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방법 논문

시간 코스 인도시 아닌 형광 안저 혈관 조영술로 연령 관련 황반 변성의 마우스 모델에서 맥락막 혈관의 이상을 검출

13K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/51061

⸱

2014년 2월 19일

 ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology & Visual Sciences, University of Utah Health Sciences Center, 2Department of Neurobiology & Anatomy, University of Utah Health Sciences Center

이 논문에서

요약

꼬리 정맥 주입에 의해 수행 인도시 아닌 형광 안저 혈관 조영술 (ICGA 나)는 마우스 맥락막 이상을 특성화하기 위해 고품질의 ICGA 시간 코스의 이미지를 제공합니다.

초록

인도시 아닌 그린 혈관 조영술 (또는 ICGA)는 맥락막 및 연령 관련 황반 변성 (AMD)과 같은 각종 눈 질환의 망막 혈관의 이상을 진단하는 안과 의사에 의해 수행되는 기술이다. ICGA는 그것의 적외선 스펙트럼과 색소 층을 관통하는 자사의 능력에 눈의 뒤쪽 맥락막 혈관 이미지에 특히 유용합니다. ICGA 시간 과정은 초, 중, 후반 단계로 나눌 수 있습니다. 3 단계 눈 문제의 병리에 대한 유용한 정보를 제공합니다. 정맥 주사에​​ 의한 시간 코스 ICGA가 (IV) 주사가 널리 맥락막 문제의 진단과 관리를 위해 병원에서 사용되지만, ICGA은 복강 내 주사 (IP)에 의해 일반적으로 동물 연구에 사용됩니다. 여기에서 우리는 꼬리 정맥 주입 및 공 초점 주사 레이저 검안경에 의해 생쥐의 고해상도 ICGA 시간 코스의 이미지를 얻기 위해 기술을 보여 주었다. 우리는 맥락막 르 이미지에이 기술을 사용연령 관련 황반 변성의 마우스 모델에서 sions. 이 IP로 마우스 혈관에 ICG을 소개하는 것이 훨씬 쉽지만, 우리의 데이터는 IP-ICGA에 의해 재현 ICGA 시간 코스의 이미지를 얻기 어렵다는 것을 나타냅니다. 대조적으로, 꼬리 정맥 주사를 통해 ICGA 인간 연구에 비해 높은 품질의 ICGA 시간 코스의 이미지를 제공합니다. 또한, 우리는 ICGA가 착색 된 생쥐에서 수행보다 맥락막 혈관의 선명한 사진을 제공 흰둥이 생쥐에서 수행 것을 보여 주었다. 우리는 그 시간 코스 IV-ICGA 동물 모델을 기반으로 AMD의 연구의 표준 관행이 있어야 좋습니다.

서론

인도시 아닌 형광 안저 혈관 조영술 (ICGA)는 눈에 혈관과 관련된 이미지의 문제에 대한 진단 테스트입니다. 발광 스펙트럼은 770-880 nm 내지 835 nm의 1의 발광 피크와 범위 동안 ICG의 흡수 스펙트럼은 790-805 nm의 범위. 이것은 누구의 스펙트럼 가시 범위 내에 다른 인기있는 염료, 나트륨 형광 다릅니다. 적외선 스펙트럼은 쉽게 나트륨 형광 기반의 형광 혈관 조영술 (FA)로 시각화를 차단할 수있는 모두의 망막 색소 상피 세포 (RPE), serosanguineous 유체 및 지질 분비물을 통해 침투하는 ICG 수 있습니다. ICG는 맥락막 혈관과 맥락막 병변 1,2의 향상된 영상을 허용, 98 %의 단백질 바인딩 작은 혈관 외 유출의 결과로 혈관에 있습니다. ICGA 거의 RPE에 후방입니다 맥락막 혈관을 시각화 할 수있는 유일한 선택입니다. 1도 마우스의 눈에 영상 혈관의 ICGA와 FA의 비교를 보여줍니다. FA는 B 수이미지에 망막 혈관을 잘하지만 맥락막 혈관을 사용하는 전자. 대조적으로, ICGA 망막과 맥락막 혈관 양쪽 화상에 사용될 수있다. ICGA 함께 우리는이 연구에서 사용하는 적외선에 민감한 비디오 카메라와 고해상도 디지털 영상 시스템 또는 스캐닝 레이저 검안경 (SLO)으로 수행된다.

병원에서 ICGA는 결절 맥락막 혈관 병증 (PCV), 망막 Angiomatous 확산 (RAP), angioid 줄무늬, vitelliform 황반 영양 장애, 중심 장액 맥락 망막 병증, 맥락막 혈관종, 출혈, 망막 등의 맥락막 혈관을 포함하는 맥락 망막 질환의 수를 진단하는 권장 된 세동맥 macroaneurysms, 맥락막 종양, 후방의 특정 형태는 1,3 포도막염. FA 및 빛 간섭 단층 촬영 (10 월)와 ICGA의 조합은 삼출성 연령 관련 황반의 진단 및 관리에 임상의를위한 강력한 도구를 제공합니다변성 (AMD) 4-10. ICGA은 맥락막과 관련된 조건을 진단하는 데 특히 유용합니다. 사실, ICGA는 PCV, 삼출성 AMD 11 ~ 13의 변형을 진단하기위한 황금 표준으로 간주됩니다. PCV는 맥락막 혈관 11-13 터미널 결절의 확장이 혈관 분기의 네트워크를 특징으로한다. PCV 자주 누설 결절 구성 요소 11,14,15에서 출혈과 망막 색소 상피와 망막의 재발 serosanguineous 박리와 연결되어 있습니다. 우리는 최근 transgenically 마우스의 망막 색소 상피 (RPE) (16)에서, 사람의 HTRA1, 다기능 세린 프로테아제를 발현하여 제 PCV 동물 모델의 생성을보고 하였다. 우리는 증가 HTRA1가 PCV의 특징적인 기능, 예를 들어, 결절 병변을 유도 것으로 나타났다.

여기에서 우리는 우리의 HTRA1 마우스 모델을 사용하여 AMD의 연구에 꼬리 정맥 주사 시간 코스 ICGA의 사용을 보여 주었다. 우리의 데이터가 제안하는IV-ICGA는 IP (또는 피하 (SC)) 현재 맥락막 병변의 특성에 대한 필드 (17, 18)에 사용되는-ICGA에 우수합니다.

동물 연구에 문

동물 실험 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 프로토콜에 따라 수행되었으며, 안과 및 비전 연구에서 동물의 사용에 대한 ARVO 정책에 따라 수행되었다.

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프로토콜

1. 악기의 제조

  1. 절차는 동물 시설에서 절차 룸에서 수행된다.
  2. 실험을 시작하기 전에 안면 마스크, 헤어 보닛, 수술 가운, 멸균 발 덮개, 장갑을 착용 할 것.
  3. 열판에서 비커에 ~ 40 ° C의 열 물.
  4. 촬영하는 동안 마우스의 체온을 유지하기 위해 나중에 사용되는 가열 패드 위에 멸균 블루 패드를 놓습니다. 가열 패드의 전원을 켭니다.
  5. 이미징 시스템 준비
    1. 먼지 덮개를 제거하고 레이저의 전원을 켭니다.
    2. 55 ° 렌즈를 꺼내 기계에 마운트.
    3. 컴퓨터 입력 새로운 환자의 시트에서 이미징을위한 마우스의 정보 (예를 들어, 유전자형, 연령, 등.)에서 이미징 소프트웨어를 엽니 다. "디바이스 유형"에서 적외선 (IR​​) 모드를 선택합니다.

주 :보고 된 것을 사용 O우리는 (대표적인 결과를 참조 1-4 피규어) 외부 렌즈를 사용하지 않고, IV-ICGA하여 고품질의 화상을 획득하는데 아무런 문제가 없지만 F 외부 이중 비구면 렌즈는 화질 17-20을 향상시킬 수있다.

2. ICGA의 꼬리 정맥 주입

  1. 1 % Tropicamide 안과 솔루션을 마우스 눈을 넓히고 5 분을 기다립니다.
  2. 필요한 마취 (케타민 / 자일 라진 / 아세 프로 마진 65-100/10-20/1-3 ㎎ / kg)의 양을 결정하기 위하여 마우스를 체중.
  3. 32 G 바늘과 함께 멸균 된 1 ML의 주사기를 검색합니다. 마취제 (13 ㎎ / ㎖ 케타민, 2.6 ㎎ / ㎖ 자일 라진, 멸균 PBS에 0.​​3 ㎎ / ㎖ 아세 프로 마진)과 복강 마우스를 주입한다. 마우스가 완전히 마취 될 때까지 기다립니다 (~ 5 분).
  4. 정맥의 혈관 확장을 일으키는 원인이되기 위하여 40 ° C의 따뜻한 물에 마우스 꼬리를 놓습니다.
  5. 32 G 바늘로 1 ML의 주사기를 검색합니다. IC의 원하는 금액을 인출G, 전형적으로 25g의 마우스 (2 ㎎ / kg)을 위해, 멸균 튜브에 0.2 μM 주사기 필터로 여과 멸균 1 ㎎ / ㎖ ICG, 50 μL. 주사기에있는 공기를 도입하지 않도록주의하십시오.
  6. 주입 할 영역을 소독하기 위해 알코올 면봉으로 꼬리를 닦아냅니다.
  7. 측면 꼬리 정맥이 상승되도록 한 손으로 꼬리를 잡고. 향하고 바늘의 베벨, 최소 각도로 정맥 ~ 2mm를 바늘을 주입. 정맥을 관통하지 않도록주의하십시오. 약간 주사기에 다시 그려 바늘이 성공적으로 정맥에 삽입 된 것을 나타내는 바늘 허브로 혈액의 흐름의 흔적을 찾습니다.
  8. 천천히 정맥에 ICG를 주입. 주입 할 때 최소한의 저항이 있어야합니다. 바늘을 제거하고 출혈을 멈추게하기 위해 ~ ~ 10 초 동안 주사 부위에 직접 알코올 면봉을 적용합니다. 마우스가 촬영을위한 다음 준비가되어 있습니다. 초기 단계 (주입 후 0-4 분)을 잡기 위해서는, ESSE이며신속하게 이미지에 마우스를 ntial.

참고 : 마우스의 눈은 쉽게 건조 얻을 수 있으며 마취 백내장을 개발할 수 있습니다. 이 절차를 수행하는 동안 멸균 PBS를 적용하여 촉촉한 눈을 유지하는 것이 중요합니다. ICGA 녹화 전에 멸균 면봉으로 초과 PBS를 닦아냅니다. 다른 실험실 각막 17-20의 탈수를 방지하기 위해 콘택트 렌즈를 사용했다.

3. ICG 혈관 조영술

  1. 망막 및 맥락막 순환이 최대 밝기 (0-4 분)에 될 때까지 이미지보기 맥락막 작성의 초기 단계의 캡처를 허용 ICG 주입 후 30 ~ 40 초를 가지고 시작합니다. 망막 혈관은 최적의 초점 ~ 35 ~ 45 디옵터 및 맥락막 혈관이 10 ~ 15 디옵터에서 시각화에서 시각화됩니다.

    주 : 동물 모델의 첫 번째 시험 동안, 모든 가능한 abno를 식별하기 위해 모든 각도 (코, 시간, 지느러미와 복부)에서 이미지를 캡처하는 것이 좋습니다혈관에 rmalities. 초기 단계 동안, 중형 및 대형 맥락막 동맥과 정맥 모두 잘 시각화된다. 이 프로토콜에 사용되는 동물 모델에서, 맥락막 병변 (예 : 결절 황반부)의 초기 단계에 1 분을 표시 시작할 수 있습니다.
  2. 혈관에 이미지 초점을 설정합니다. 밝기 제어 및 각각 제어 모듈과 초점 노브를 사용하여 초점을 맞 춥니 다. 이 값은 조정 디지털로 쉽게 일정하게 유지된다. 다음 기술을 이용하여 화질이 재현되도록 ​​상기 카메라 렌즈 상수 마우스의 눈으로부터의 거리를 유지한다.

    주 : 디바이스는 이미지, 우리는 카메라 렌즈와 일정한 마우스 눈 간의 포커스, 밝기 및 거리를 유지하는 후방 눈 부 시도 할 수 있기 때문에, 우리는 이미지를 다른 각도에서 전체 후방 눈 등. 이것의 핵심은 VIE의 필드와 눈을 통해 ICG 의해 방출 원 형상의 발광을 정렬하는 것이다카메라의 승. 전체 이미지가 더 어두운 영역이 없을 때까지이 작업은, 왼쪽에서 오른쪽으로 만들어 카메라 위치의 상하 및 안팎으로 조정을 수행 할 수 있습니다. 카메라의 뷰의 발광 및 필드가 줄 때, 렌즈에 눈의 거리가 품질의 영상을위한 최적의 거리에서 다음 이미지의 설정뿐 아니라 재현 할 것입니다.
  3. 맥관 구조에 초점이 맞춰지면, 획득 모듈에 둥근 검은 버튼을 누르면 이미지 프레임을 캡처. 라운드 블랙 버튼은 최고의 화질 ICG의 신호를 감소 시키거나 향상시키기 위해 사용될 수있다.
  4. 이미지 맥락막 병변에 최적의 화각과 초점 깊이를 결정합니다. 그것은 눈의 위치, 초점 심도, 및 전체 시간 코스 ICGA 고정 다른 장치 설정을 유지하는 것이 중요하다. 이미지는 획득 모듈의 터치 스크린 패널에 획득 버튼을 누름으로써 저장된다.
  5. 6-15 분 후방에서 중간 단계의 이미지를 얻기어 사출.

    참고 : 맥락막과 망막 혈관 모두가 뚜렷됩니다. 맥락막 혈관은 확산 형광을 나타납니다. 과 형광을 나타내는 맥락막 병변은 통상 배경 형광을 둘러싼 페이딩 대조적 등장.
  6. 주사 후 17 ~ 25 분에서 후반 단계에서 이미지를 수집.

    참고 :과 형광 페이드. 두 맥락막과 망막 혈관은 더 이상 볼 수 없습니다. 시신경의 머리는 검은 색이됩니다. 비침 맥락막 병변은 페이딩 배경으로 최대한의 대비를해야합니다.
  7. 이미지의 인수를 마무리 한 후, 마우스의 눈에 분명 윤활유 눈 젤을 적용하고 복구를 위해 가열 패드에서 마우스를 둡니다.
  8. 자신의 새장을 들고 지역에 마우스를 반환합니다. 추가 분석을 위해 TIFF 또는 JPEG 파일로 내보내기 이미지.

주 : 각 단계의 타이밍이 절대 아닙니다. 우리는 발견 EA의 타이밍CH상은 주입 ICG의 양에 따라 변경 될 수 있습니다. 더 ICG는 각 단계를 연장하는 경향이있다. 단계를 정의하는 가장 좋은 방법은 위에 나열된 각 단계의 주요 기능에 따라입니다.

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결과

우리는 CD1의 배경에 둘 중, HTRA1 형질 전환 마우스 및 제어 WT의 한배 새끼의 ICGA 시간의 과정을 수행 하였다. 흰둥이 CD1 배경은 인도시 아닌 형광 안저 혈관 조영술 (ICGA) 영상 (설명 참조)을 용이하게하기 위해 선택되었다. 의 확장이 같은 일부 동맥류가 HTRA1 마우스의 초기 단계에서 나타나기 시작했다 (그림 2, 빨간색 화살표는 용기의 끝 부분에 팽창을 나타내며 빨간색 원이 클러스터 유형 결절 병변을 나타냅니다). 맥락막 혈관 중에 WT 및 HTRA1 마우스 모두에서 명확하게 볼 수 있습니다이 ICG 염료의 단계 채우기 초. 중간 단계에서 초기 단계의 비침 병변 명확되었고, 맥락막 혈관 (노란색 동그라미가 더 병변의 모양을 나타냅니다) HTRA1 마우스 퇴색하기 시작하면서 더 많은 병변이 나타나기 시작했다. 모든 혈관이 배경으로 사라져로 후반 단계에서 HTRA1 마우스의 맥락막 병변은 더 "별개"가되었다. 시신경 머리 WT 및 HTRA1 마...

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토론

이 연구에서, 우리는 HTRA1 형질 전환 생쥐의 이미지 맥락막 병변 ICGA의 사용을 보여 주었다. 우리의 마우스 모델에서 초, 중, ICGA의 후반 단계의 특징은 인간의 연구 1에서 잘 시간 코스와 일치합니다. 이는 AMD와 맥락막과 관련된 조건의 병태 생리 학적 기전 및 치료 전략에 대한 연구를위한 귀중한입니다 인간의 병리 및 동물 표현형 사이 좋은 비교를하는 것이 중요합니다.

우리는 첫 번째 IP 주사로 쥐 ICGA를 수행하고 시간 경과 아마 인해 복부에있는 체강 (그림 3)에서 ICG 염료의 변수 흡수, 마우스에서 마우스로 높은 변수 것으로 나타났습니다. 이로 인해 IV 주입에 의해 수행까지의 연구와 비교할 수있다. 또한, IV-ICGA의 상이한 위상의 혈관 조영상의 특징 동물에서 맥락막 병변의 종류를 특징 짓는 매우 유용 모델. 대부분의 사람들은 때문에 꼬리 정맥 주입 (마우스 꼬리 정맥이 작은 수 있습니...

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공개 사항

YF는이 작품에 사용 된 AMD의 마우스 모델에 관한 두 개의 출원 특허의 발명가이다. SK, ZB, 그리고 ADJ는 공개 아무것도 없어.

감사의 글

이 작품은 실명 (RPB)을 방지하기 위해 NIH 교부금 1R01EY022901, 연구에서 경력 개발 수상에 의해 지원되었다, CMReeves & MA 리브스 재단, 시각 장애인 E. 마틸다 지글러 재단, 기사단 눈 재단, 그리고학과에 제한없이 부여 RPB 유타 대학의 안과. 우리는 원고에 대한 토론과 의견에 대한 Spectralis 멀티 양상 이미징 시스템 및 타오 장에 기술 지원을 Balamurali Ambati 감사합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Spectralis 다중 양식 이미징 시스템하이델베르크 엔지니어링, 독일SPECTRALIS HRA+OCT
트로피카미드 점안액(1%)Bausch & 동공 확장을 위한NDC 24208-585-64
GenTeal GelGentealNDC 58768-791-15  클리어 루브리컨트 아이 젤 
케타민Vedco IncNDC 50989-996-06
XylazineLloyd LaboratoriesNADA 139-236
AcepromazineVedco IncNDC 50989-160-11
32-G 바늘SterijectPRE-32013
1-ml 주사기BD309659
Indocyanine GreenPfaltz & 바우어I01250
Lomb

참고문헌

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