다.
  2. 혈구와 세포 수를 결정합니다.
  3. RT에서 10 분 300 XG에 원심 분리기 세포 현탁액. 대기음이 완전히 뜨는.
  4. CD31 마이크로 비즈의 10 μL 다음 세포 펠렛을 정화 버퍼의 90 μl/10 7 세포를 추가합니다. 제조사에 의해 제공된 마이크로 비드 항 마우스 CD31 항체 단클론 접합된다.
  5. 잘 섞어 냉장고에 15 분 동안 품어. 참고 : 자기 라벨 동안 높은 온도 및 / 또는 더 긴 배양 시간이 비특이적 결합이 발생할 수 있습니다.
  6. 10 분 300 XG에서 정화 버퍼와 원심 분리기의 1-2 ml/10 7 세포를 추가하여 세포를 씻으십시오. 정화 버퍼 500 μL에 뜨는에 resuspend 세포를 제거합니다. 자기 분리 또는 정제 단계로 넘어갑니다.

5. 푸rification

  1. MACS 분리기의 자기 분야에서 MS의 열을 놓습니다.
  2. 정화 버퍼 500 μL에 열을 씻어.
  3. 칼럼에 세포 현탁액을 적용합니다. 높은 세포 수는 열을 방해 할 수 있으므로 MS의 열을 셀의 해당 번호를 넣습니다. 주의 : 각 MS의 열은 열을 사용, 높은 세포 수에 대한 2 × 10 7 세포의 최대 수를 수용 할 수 있습니다.
  4. 수집 및 레이블이없는 세포를 포함하는 흐름을 통해 폐기하십시오.
  5. 정화 버퍼 500 μL로 3 회 열을 씻으십시오. 세척 단계에서, 열 저장 후속 정화 버퍼 분주을 추가하기 전에 비어 있는지 확인합니다.
  6. MACS 분리기에서 열을 제거하고 15 ML 팔콘 튜브에 놓습니다.
  7. 플런저는 MS의 칼럼과 함께 제공됩니다. 피펫 MS의 칼럼에 즉시 정화 버퍼의 1 ㎖를 단단히 열에 플런저를 밀어 자기 표지 세포를 세척하십시오.
  8. 플레이트 CEL콜라겐 1 형 프리 코트와 95 % O 2 5 % CO 2와 37 ° C로 설정 인큐베이터에 ECCM의 세포를 성장 35mm 배양 접시에 LS.
  9. 4 일마다 매체를 변경합니다. 요리가 합류 할 때 10~12일 후 실험 또는 하위 문화에 대한 PVECs를 사용합니다.

6. PV ECS의 서브 컬쳐

  1. ECCM을 제거하고 멸균 PBS의 1 ~ 2 ㎖로 PVECS의 단층을 씻어.
  2. 조심스럽게 세포 단일 층을 포함하는 0.25 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션의 1.5 ML를 추가합니다.
  3. 인큐베이터에 접시를 반환합니다. 5-7 분 내에 세포 접시의 표면으로부터 분리된다.
  4. 세포를 분리 한 후, 즉시 트립신 억제제의 동량을 추가하고 여러 번 씹다.
  5. 멸균 15 ML 팔콘 튜브에 세포를 전송합니다. 5 분 동안 500 XG에서 튜브를 원심 분리기.
  6. 뜨는을 제거하고 예비 가온 ECCM의 1 ml의 펠렛을 재현 탁.
  7. 문화, 메신저를 확장하기위한 세포를 씨앗노화 또는 다른 분석.

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결과

하루 1-12 PVECs의 표현형 특성은 위상 대비 광학 현미경 (그림 2)으로 표시됩니다. 세포 분열 (그림 2A)의 1 일 쇼 형태 특성에 접시에 부착 된 세포. 5-8일 사이에 자갈 돌에서 PVECs의 전환은 내피 세포 (그림 2B 및 2C)의 생체 상태에 더 가깝다 전형적인 모양의 형태를 스핀들. 하루 12 PVEC 문화 전체 합류 (그림 2D)을 달성한다. PVECs 식민지 (그림 2E-G)를 확장하기 쉽게 계대 배양 할 수있다. 내피 세포 배양의 순도는 내피 세포 마커로 설립되었습니다 - Isolectin B4, CD-31/PECAM-1, 폰 빌레 브란트 인자 (vWF가) 및 VE-cadherin의와 하위 문화 (그림 2H-K) 후 백 %로 측정되었다.

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토론

PVEC의의는 더 생리학 관련 신경 혈관의 상호 작용에 초점을 맞추고 연구를위한 다른 조직 소스에서 성인 뇌의 내피 세포와 내피보다도 치료 가능성이있다. PVEC 준비, 그것은 죽은 세포가 CD31 마이크로 비드에 비특이적으로 결합 할 수 있기 때문에 좋은 가능성을 달성하기 위해 빠른 작업 박리 중요한 시작입니다. 단일 세포 현탁액은 종래 자기 라벨링 단계에 도달하지 않은 경우 세포 덩어리가 열을 막는 것이므로 또, 이것은, 문제가 발생할 것이다. 이 방법의 장점은 자성 비드의 세포를 분리하는 트립신으로 인큐베이션 대한 필요, EC 제제 4,7 다른 마그네틱 비드 기반의 분리 방법에 사용되는 시간과 종종 어려운 공정이 없다는 점이다. 또,이 분리 방법은 배아 뇌 조직의 대량을 필요로하지 않는다. PVEC의 일관 입히는 Appr있는 단일 정해진 임신 마우스를 이용하여 제조 할 수있다oximately 십이일, 계대 배양하고, 시험관의 다양한 생체 내 실험에 사용 하였다.

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공개 사항

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

감사의 글

이 작품은 정신 분열증 연구에 대한 국가 연합과 우울증 (NARSAD) 젊은 연구자 상과 건강의 국립 연구소 AV에 R01NS073635을 부여에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
DNase I시그마D-4527 
콜라겐, 쥐 꼬리에서 추출한 타입 1 용액 시그마C3867 
DPBS품질 생물학적 제제114057-131 
EDTA피셔 사이언티픽M4055 
BSA시그마A2058 
MS 칼럼Miltenyi Biotech130-042-201 
CD31 마이크로비즈Miltenyi Biotech130-097-418 
MACS 분리기Miltenyi Biotech130-042-102 
MACS 멀티 스탠드Miltenyi Biotech130-042-303 
세포 여과기 70 µ mBD 생명과학352350 
항생제 및 항진균 용액SigmaA5955 
FBS시그마F4135 
콜라겐 분해 효소 / 디스 파제로슈10269638001 
DMEM 론자12-604F 
35mm 배양 접시BD Bioscience353001 
15 ml 팔콘 튜브 BD 생명과학352097 
50ml 팔콘 튜브BD Bioscience352098 
ECCM 키트BD Bioscience355054키트는 내피 세포 성장 보충제, EGF 및 대두 트립신 억제제
내피 세포 성장 보충제 (ECGS)BD Bioscience354006 
RBECGM셀 응용R819-500 
DMEM F12 생명 기술10565-018 
글루타맥스라이프 테크놀로지305050-061 
조직 배양 등급 물생명 기술15230162 
0.25% 트립신라이프 테크놀로지15050 
대두 트립신 억제제BD Bioscience5425 
마트리겔BD 바이오사이354234 
Qtracker 655 세포 라벨링 키트Life TechnologiesQ25021 
CellLight 플라즈마 멤브레인-RFP, BacMam 2.0Life TechnologiesC10608 
비오틴화 이소렉틴 B4 항체시그마L2140 
안티-폰 윌레브란트 팩터시그마F3520 
안티-CD31/PECAM-1BD 파밍겐550274 
Vector Laboratories사용한 VECTASHIELD 하드셋 마운팅 미디어H-1500 
케타민버틀러 Schein 동물 건강 공급44028 
자일라진로이드 연구소1009 
실체현미경MoticSMZ-168 
혈구계Fisher Scientific267110 
도립 현미경Olympus CK-40CK-40 
형광 현미경Olympus FSX-100FSX-100 
세밀한 펜치Roboz 수술 기구7 inox 
세밀한 마이크로팁 가위Roboz 수술 기구RS5611 
를 포함합니다. 스 스 언스 DAPI 를

참고문헌

  1. Shen, Q., S, G., et al. Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells. Science. 304, 1338-1340 (2004).
  2. Milner, R. A novel three-dimensional system to study interactions between endothelial cells and neural cells of the developing central nervous system. BMC Neurosci. 8, 3 (2007).
  3. Rauch, M. F., Michaud, M., Xu, H., Madri, J. A., Lavik, E. B. Co-culture of primary neural progenitor and endothelial cells in a macroporous gel promotes stable vascular networks in vivo. 19, 1469-1485 (2008).
  4. Vasudevan, A., Long, J. E., Crandall, J. E., Rubenstein, J. L., Bhide, P. G. Compartment-specific transcription factors orchestrate angiogenesis gradients in the embryonic brain. Nat. Neurosci. 11, 429-439 (2008).
  5. Vasudevan, A., Bhide, P. G. Angiogenesis in the embryonic CNS: a new twist on an old tale. Cell Adh. Migr. 2, 167-169 (2008).
  6. Won, C. K., et al. Autonomous vascular networks synchronize GABA neuron migration in the embryonic forebrain. Nat. Commun. 4, 2149-2162 (2013).
  7. Dong, Q. G., et al. A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17, 1599-1604 (1997).
  8. Erblich, B., Zhu, L., Etgen, A. M., Dobrenis, K., Pollard, J. W. Absence of colony stimulation factor-1 receptor results in loss of microglia, disrupted brain development and olfactory deficits. PLoS One. 6, (2011).
  9. Wichterle, H., Garcia-Verdugo, J. M., Herrera, D. G., Alvarez-Buylla, A. Young neurons from medial ganglionic eminence disperse in adult and embryonic brain. 2, 461-466 (1999).
  10. Snapyan, M., et al. Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling. J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).
  11. Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. Blood vessels form a migratory scaffold in the rostral migratory stream. J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).

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