형광<em&gt; 현장에서</em바이러스 및 식물과 곤충 조직에서 Endosymbiotic 박테리아의 지역화를위한&gt; 혼성화 (FISH)

요약

우리는 곤충과 식물 조직에서 바이러스와 박테리아의 현지화 여기 현장 하이브리드 화에 간단한 형광 (FISH) 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 전체 산에서의 mRNA의 시각화 및 미세한 부분에 대한 확장 할 수 있습니다.

초록

현장 하이브리드 화 (물고기)의 형광은 일반적으로 진핵 세포의 유전자 사본을 시각화하고 추가 바이러스 나 세균 감염과 같은 세포의 다른 구성 요소를 시각화하기 위해 수정 될 수 있습니다에 사용되는 다양한 기술에 주어진 이름입니다. 공간 현지화 및 감염 과정에서 바이러스와 박테리아의 시각화는 다른 자극에 대한 응답으로 이러한 마이크로 어레이 및 RNAseq로 표현 프로파일 링 실험을 보완하는 필수 단계입니다. 이러한 에이전트와 시공간 감염을 이해하는 세포 구성 요소와의 상호 작용을 이해하기위한 생물학적 실험을 보완합니다. 이러한 리포터 유전자 시스템이나 면역 조직 화학적 방법으로 바이러스와 박테리아를 시각화하는 몇 가지 기술은 시간이 많이 소요되어, 일부는 모델 생물로 작업하고 복잡한 방법을 포함하도록 제한됩니다. 세포 내에서 RNA 또는 DNA 종을 대상으로 FISH는 상대적으로 쉽고 빠른 날입니다유전자의 시공간 현지화을 연구 및 진단 목적으로 THOD. 이 방법은 강력하고 프로토콜이 비싸지 않다 짧은 혼성화, 시중에서 구입 한 프로브를 사용하면 비교적 쉽게 구현할 수 있습니다. 샘플 준비, 고정, 하이브리드, 현미경 시각화 복잡한 단계를 포함하지 않는 경우에 특히 강력합니다. 여기에서 우리는 곤충과 식물 조직에서 박테리아와 바이러스의 현지화를위한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 자신의 5 '또는 3'에 형광 염료에 접합 된 짧은 DNA 프로브가 종료 20 염기쌍 간단한 준비, 고정, 곤충 전체 마운트 및 해부 기관 또는 손으로 만든 플랜트 섹션의 하이브리드 화에 기반하고있다. 이 프로토콜은 성공적 곤충 및 식물 조직의 개수에인가되었으며, 셀에서의 mRNA 또는 기타 RNA 또는 DNA 종의 발현을 분석하기 위해 사용될 수있다.

서론

감염된 식물들은 호스트와 식물 바이러스 및 기타 병원체 간의 상호 작용을 연구 할 때, 그것은 그들이 호스트에 부정적인 영향을 야기하는지 여부를 불문하고, 동일 반응계에서 병원균 및 각각 핵산을 시각화하는 것이 중요하다. 식물 세포 내와 사이에 병원균의 움직임을 연구 할 때이 가장 중요하다. 병원체의 유전자 제품의 현장 현지화에서 병원성 과정을 연구하기위한 다른 방법을 보완하는 필수적인 단계이다. 많은 식물 병원체, 특히 바이러스는 자신의 벡터를 복잡하고 친밀한 상호 작용을 갖는 곤충에 의해 전달된다. 자신의 그림에있는이 바이러스의 현지화 전송 경로를 연구하는데 중요하고, 벡터 내부의 가능한 상호 작용 사이트. 일부 곤충 벡터가 식물 바이러스의 전송은 이들 곤충에 상주 endosymbiotic 박테리아에 의해 도움을 받는다. 더 나은 이러한 식물 바이러스 B의 전송을 연구하는자신의 벡터, 그것은 일반적으로 endosymbiotic 박테리아를 시각화, 특히 바이러스의 전송에 관련된 사람들, 또한 필수적입니다 Y. 바이러스와 endosymbiotic 박테리아의 colocalization을 따라서 자신의 곤충 호스트 이내에 생물 사이의 가능한 관계를 조사를 위해 요구된다. 이외에도 바이러스 전송에서, endosymbiotic 박테리아가 곤충 벡터의 생물학의 여러 ....

프로토콜

1. FISH 분석을위한 일반 가루이, 식물, 그리고 바이러스의 준비

1. 후면 B와 Q 생물 형면 모종 (고십 피움 히르 수툼 L. 이력서. 동명왕)에 가루이 및 25 ± 2 ° C, 상대 습도 60 %의 표준 조건 하에서 곤충 방지 케이지와 성장 객실 내부에 유지하고, 14 시간 조명 / 10 시간 어두운 광주.
2. 앞에서 설명한 ^15-19로 endosymbiont 특정 프라이머를 이용하여 endosymbionts 감염을 테스트하기 위해 PCR을 수행합니다.
3. 상업 보육 또는 식물 토마토 씨앗에서 토마토 모종 (까 esculentum 이력서. 비프 스테이크)를 구입.
4. 식물이 TYLCV ¹⁵ 가루이 매개 접종에 가장 적합한 연령 (섹션 아래 4.1 참조), 네 사실 잎의 단계에 도달 할 때까지 상기 한 바와 같은 사육 조건에서 유지한다.

2. 엔도 해충 처리, 고정, 프로브 디자인, 하이브리드 및 시각화공생 물고기

1. 면 공장에서 흡입 10 성인 가루이를 수집, 또는면 잎에서 10 제 ³ 또는 ^제 4 령 약충을 선택합니다. ....

결과

이 원고에서 공부 시스템은 그림 1과 TYLCV와 감염된 식물, 성인 및 가루이 B의 요정이 포함되어 있습니다 담배가 루이, 그리고 곤충에 TYLCV 전좌의 경로를 보여주는 가루이의 내부 해부학. 2 차 공생 Portiera와 보조 공생을위한 성인 가루이에 두 번 생선을 보여줍니다 Arsenophonus. 그림 3은 Portiera 및 Hamiltonella에 두 번 생선을 보여 주며, 그림 4는 Portiera 및 리케차, B의 두 인물에 두 번 생선을 보여줍니다 담배가 루이 ^제 4 령 요정. 5 가루이 해부 중장에서 TYLCV와 DAPI 염색을 위해 .......

토론

그 공장 주인과 곤충 벡터 식물 바이러스의 현지화 및 특정 가루이 호스트에 endosymbiotic 박테리아 여기에 설명 된 프로토콜은, 식물, 심지어는 동물 조직에서 다른 바이러스의 현지화에 적용 할 수 있습니다. 또한, 프로토콜은 endosymbiotic 병원성 박테리아와 식물과 동물의 시스템에서 다른 미생물을 지역화하는 데 사용할 수 있습니다. 기술 된 방법은 짧은, 형광 표지 된 올리고 뉴클레오티드 프로브와 DNA 셀 표적 DNA 또는 RNA 분자 간의 혼성화의 간단한 개념에 의존한다. 결과는 최소한의 배경을 가진 특정 하이브리드, 형광 또는 공 초점 현미경을 이용하여 검출 신호이다. 하나 이상의 유전자를 타겟팅 다른 형광 염료 여러 프로브가 동시에 사용될 수있다. 이는 단일 세포 또는 조직에서 하나 이상의 타겟을 시각화 가능하게한다. 이러한 프로토콜에 설명 된 절차는 간단하고 시료 처리 시간 아르최소이다. 이러한 높은 백그라운드 신호, 시험편 긴 처리 시간 및 분석을 위해 다수의 값 비싼 재료의 사용과 같은 다른 프로.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
형광 라벨링  프로브	: Metabion	20 bp HPLC 정제	서열 고객
Toluidine 블루	Sigma-Aldrich	89640
나트륨 도데 실 설페이	Sigma-Aldrich	L3771	분자 생물학 학년
포름 아미드	Sigma-Aldrich	F9037	분자 생물학 학년
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	T5941	분자 생물학 학년
빙하 아세트산	시그마 - 알드리치	320099	분자 생물학 학년
액체 차단제	Ted Pella Inc.	22309

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