이 비디오 10-12 일 이내에 배아 전뇌에서 내피 세포의 순수 문화의 준비를위한 간단하고 신뢰할 수있는 전략을 설명하고 뇌 혈관의 여러 측면에 초점을 맞춘 연구를 위해 도움이 될 것입니다.
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이 논문에서
요약
초록
배아 뇌 혈관 내피 세포는 혈관 및 신경 혈관 개발 및 상호 작용의 연구에 중요한 도구 역할을 할 수 있습니다. 배아 전뇌, pial 뇌실 주위 백질의 두 혈관 네트워크는 공간적 특징이며, 서로 다른 기원과 성장 패턴이 있습니다. pial과 뇌실 주위 혈관 네트워크에서 내피 세포는 고유의 유전자 발현 프로파일과 기능을 가지고 있습니다. 여기서 우리는 배아 전뇌 (telencephalon)의 뇌실 주위 혈관 네트워크 (PVECs)에서 내피 세포의 순수한 인구의 분리, 배양 및 검증을위한 단계별 프로토콜을 제시한다. 이 방법에서는, 배아 일 15 쥐에서 얻은 pial 막의없는 telencephalon는, 다진 콜라게나 / 디스 파제로 소화, 단일 세포 현탁액으로 기계적으로 분산. PVECs은 강한 자석을 사용하여 마이크로 비드에 접합 anti-CD-31/PECAM-1 항체와 긍정적 인 선택을 사용하여 세포 현탁액에서 정제된다분리 방법. 그들이 합류하고 추가 계대 배양 될 때까지 정제 된 세포는 내피 세포 배양 배지에서 콜라겐 1 코팅 된 배양 접시에서 배양한다. 위상차 광학 현미경과 형광 현미경에 의해 시각으로 PVECs,이 프로토콜 전시 조약돌 스핀들 모양의 표현형을 얻을. PVEC 문화의 순도는 내피 세포 마커로 설립되었습니다. 우리 손에,이 방법은 확실하고 일관되게 PVECs의 순수한 인구를 산출한다. 이 프로토콜은, 전뇌 혈관 신생에 기계적인 통찰력을 얻고 PVEC 상호 작용 및 신경 세포 유형과 상호 대화를 이해하고 치료 혈관 신생에 대한 엄청난 잠재력을 보유하기위한 연구를 도움이 될 것입니다.
서론
혈관, 신경 및 신경 세포의 이주는 중추 신경계 (CNS) 개발, 수리 및 재생에 중요한 이벤트입니다. 여러 우아한 연구는 내피 세포 용해 인자의 방출을 통해 직접 접촉에 의해 신경 세포의 증식과 그 반대를 자극하는 것으로 나타났습니다. 우리는 호기심이 신경 전구 세포 / 신경 줄기 세포가 배아의 뇌에서 분리하는 동안 이러한 연구 1-3의 대부분에서, 그들은 성인의 뇌, 다른 성인 조직 소스, 또는 내피 세포 라인에서 내피 세포와 공 배양 된 것으로 나타났습니다. 이 부분에서 배아 뇌에서 혈관 내피 세포의 순수한 인구를 분리하고 배양과 관련된 기술적 인 문제로 인해 수 있습니다. 그러나, 혈관, 신경 및 신경 세포의 이동은 정상 성인의 뇌에 비해 배아 뇌의보다 강력한 규모의 명령에서 발생하는 동시 이벤트입니다. embryoni의 뇌실 주위 혈관 네트워크C의 전뇌 (telencephalon)는 기저핵 primordium 내에 위치한 용기에서 유래 및 배아 일 11 (E11) 4,5에 의해 telencephalon을 등쪽에 복부에서 질서 그라데이션의 형태로 개발하고 있습니다. 뇌실 주위 혈관 네트워크의 혈관이 혈관 따위의 기원, 해부학 적 위치, 성장 패턴 및 개발 규제 4.5에 따라 pial 혈관에서 구별된다. 뇌실 주위 혈관의 그라....
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프로토콜
1. 시약 및 솔루션의 준비
- 35mm 문화 요리의 코팅 : 콜라겐 타입 1 용액은 20 mM의 아세트산 (~ 100 mg의 단백질 / 유리 병)의 수용액으로 공급된다. 무균 조직 배양 등급의 물을 사용하여 0.01 %의 작업 농도로 콜라겐 용액의 적절한 볼륨을 희석. 1 실온 (RT)에서 3 ~ 4 시간 동안 콜라겐 솔루션의 ML 37 ° C, 또는 밤새 2-8 ° C에서와 코트 요리 코팅 접시에서 여분의 용액을 제거하고 밤새 건조 할 수 있습니다. 미디어를 추가하기 전에 조직 문화 등급 물 또는 PBS와 함께 요리를 씻어. 코팅 요리는 한 달 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
- 완전한 둘 베코의 수정 이글 중간 (DMEM)을 준비합니다. (, 1 ml/100 ML 1X 농도) 10 % FBS와 항생제 항진균 솔루션 DMEM (500 ㎖) 보완. 전체 DMEM는 두 달 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
- 분취 DNA 분해 효소 I (0.001 ㎎ / ㎖)과의 DMEM (50 ㎖)을 준비하고, (D라고도MEM-DNA 분해 효소 I).
- 콜라게나 제와 디스 파제 (DMEM-collagenase/dispase라고 함) (1 ㎎ / ㎖)로 DMEM의 또 다른 분취 액 (10 ㎖)을 준비한다.
- EGF (....
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결과
하루 1-12 PVECs의 표현형 특성은 위상 대비 광학 현미경 (그림 2)으로 표시됩니다. 세포 분열 (그림 2A)의 1 일 쇼 형태 특성에 접시에 부착 된 세포. 5-8일 사이에 자갈 돌에서 PVECs의 전환은 내피 세포 (그림 2B 및 2C)의 생체 상태에 더 가깝다 전형적인 모양의 형태를 스핀들. 하루 12 PVEC 문화 전체 합류 (그림 2D)을 달성한다. PVECs 식민지 (그림 2E-G)를 확장하기 쉽게 계대 배양 할 수있다. 내피 세포 배양의 순도는 내피 세포 마커로 설립되었습니다 - Isolectin B4, CD-31/PECAM-1, 폰 빌레 브란트 인자 (vWF가) 및 VE-cadherin의와 하위 문화 (그림 2H-K) 후 백 %로 측정되었다.
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토론
PVEC의의는 더 생리학 관련 신경 혈관의 상호 작용에 초점을 맞추고 연구를위한 다른 조직 소스에서 성인 뇌의 내피 세포와 내피보다도 치료 가능성이있다. PVEC 준비, 그것은 죽은 세포가 CD31 마이크로 비드에 비특이적으로 결합 할 수 있기 때문에 좋은 가능성을 달성하기 위해 빠른 작업 박리 중요한 시작입니다. 단일 세포 현탁액은 종래 자기 라벨링 단계에 도달하지 않은 경우 세포 덩어리가 열을 막는 것이므로 또, 이것은, 문제가 발생할 것이다. 이 방법의 장점은 자성 비드의 세포를 분리하는 트립신으로 인큐베이션 대한 필요, EC 제제 4,7 다른 마그네틱 비드 기반의 분리 방법에 사용되는 시간과 종종 어려운 공정이 없다는 점이다. 또,이 분리 방법은 배아 뇌 조직의 대량을 필요로하지 않는다. PVEC의 일관 입히는 Appr있는 단일 정해진 임신 마우스를 이용하여 제조 할 수있다oximately 십이일, 계대 배양하고, 시험관의 다양한 생체 내 실험에 사용 하였다.
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 작품은 정신 분열증 연구에 대한 국가 연합과 우울증 (NARSAD) 젊은 연구자 상과 건강의 국립 연구소 AV에 R01NS073635을 부여에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| DNase I | 시그마 | D-4527 | |
| 콜라겐, 쥐 꼬리에서 추출한 타입 1 용액 | 시그마 | C3867 | |
| DPBS | 품질 생물학적 제제 | 114057-131 | |
| EDTA | 피셔 사이언티픽 | M4055 | |
| BSA | 시그마 | A2058 | |
| MS 칼럼 | Miltenyi Biotech | 130-042-201 | |
| CD31 마이크로비즈 | Miltenyi Biotech | 130-097-418 | |
| MACS 분리기 | Miltenyi Biotech | 130-042-102 | |
| MACS 멀티 스탠드 | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| 세포 여과기 70 µ m | BD 생명과학 | 352350 | |
| 항생제 및 항진균 용액 | Sigma | A5955 | |
| FBS | 시그마 | F4135 | |
| 콜라겐 분해 효소 / 디스 파제 | 로슈 | 10269638001 | |
| DMEM | 론자 | 12-604F | |
| 35mm 배양 접시 | BD Bioscience | 353001 | |
| 15 ml 팔콘 튜브 | BD 생명과학 | 352097 | |
| 50ml 팔콘 튜브 | BD Bioscience | 352098 | |
| ECCM 키트 | BD Bioscience | 355054 | 키트는 내피 세포 성장 보충제, EGF 및 대두 트립신 억제제 |
| 내피 세포 성장 보충제 (ECGS) | BD Bioscience | 354006 | |
| RBECGM | 셀 응용 | R819-500 | |
| DMEM F12 | 생명 기술 | 10565-018 | |
| 글루타맥스 | 라이프 테크놀로지 | 305050-061 | |
| 조직 배양 등급 물 | 생명 기술 | 15230162 | |
| 0.25% 트립신 | 라이프 테크놀로지 | 15050 | |
| 대두 트립신 억제제 | BD Bioscience | 5425 | |
| 마트리겔 | BD 바이오사이 | 354234 | |
| Qtracker 655 세포 라벨링 키트 | Life Technologies | Q25021 | |
| CellLight 플라즈마 멤브레인-RFP, BacMam 2.0 | Life Technologies | C10608 | |
| 비오틴화 이소렉틴 B4 항체 | 시그마 | L2140 | |
| 안티-폰 윌레브란트 팩터 | 시그마 | F3520 | |
| 안티-CD31/PECAM-1 | BD 파밍겐 | 550274 | |
| Vector Laboratories | 사용한 VECTASHIELD 하드셋 마운팅 미디어 | H-1500 | |
| 케타민 | 버틀러 Schein 동물 건강 공급 | 44028 | |
| 자일라진 | 로이드 연구소 | 1009 | |
| 실체현미경 | Motic | SMZ-168 | |
| 혈구계 | Fisher Scientific | 267110 | |
| 도립 현미경 | Olympus CK-40 | CK-40 | |
| 형광 현미경 | Olympus FSX-100 | FSX-100 | |
| 세밀한 펜치 | Roboz 수술 기구 | 7 inox | |
| 세밀한 마이크로팁 가위 | Roboz 수술 기구 | RS5611 |
참고문헌
- Shen, Q., S, G., et al. Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells. Science. 304, 1338-1340 (2004).
- Milner, R. A novel three-dimensional system to ....
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