방법 논문

정자의 세포 학적 분석 : 라이브와 고정 준비

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⸱

DOI:

10.3791/51058

⸱

2014년 1월 20일

 ,  , 
1Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University Medical Center

이 논문에서

요약

분리 및 위상 콘트라스트와 형광 현미경으로 이미징 초파리 고환 샘플 (생활하고 고정)을 제조하는 방법이 설명된다.

초록

초파리 melanogaster의 널리 생물학적 과정의 다양성을 설명하기 위해 사용 된 강력한 모델 시스템이다. 예를 들어, 여성과 초파리의 수컷 생식 라인 모두의 연구는 현재의 감수 분열에 대한 이해뿐만 아니라 줄기 세포 생물학에 크게 기여했다. 우수한 프로토콜은 초파리의 난소와 고환 3-12의 분리 및 이미징에 대한 문헌에서 사용할 수 있습니다. 여기서, 현미경 분석에 대한 해부와 초파리 고환의 제조 방법은 첨부 된 비디오 데모와 ​​함께 설명되어 있습니다. 성인 남성의 복부에서 고환을 분리하고 위상차 현미경에 의한 분석뿐만 아니라 형광 현미경에 의한 분석을 위해 고환을 고정하고 면역 염색을위한 프로토콜에 대한 살아있는 조직 슬라이드를 제조하는 프로토콜이 제공됩니다. 이러한 기술 개발을 나타내는 초파리 돌연변이의 특성에 적용 할 수있다정자뿐만 아니라 단백질의 세포 내 현지화의 시각화 EFECTS.

서론

초파리의 고환은 줄기 세포의 조절, 세포의 감수 분열, 그리고 정자 개발 13-18 등 많은 생물 학적 과정의 연구를위한 이상적인 모델 시스템이다. 정모 세포와 그들의 감수 스핀들 대형 및 세포 학적 분석에 따라서 편리하고 편안한 정자 동안에 세포주기 체크 포인트는 세포주기 유전자 변이의 연구를 용이하게한다. 상이한 세포 유형은 고환의 길이를 따라 정렬 된 진행성에서 관찰 될 수 있고, 정자 형성에 어떠한 중단이 전반적인 배열의 변화로 이어질 수있다. 초파리의 유전 도구와 결합 된 이러한 기능은 정자 21-23의 돌연변이 분석을 용이하게했다.

초파리의 정자의 단계가 잘 정의되어 있습니다. 낭종 내에 동기 개발 생식선 세포는 고환의 길이를 따라 정자의 단계를 통해 순차적으로 진행. 보 중유사 분열과 남성 생식 세포의 감수 분열 번째, 세포질 분열은 딸 세포 (그림 1) 링 운하로 알려진 세포질 다리로 연결되어있는 것을 불완전 같은 발생합니다. 고환의 꼭대기 끝은 차 정모 세포의 16 셀 낭종을 생성하는 불완전한 세포질 분열 네 개의 유사 분열 분열을 거쳐 정원 세포에 상승을 제공 생식 줄기 세포의 인구가 포함되어 있습니다. premeiotic S 단계 후, 차 정모 세포는 G2 ~ 90 시간하는 세포 부피가 증가 ~ 25 배 동안의 장기 성장 기간을 입력합니다. 감수 분열의 I 각각 차 정모 세포와 반수체 정자의 64 세포 낭종, 32 셀 낭종의 형성 세포의 감수 분열 II 결과를 통해 진행 상황. 미숙 한, 둥근 정자 성숙 정자를 형성하기 위해 광범위한 세포 리모델링을 받고있다. 사후 감수 세포는 연신의 번들 및 성숙 정자 특히, 고환의 볼륨을 중시 점유한다.

티여성 파리에 기능 정자의 그는 성공적으로 전송 여러 쌍 구조 (고환, 정낭 및 액세서리 땀샘)과 하나의 사정관으로 구성되어 남성의 생식 시스템 (그림 2)의 다른 부분 간의 조정이 필요합니다. 정자는 고환에서 생산 교미 24까지 정낭에 저장됩니다. 액세서리 샘은 정액을 생산하는 분비 세포가 포함되어 있습니다. 정낭에서 이주 정자가 정낭 및 액세서리 분비 모두 연결된 사정관, 내 정액과 혼합된다. 정자와 정액의이 혼합물은 궁극적으로 여성의 남성의 복부 (25)의 후방 단부에 위치 사정 전구를 통해 비행의 질에 남성의 펌핑된다. 정액 내 단백질은 담당자에 spermathecae로 알려진 전문 기관 내에서 정자의 장기간 보관에 필수적인초파리 암컷 26 roductive 기관.

초파리 고환의 분리 및 정자의 여러 단계에서 세포의 시각화를위한 훌륭한 방법은 과학 문헌 3-12에서 사용할 수 있습니다. 우리는 여기에 첨부 된 비디오 데모와 함께 이러한 프로토콜의 예를 제시하여 지식이 몸에 추가합니다. 위상차 현미경 라이브 고환 샘플의 준비를위한 프로토콜은 앞에서 설명한 방법 (27)에 기초한다. 포름 알데히드 고정 및 고환의 면역 염색을위한 프로토콜은 이전에 설명한 방법 28을 기반으로합니다. 본원에 기재된 방법 (예를 들어, 초파리 정자 동안, 마이너스 엔드 - 지향의 미세 소관 모터 dynein의 역할을 평가하기 위해) 초파리 정자의 많은 연구에 사용되었다.

기본 프로토콜 이외에, 제안은 varyin 제공된다G 해부 정조 세포, 정모 세포, 또는 성숙한 정자 풍부하게하기 위해. 이러한 낭종이 고환을 처리하기위한 다른 방법은 그대로 유지 또는 설명되어 필요에 따라 중단됩니다 하나. 모델 시스템으로 초파리 고환 사용에 장점은 초파리 난자 및 배아에 비해 항체 및 염료 쉽게 고환에서 그들의 분산 다음 세포에 침투 할 수 있으며, 적은 세척 단계가 요구되는 점이다, 따라서, 프로토콜은 상대적으로 수행 될 수있다 짧은 시간.

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프로토콜

1. 고환의 해부

  1. CO 2의 스트림을 사용하여 병 또는 유리 병에 파리를 마취 및 비행 패드에 전송합니다.
  2. 정렬 작은 붓을 사용하여 해부 현미경으로 파리, 원하는 유전자형의 초파리 수컷의 (실험)에 따라 해당 번호를 수집합니다. (2-5 일) 이전 약간 나이가 남성은 세포 검사에 이상적입니다 반면 (0-2일 세) 젊은 남성은 정자의 초기 단계 (예를 들어 정조 세포, 정모 세포, 초기 포스트 감수 정자)를 통해 세포를 검사에 이상적입니다 정자의 마지막 단계에서 (특히, 정자를 성숙).
  3. (해부하는 동안 액체에 떠에서 파리를 방지하기 위해) 각 비행에서 날개를 제거하는 집게를 사용합니다.
  4. 에 실리콘 코팅 해부 접시에 드롭, 인산염 완충 생리 식염수 (PBS 130 mM의 NaCl을, 7 개 mm 나 2 HPO 4, 3 밀리미터의 NaH 2 PO 4)의 ~ 500 ML을 추가합니다검은 배경. 다른 수용액을 성공적으로 고환 절제술 3에 사용되었다.
  5. 포인트는 파리의 전방을 향해 핀셋, 가슴으로 이해하고, PBS의 드롭에 젖어. 해부 현미경을 통해 볼 수 있지만, 복부에서 분리 될 때까지 후방 외부 생식기 (복부 복부의 뒤쪽 끝 부분에 진한 갈색 구조)를 잡아 당겨 포셉의 다른 쌍을 사용합니다. 대부분의 경우, 고환, 정낭, 및 부속 선은 외부 성기와 복부에 따라 제거 할 것,하지 않을 경우, 복부에 포셉 한 쌍을 삽입하고 고환을 애타게.
  6. PBS의 드롭 집게 이쌍 (그림 2)를 사용하여 부속 선 및 외부 생식기에서 별도의 고환. 야생 형 고환은 쉽게 노란색으로 이웃 흰색 조직과 구별된다. 2 단계로 바로 진행합니다.
  7. pharate의 남성 (전에서 고환을 분리하려면.. 전자 번데기 케이스 내에 포함), 추가 단계는 먼저 번데기 케이스에서 비행을 제거 포함하는 수행해야합니다,이 단계는 이전에 다른 31에 설명되어 있습니다. 단계 1.2에서 시작하는 성인의 고환을 위해 같은 해부를 진행합니다.
  8. 애벌레 남성에서 고환을 분리, 초파리 애벌레 난소 32을 분리하는 프로토콜의 변형을 수행합니다. 간략하게, 수컷 유충 지방 본체의 후방 제에 포함 된 대형, 분명, 타원형 구조 (유생 정소) 쌍의 존재에 의해 암컷 유충으로부터 구별 될 수있다. 유생 고환을 분리 부분적 유생 난소의 분리 기술 한 바와 같이 복부에서 고환 및 주변 체지방을 분리 수컷 유충을 열 채찍. 본원에 기술 된 프로토콜의 2 단계로 바로 진행; 정소하기 직전 난소 (32)에서 기술 한 바와 같이 (2.3 또는 3.14 단)에 장착 지방 본체로부터 제거 될 수있다.

2. 샘플 준비 및 라이브 영상

  1. 부드럽게 사각 유리 커버 슬립에 PBS의 4-5 ML의 드롭 고환 2 ~ 3 쌍을 배치 포셉 한 쌍을 사용합니다. 너무 작은 액체 때 숙청 세포는 파열의 원인이됩니다 반면, 너무 많은 액체를 숙청 할 때 제대로 확산 세포를 방지 할 수 있습니다 : PBS의 볼륨에 고환의 수의 비율을 조정해야 할 수도 있습니다. 선택 사항 : 사용 실리콘 처리 된 커버 단계 3.2 슬립을 충당하기 위해 조직의 부착을 최소화하기 위해 전표.
  2. (참고 준비에 필요한 생식 세포 유형의 존재를 극대화 할 수 있도록 적절한 위치에 열려있는 각각의 고환을 찢어 포셉 한 켤레를 사용하는 부수 동안 슬라이드에 고환 찢어진 지역에서 의지 주로 출구의 내용 단계를 포함한다.) 정조 세포와 정모 세포에 풍부하게, 그 정점 팁 (레벨 1, 그림 2B)에 인접한 고환을 열고 눈물. 정모 세포와 정자 세포에 풍부하게, 눈물은 pos의 고환을 열레벨 1 (레벨 2, 그림 2B)에 약간 기초 ition. , 더 성숙한 생식 세포에 풍부 가까이 곡률 (레벨 3, 그림 2B)를 시작하는 위치에 개방 고환을 찢어.
  3. 부드럽게 고환 스쿼시 커버 슬립 위에 유리 현미경 슬라이드를 배치, 혼자 커버 슬립의 무게가 제대로 숙청 샘플을 얻기에 충분하다로 수동으로 압력을 적용하지 않는다. 공기 방울이 않도록하십시오. 선택 사항 : 사용 폴리-L-라이신 코팅 현미경 단계 3.2에서 슬라이드에 조직의 준수를 촉진하기 위해 슬라이드.
  4. 위상차 현미경으로 살아있는 세포를 관찰하기 (이상적으로 준비 15 분 이내) 즉시 준비를 사용하여, 고환에서 찬란 태그 단백질의 발현과 유전자 변형 파리에, 살아있는 세포는이 단계에서 형광 현미경으로 검사 할 수 있습니다. 또한, 고정 및 항체 염색 (프로토콜 3)를 진행합니다.
  5. 부드럽게 청소 W를 사용하여 커버 슬립 아래에서 초과 액체를 심지생식 세포에 초점이 명확하게 될 때까지 IPE는 자료의 평탄화를 허용합니다.

3. 포름 알데히드 고정 및 항체 염색법

  1. 스냅 (액체 질소 버블 링을 멈출 때까지) 액체 질소에 짧게 젖어 금속 집게의 쌍을 사용 (프로토콜 2) 숙청 고환이있는 각 슬라이드를 동결.
  2. 면도날을 사용하여 즉시 커버 슬립을 제거합니다.
  3. 얼음처럼 차가운 95 % 에탄올로 가득 prechilled 유리 슬라이드 랙 (분광 등급, 메탄올 - 무료)에 슬라이드를 전송하는 금속 집게를 사용합니다. 10 분 -20 ° C에 보관하십시오.
  4. 4 % PBS에 포름 알데히드 플러스 0.1 % 트리톤 X-100 (PBS-T)로 채워진 유리 슬라이드 랙에 슬라이드를 전송하는 금속 집게를 사용합니다. 7 분 동안 실온에서 보관하십시오.
  5. PBS로 가득 유리 슬라이드 랙에 슬라이드를 전송하는 금속 집게를 사용합니다. 실온에서 5 분 동안 PBS에서 슬라이드를 씻으십시오. 1X를 반복합니다. (유리 슬라이드 랙에 솔루션을 삭제하여 모든 세척을 수행 예. 그것을 밖으로 쏟아져)와 신선한 솔루션으로 대체하여.
  6. PBS를 폐기하고 세포막을 투과하는, 실온에서 30 분 동안 PBS-T에서 슬라이드 젖어.
  7. 실온에서 5 분 동안 PBS에서 슬라이드를 씻으십시오. 배를 반복합니다.
  8. 단계 (옵션) 차단 : 실온에서 45 분 동안 PBS에서 슬라이드 플러스 1 % BSA를 담근다.
  9. (단계 3.9 및 3.11에 추가) 항체 솔루션을 제한하기 위해 (눈으로 쉽게 볼) 숙청 조직 주변의 슬라이드에 원을 그리려면 소수성 장벽 펜을 사용합니다. 면역 염색을 수행하는 동안 조직을 항상 습한 유지되어야한다.
  10. 원 내에서 조직에 (항체에 따라 1:50 PBS-T, 1:400으로 희석) 일차 항체의 30 ~ 40 ML을 추가합니다. 블로킹이 수행 된 경우, PBS-T 플러스 1 % BSA에 일차 항체를 희석. (그림 4의 중심체의 염색에 대한) 안티-γ-tubulin에 항체는 1:100 희석시켰다. 습기, 어두운 챔버 (예. 폐 플라스틱 상자에 품다젖은 종이 실온에서 2 시간 동안 수건) 또는 4 박 ° C에서와
  11. 실내 온도 3 배에서 5 분 동안 PBS에서 슬라이드를 씻으십시오. 차단을 수행 한 경우, PBS-T에 두 번 세척 한 번 PBS에서 (실내 온도 각에서 5 분).
  12. 조직에 형광 - 복합 이차 항체 (PBS에서 1:400 희석)의 30 ~ 40 mL를 넣고 실온에서 1 ~ 2 시간 동안 어둠 속에서 부화.
  13. 실온에서 5 분 동안 PBS에서 슬라이드를 씻으십시오. 배를 반복합니다.
  14. 30 ~ 40 원 내에서 조직에 DAPI 용액 (PBS 0.2 ㎎ / ㎖)의 ML을 추가합니다.
  15. 부드럽게 공기 방울이 않도록주의하면서, 조직 위에 유리 커버 슬립을 배치합니다. 기포가 발생한 경우, 거품이 커버 슬립의 측면에서 탈출 할 때까지 스쿼시를 파괴하지 않고 커버 슬립 주위를 조심스럽게 이동합니다.
  16. 청소를 사용하여 슬라이드의 가장자리에서 초과 DAPI를 지워 버리 닦아냅니다.
  17. 명확한 매니큐어를 사용하여 슬라이드에 커버 슬립을 봉인.
  18. 이 혼합물을 사용하여형광 현미경으로 세포 면역 염색을 볼 수있는 다음 3 ~ 4 시간 이내. (적어도 몇 주까지) 슬라이드의 장기 저장을 위해, -20 ˚ C에서 글리세롤 기반 하드 마운트 DAPI와 매체 및 저장 슬라이드를 사용
  19. 또한, (항원)에 따라 메탄올 대신 포름 알데히드에 샘플을 고정합니다. 단계 3.2을 통해 전체 프로토콜을 완료 한 후, -20 ° C에서 10 분 동안 메탄올 숙청 고환의 슬라이드를 담가 이후 단계 5를 진행합니다.

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결과

초파리의 남성 생식 기관의 제대로 해부 쌍의 예를 그림 2A에 표시됩니다. 성인 남성 파리의 복부에서 제거 고환은 일반적으로 정낭의 쌍 (파란색, 그림 2A ')를 통해 절규하는듯한 덕트 (브라운, 그림 2A') 및 액세서리 땀샘의 한 쌍 (녹색, 그림 2A ')에 연결되어 . 첨부 된 체세포 조직, 절규하는듯한 덕트 및 부속 샘의 대부분에서 고환을 분리하려면 분리 및 고환 쌍과 정낭 만이 ( '도 2b 및 2B)을 유지하도록 폐기해야합니다. 정낭 또한 더욱 처리 될 만 고환 쌍을 남겨 제거 될 수있다.

고환 절제술 선택 성인 남성의 나이는 중요한 고려 사항이다. (0~2일 우화 후) 젊은 남성에서, 정낭 작은거의 빈, 고환 (그림 2에서...

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토론

야생형 파리의 고환은 쉽게 인해 노란색 (대조적으로 이웃 흰색 조직)을 식별 할 수 있지만, 흰색 돌연변이 체의 고환은 흰색이며, 따라서 가끔 용기와 혼동 할 수 있습니다. P 요소에있는 미니 흰색 유전자가 고환에있는 색소의 축적을 촉진하지 않기 때문에 흰색 배경에 전형적으로 대부분의 형질 전환 균주는 또한 흰색 고환이 있습니다. 초파리의 고환은 색깔로 구분 할 수없는 경우, 다른 쉽게 인식 기능은 쌍 (12)에서의 나선형 패턴과 발생 (가) 있습니다. 일부 근로자가 쉽게 고환 (12)을 분리하는 절개 바늘 대신 집게를 사용하여 찾을 수 있습니다.

이 프로토콜의 중요한 단계는 숙청 고환의 준비입니다. 한 가지 유용한 방법은 몇 밀리되도록 고환을 함유 커버 슬립 위에 슬라이드를 올려하는 표면 TE커버 슬립에 PBS의 nsion 슬라이드 향해 조직을 함유하는 커...

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공개 사항

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

감사의 글

저자는 이명박 실험실에서 카렌 헤일 즈에서 전문가의 조언과 정자를 연구하는이 허용 방법을 설정하기위한 마이클 앤더슨에게 감사의 말씀을 전합니다. H.오다와 Y 아키야마 -오다 아낌없이 γ-튜 불린-GFP 재고 비행 제공. 이 작품은 LAL (GM074044)에 NIH R01 교부금에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
SylgardWorld Precision InstrumentsSYLG184Kimax 페트리 접시 PAP 펜에서 실리콘 코팅 해부 접시를 만들기 위한 2액형 실리콘 엘라스토머
Fisher ScientificNC9888126Ted Pella #22309
투명 손톱 보호대Wet n Wild7780235001
ProLong Gold Antifade Reagent with DAPILife TechnologiesP36931
마우스 안티-감마-튜불린 항체 (클론 GTU-88)Sigma-AldrichT6557
Cy3-AffiniPure Goat 안티-마우스 IgG Jackson ImmunoResearch115-165-003
Triton X-100Fisher ScientificBP151-100
에탄올Fisher ScientificAC61511-0040
메탄올Fisher ScientificA412-4
16% 포름알데히드Thermo Fisher Scientific28908
시그마코트시그마-알드리치SL2제조업체의 지시에 따라 커버 슬립을 실리콘화하십시오.
DAPISigma-AldrichD-95420.5 mg/ml in 75% ethanol; -20 ° C
NaCl연구 제품 국제 공사S23020
Na2HPO4Sigma-AldrichS9763
NaH2PO4Sigma-AldrichS0751
Kimwipes 섬세한 작업 와이퍼Fisher ScientificS47299
BSAResearch Products International Corp.A30075분자 생물학 등급
유리 코플린 염색 항아리, 나사 캡전자 현미경 과학70315
단일 젖빛 현미경 슬라이드Corning2948-75X25
폴리 L- 라이신 코팅 현미경 슬라이드Polysciences, Inc.22247-1옵션(처리되지 않은 현미경 슬라이드 교체용)
사각형 커버 유리Corning2865-22
면도날Fisher Scientific12-640
Kimax 페트리 접시Fisher ScientificS31473Kimble #23060 10015 EMD
집게Dumont52100-51S패턴 5 INOX
Stemi 2000-CS 스테레오스코프Carl Zeiss
Eclipse 80iNikon
Plan-Fluor 40X 대물렌즈 Nikon
AxiophotCarl Zeiss
Plan-Neofluar Ph2 40X 대물Carl Zeiss
렌즈

참고문헌

  1. McKim, K. S., Joyce, E. F., Jang, J. K. Cytological analysis of meiosis in fixed Drosophila ovaries. Methods Mol. Biol. 558, 197-216 (2009).
  2. Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. J. Vis. Exp. , (2012).
  3. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Drosophila Protocols. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 87-109 (2000).
  4. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Immunostaining of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, 1273-1275 (2011).
  5. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Methanol-acetone fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, 1270-1272 (2011).
  6. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Preparation of live testis squashes in Drosophila. Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, (2011).
  7. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Formaldehyde fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, (2012).
  8. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 102-104 (2012).
  9. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. F-actin staining of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 105-106 (2012).
  10. Kibanov, M. V., Kotov, A. A., Olenina, L. V. Multicolor fluorescence imaging of whole-mount Drosophila testes for studying spermatogenesis. Anal. Biochem. 436, 55-64 (2013).
  11. Singh, S. R., Hou, S. X. Immunohistological techniques for studying the Drosophila male germline stem cell. Methods Mol. Biol. 450, 45-59 (2008).
  12. Zamore, P. D., Ma, S. Isolation of Drosophila melanogaster Testes. J. Vis. Exp. (2641), (2011).
  13. de Cuevas, M., Matunis, E. L. The stem cell niche: lessons from the Drosophila testis. Development. 138, 2861-2869 (2011).
  14. Fabian, L., Brill, J. A. Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages. Spermatogenesis. 2, 197-212 (2012).
  15. Giansanti, M. G., Sechi, S., Frappaolo, A., Belloni, G., Piergentili, R. Cytokinesis in Drosophila male meiosis. Spermatogenesis. 2, 185-196 (2012).
  16. Matunis, E. L., Stine, R. R., de Cuevas, M. Recent advances in Drosophila male germline stem cell biology. Spermatogenesis. 2, 137-144 (2012).
  17. McKee, B. D., Yan, R., Tsai, J. H. Meiosis in male Drosophila. Spermatogenesis. 2, 167-184 (2012).
  18. Zoller, R., Schulz, C. The Drosophila cyst stem cell lineage: Partners behind the scenes. Spermatogenesis. 2, 145-157 (2012).
  19. Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis. J. Cell Sci.. 107, 3521-3534 (1994).
  20. Rebollo, E., Gonzalez, C. Visualizing the spindle checkpoint in Drosophila spermatocytes. EMBO Rep. 1, 65-70 (2000).
  21. Castrillon, D. H., et al. Toward a molecular genetic analysis of spermatogenesis in Drosophila melanogaster: characterization of male-sterile mutants generated by single P element mutagenesis. Genetics. 135, 489-505 (1993).
  22. Giansanti, M. G., et al. Genetic dissection of meiotic cytokinesis in Drosophila males. Mol. Biol. Cell. 15, 2509-2522 (2004).
  23. Wakimoto, B. T., Lindsley, D. L., Herrera, C. Toward a comprehensive genetic analysis of male fertility in Drosophila melanogaster. Genetics. 167, 207-216 (2004).
  24. Fuller, M. T. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez-Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-147 (1993).
  25. Wolfner, M. F. Tokens of love: functions and regulation of Drosophila male accessory gland products. Insect Biochem. Mol. Biol. 27, 179-192 (1997).
  26. Tram, U., Wolfner, M. F. Male seminal fluid proteins are essential for sperm storage in Drosophila melanogaster. Genetics. 153, 837-844 (1999).
  27. Kemphues, K. J., Raff, E. C., Raff, R. A., Kaufman, T. C. Mutation in a testis-specific beta-tubulin in Drosophila: analysis of its effects on meiosis and map location of the gene. Cell. 21, 445-451 (1980).
  28. Gunsalus, K. C., et al. Mutations in twinstar, a Drosophila gene encoding a cofilin/ADF homologue, result in defects in centrosome migration and cytokinesis. J. Cell Biol. 131, 1243-1259 (1995).
  29. Anderson, M. A., et al. Asunder is a critical regulator of dynein-dynactin localization during Drosophila spermatogenesis. Mol. Biol. Cell. 20, 2709-2721 (2009).
  30. Sitaram, P., Anderson, M. A., Jodoin, J. N., Lee, E., Lee, L. A. Regulation of dynein localization and centrosome positioning by Lis-1 and asunder during Drosophila spermatogenesis. Development. 139, 2945-2954 (2012).
  31. Martins, A. R., Machado, P., Callaini, G., Bettencourt-Dias, M. Microscopy methods for the study of centriole biogenesis and function in Drosophila. Methods in cell biology. 97, 223-242 (2010).
  32. Maimon, I., Gilboa, L. Dissection and staining of Drosophila larval ovaries. J. Vis. Exp. (10), (2011).
  33. Gonzalez, C., Casal, J., Ripoll, P. Relationship between chromosome content and nuclear diameter in early spermatids of Drosophila melanogaster. Genet. Res. 54, 205-212 (1989).
  34. Liebrich, W. The effects of cytochalasin B and colchicine on the morphogenesis of mitochondria in Drosophila hydei during meiosis and early spermiogenesis. An in vitro study. Cell Tissue. Res. 224, 161-168 (1982).
  35. Wong, R., et al. PIP2 hydrolysis and calcium release are required for cytokinesis in Drosophila spermatocytes. Curr. Biol. 15, 1401-1406 (2005).
  36. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  37. White-Cooper, H. Tissue cell type and stage-specific ectopic gene expression and RNAi induction in the Drosophila testis. Spermatogenesis. 2, 11-22 (2012).
  38. Rebollo, E., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. Contribution of noncentrosomal microtubules to spindle assembly in Drosophila spermatocytes. PLoS Biol. 2, (2004).
  39. Cheng, J., Hunt, A. J. Time-lapse live imaging of stem cells in Drosophila testis. Curr. Protoc. Stem Cell. Biol.. 2, 10-1002 (2009).
  40. Sheng, X. R., Matunis, E. Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output. Development. 138, 3367-3376 (2011).
  41. Belloni, G., et al. Mutations in Cog7 affect Golgi structure, meiotic cytokinesis and sperm development during Drosophila spermatogenesis. J. Cell Sci. 125, 5441-5452 (2012).
  42. Moon, S., Cho, B., Min, S. H., Lee, D., Chung, Y. D. The THO complex is required for nucleolar integrity in Drosophila spermatocytes. Development. 138, 3835-3845 (2011).
  43. Wang, Z., Mann, R. S. Requirement for two nearly identical TGIF-related homeobox genes in Drosophila spermatogenesis. Development. 130, 2853-2865 (2003).

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