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방법 논문

심근 내 휴대 납품 : 쥐과 마음의 관찰

13.4K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/51064

⸱

2014년 1월 24일

 ,  ,  , 
1Magdi Yacoub Institute, Imperial College London, 2National Heart and Lung Institute, Imperial College London, 3Australian Regenerative Medicine Institute, Monash University

이 논문에서

요약

고혈압이나 심근 경색 등의 심혈관 질환의 생쥐 모델에서 심근 내 세포 전달은 널리 재생 연구에서 서로 다른 종류의 세포 치료 가능성을 테스트하는 데 사용됩니다. 그러므로, 상세한 설명이 수술의 명확한 시각화가 작은 설치류의 혈관 세포 치료 분석의 한계와 이점을 정의하는 것을 도울 것이다.

초록

이전 연구는 세포 배달 사이토 카인 및 심장 조직 재 시술 및 세포의 생존을 증가 요인의 방출에 의해 심장 기능의 개량을 촉진 것으로 나타났다. 또, 상기 관찰은 심장 줄기 세포, 간엽 줄기 세포와 같은 특정 cardiospheres 줄기 세포, 심근 세포, 평활근 세포 및 내피 세포로 분화하여 주변 심근 내에 통합 할 수있는 능력을 가질 것으로 나타났다.

여기, 우리는 확실하게 immunodepleted 마우스의 왼쪽 심실 벽에 noncontractile 세포를 제공 할 수있는 대상 및 방법을 제시한다. 이 미세 수술 절차의 현저한 단계는 마취 및 진통제 주입, 기관 내 삽관, 가슴을 열고 멸균 30 게이지 바늘과 정밀 마이크로 리터 주사기로 세포의 마음과 배달을 노출 절개를 포함한다.

심장 수확, embeddi 구성된 조직 처리NG, 절편 조직 학적 염색은 심근 내 세포 주입 작은 심 외막 지역의 피해뿐만 아니라, 심실 벽을 생산 것을 보여 주었다. Noncontractile 세포는 면역 생쥐의 심근 벽으로 유지하고, 심장 압력 및 기계적 부하로부터 보호 할 가능성이 섬유 성 조직의 층에 의해 포위되었다.

서론

다양한 세포 배달 프로토콜은 인간의 환자에서이 실험 절차의 효율성, 효과와 안전성을 번역하는 것을 목표로 심혈관 질환의 생쥐와 쥐 모델에서 테스트되었습니다. 쥐의 심장 antegrade 3 역행 4 관동맥 세포 주입으로도 사용할 수있는 반면, 작은 설치류의 마음에, 심근 내 세포 전달은 세포 전달 1,2의 가장 실현 가능한 방법입니다. 두 가지 방법 모두 한계와 장점이 있습니다. 관상 동맥 내 경로를 통해 세포 전달은 글로벌 휴대 보급 3 증진에 직접 근육 주사를 통해 이론적 인 장점을 가지고 있지만, 그것은 또한 관상 동맥 색전증 3,5를 일으킬 위험이 있습니다. 심근 내 배달의 제한은 기계적 손상, 급성 염증, 심근 손상 6,7과 연결되어 있습니다. 인간, 심장 수리를 위해 세포 내막 또는 외과 심 외막을 통해 심근 내 주입에 의해 제공됩니다접근 또는 관상 동맥 내 동맥 경로 (8)에 의해. transvascular 경로로 주입은 급성 심근 경색 및 재관류 심근 환자에 적합하지만, 전체 폐색 또는 영향 지역 (9)의 혈관 내 가난한 흐름의 경우에는 할 수없는 경우가 있습니다. transendocardial 또는 transepicardial 주사 심실 벽에 직접 주사는 환자의 건강 상태에 따라 기술적으로 가능하다. 실제로, transepicardial 주입 열린 가슴 수술이 필요하고, transendocardial 위해 가능한 허혈성 또는 상처 심근 9의 사이트를 차별화하는 데 필요한 각각의 환자에 대한 전기 생리학 맵핑에 접근하지만,이 기술은 10, 11 안전한 것으로 나타났습니다.

중요한 사실은, 세포 치료 연구에 이식 될 수있는 가장 좋은 셀의 선택은 조사 중에있다. 단기 분석 (4 주) 보여 주었다 cardiospheres로 정의 심장 줄기 세포의 주입 12 골수 13 쪽 인구 세포 흉터의 크기와 세포 사멸을 감소시킴으로써 심근 경색의 쥐 14 쥐 15 모델에서 심장 기능 회복을 유도. 면역이없는 쥐의 심근 경색 모델에서 cardiospheres의 동종 이식은 심장 재생을 촉진, 안전한 것으로 판명, 내생 수리 메커니즘 (15)의 자극을 통해 심장 기능을 개선했다. 마음에 Lin-/c-kit + 성인 전구 세포는 시험 관내 및 생체 내에서 자기 갱신, 클론 원성 및 다 능성 것으로 표시하고, 허혈성 쥐의 심장에 주입했을 때이 부상 심근 벽 (16)의 많은 부분을 재구성하고 있었다되었다 도전과 중간 크기의 관상 동맥 (17)을 형성 할 수있는 능력. 이 유망한 데이터 상에 연료를 공급 I과 인간의 임상 2 :자가 및 동종 중간 엽 줄기 세포 (MSC) (18)의 주입은, 19 cardiospheres, 또는 C-키트 긍정적 인 심장 줄기 세포 (CSC) 허혈성 인간의 마음에있는 20 각 장기 연구에서 심장 기능에 유익한 효과를 보여 주었다. 그럼에도 불구하고, 넓은 장기 후속 및 향적 메타 분석 줄기 세포 요법이 아니라 예측할 수없는 결과 (21)의 범위 외에서는, 일부 환자에 상당한 이점을 제공한다는 것을 보여 주었다. 이들 제한은 각 각 질환에 대한 세포 전달의 특정 프로토콜의 설계를 필요로 할 가능성이있다.

마우스와 쥐 모델에서 장기 연구는 세포 주입이 더 심장 기능 (12 개월)이 개선되지 않은 것으로 나타났다. 실제로, 인간 배아 줄기 세포 유래 심근 (hESC의-CM)의 이식은 주로 섬유 성 조직 (22, 23)의 층에 의해 숙주 심근로부터 단리 하였다. 비슷한 결과는 경색 마우스 (24)의 마음으로 골격 근육 아세포의 심근 내 이식 후 관찰되었다. Furthermo다시 경색 심장에 기능을 유지하기 위해 동종 중간 엽 줄기 세포의 장기 기능이 분화 25 일 이후 면역 상태로 면역 적격의 전환에 의해 제한되어 있습니다.

고려 위에서 설명한 도전과 전망을 고려, 우리는 쥐의 심근 내 주입하여 세포를 전달하는 방법을 여기에 보여줍니다. 우리는 심근 수축 특성이없는 세포가 숙주 심근 접속하고 얇은 섬유 성 장벽 응집 덩어리를 형성하지 않는 것을 관찰한다. 일부 경우에 이러한 결과는 바람직 할 수도 있지만, 다음의 분석은 세포의 생착뿐만 아니라 기능적으로 연결된 심근 구조를 생성하기 위해 변조 될 수있는 방법을 이해하는 것이 유용 할 수있다.

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프로토콜

모든 동물 실험은 국제 (유럽 의회의 지침 2010/63/EU) 및 국가 (영국 홈 오피스, 법 1986) 규정에 따라 수행되었다. 본 명세서에 기재된 방법은 UK 라이센스 권한 하에서 작업 우리 계획의 일부와 기록의 목적으로 수행되지 않았다.

1. 세포의 준비

이 프로토콜은 설명을 위해 특정 세포주 (인간 배아 신장, HEK293 세포)의 제조를 설명한다. 셀 - 특정 프로토콜은 성장하고 결국 특정 세포 계통에 능성 또는 성체 줄기 세포 분화에 대한 고용해야합니다.

  1. DMEM 매체 1 % 피루브산 나트륨, 2 mM의 글루타민, 1 % 항생제 펜 / Strep의 10 % 태아 소 혈청 (FBS)을 함유하는 (고 글루코스, 4500 ㎎ / L)에서 세포를 성장한다. 한 10cm 플레이트는 일반적으로 1:3 분할해야하고 미디어 이틀 신선한 보충.
  2. tryps와 약간 세포 치료1:1 설명 된 DMEM 배지에서 1X 및 재현 탁한다.
  3. 혈구 챔버에서 세포를 계산하고 별도의 튜브에 3 × 10 6 세포를 수집합니다.
  4. 5 분 100g에서 스윙 버킷 로터에서 원심 분리기.
  5. 뜨는을 취소하고 멸균 인산 완충 배와 세포 펠렛을 씻으십시오.
  6. immunodepleted 마우스의 좌심실에 주입을위한 10 50분의 6 UL의 농도로 PBS 1X에 재현 탁.

2. 수술 전 상태

  1. 각각의 수술 전, 온도 조절 아이솔레이터의 무균 식품 알약과 물 (표 1 22 ° C)와 immunodepleted 마우스 (NOD.CB17-Prkdscid/JHliHSD)를 유지한다.
  2. 층류 후드 immunodepleted 마우스의 수술을 수행합니다. 70 % 에탄올로 작업 영역을 청소하고 수술 도구 (집게와 가위를) 압력솥.
  3. 수술과 회복을위한 가열 패드의 전원을 켭니다. 전기 히터는 중요하다중에 발생하는 체온의 감소 및 사후 수술을 차단.
  4. 복구 가열 패드에 깨끗하고 멸균 케이지를 놓습니다.
  5. 아이솔레이터에서 멸균 멸균 봉투에 수술 방에 원래 케이지에 마우스를 수송한다.
  6. 마우스를 체중 및 체중에 따라 분사 피하 (SC) medetomidine 및 마우스를 마취 0.9 % 멸균 식염수에 희석 케타민 히드로 클로라이드를 함유하는 용액뿐만 아니라 (근육을 이완시키는 medetomidine 1 ㎎ / kg; 케타민 히드로 클로라이드 (75) ㎎ / kg).
  7. 완전히 마취 할 때 (1 ~ 2 분 이내에 자극 후 더 발가락 핀치 반사)를 케이지에서 마우스를 제거하지
  8. 가슴의 왼쪽에있는 제모 크림과 목의 영역을 적용합니다. 시간 (약 2-5 분)의 적당량 후, 물에 젖은 조직과 느슨한 머리를 닦아.
  9. 앙와위에서 수술 패널에 마우스를 놓습니다. 부터외과 의사의 관점 위치는 수직 꼬리 아래로 헤드 업입니다.
  10. 뒷다리의 피하에 멸균 생리 식염수 (부 프레 노르 핀)에 희석하여 0.1 ~ 0.2 ㎍ / g에서 진통 용액을 주입하고면 팁 어플리케이터를 사용하여 무균 용액 포비돈 요오드 면도 영역을 커버.
  11. 목 지역에 현미경 (2.5 배 목표를) 초점을 맞 춥니 다.

3. 외과 조건

  1. 무딘 가위 약간 윤상 연골 아래 약 0.5 cm 길이의 중간 선 복부 피부 절개를 함께. 침샘을 시각화하는 결합 조직에서 피부를 분리합니다.
  2. 동시에 forcep 자기 가슴 트랙터와 각 부분의 옆으로 당겨 자연 중간 선 부문의 침샘을 분할 및 기관을 노출합니다.
  3. 후두를 노출하는쪽으로 부드럽게 혀를 잡아 당깁니다. 주의기도에 삽관 튜브를 밀어 넣습니다. 튜브의 끝이 표시 L을 통해 볼 수 있습니다arynx 및 기관. 튜브에 있지만 확실하게 보이지 않는 경우에 중요한, 그것은 식도이다. 그것을 제거하고 튜브 끝의 위치를​​ 변경합니다.
  4. 환기 시스템에 튜브를 연결합니다. 200 ㎕의 150 스트로크 / 분에서 스트로크 볼륨을 설정합니다. 테이프로 수술 패널의 환기 튜브를 고정합니다.
  5. 왼쪽 흉부 지역에 1.5 cm 길이의 피부 절개에 - 무딘 가위와 집게로, 1 머리에 수직 꼬리를합니다.
  6. 절개를하지 않고 결합 조직 / 근육 층과 메이저와 마이너 가슴 근육으로부터 피부를 풉니 다.
  7. 다음과 같이 세 번째와 네 번째 늑골 간 개흉술을 수행
    1. 곤란하고 작은 둥근 집게로 긁어서 늑간 근육 층을 관통.
    2. 늑간 근육 층이 관통되면, 최대한 흉강을 열고 가슴 트랙터를 배치합니다. 그 위에있는 귓바퀴 (아트리움)과 좌심실 (LV)의 상단과 중간 부분은지금 눈에 보이는.
  8. 세포와 정밀 주사기를 준비합니다. 주사기 각 주사 10 UL의 볼륨의 양을 제공 할 수 있어야한다. 주사기의 끝 부분에 30 G 바늘을 캐스팅합니다.
  9. 노출에게 바늘의 오픈 팁을 포함하여 단 1 밀리미터를 떠나, 바늘 테이프 (introcan-W 20 G에서) 작은 플라스틱 캐 뉼러를 사용하여 고정하십시오. 이것은 전체 좌심실 벽을 관통하고 좌심실 공동 내로 세포를 주입부터 바늘을 방지 할 것이다.
  10. (각 주사 주입 106 세포의 총 10 UL를 제공 할 것입니다) 5 배 목표의 도움으로,이 배율 좌심실에서 시각화하고 5 개의 다른 위치에서 왼쪽 심실 벽에 세포를 주입. 주입이 성공하면 흰색 영역 및 셀 주요 역세의 부재 (사출에 성공하지 않은 경우, 동물은 기능 분석에서 제외된다) 표시 할 것이다.
  11. 트랙터를 제거합니다. 흉부 B 벽을 닫습니다Y는 6-0 실크 봉합사의 두 바늘에 두 개의 분리 된 갈비를 둘러싸.
  12. 가슴 근육과 PBS 1X에 젖어면 끝이 피부를 보습하고 조심스럽게 집게로 원래의 위치로 근육을 넣어.
  13. 6-0 실크 봉합사의 3 ~ 4 바늘로 피부를 닫습니다. 피부를 닫습니다 2-3 바늘 목 절개를 봉합.
  14. 마취 효과를 되돌릴 atipamezole (1 ㎎ / ㎏ 최종 농도)를 주입한다.
  15. 마우스가 자율적으로 호흡을 시작하자마자, 기관에서 튜브를 꺼내 그 오른쪽에 마우스를 넣어. 마우스를 몇 분 안에 복구 할 것으로 예상된다.
  16. 마우스를 켜고 도보 시간 동안 따뜻한 복구 케이지 (폐쇄 필터링 최고 작은 IVC 케이지)에 배치하기 시작합니다.
  17. 제어 가열 상자 (37 ℃)에서 밤새 동물을 둡니다.
  18. 수술 후 처음 2 일간 복구를 지원하기 위해 물과 펠렛 음식과 요리를 입력합니다.

4. 수술 후 분석

다음과 같이 세포와 10 제어 주입하지 마음을 주사 열 마음은 조직 학적으로 분석하고 있습니다 :

  1. 일주 주입 (그림 1, 3) 후 이식 세포의 분석을 수행합니다.
    1. 이소 플루 란의 과다 복용에 의한 안락사 후, 조직을 해결하기 위해 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 20 ㎖와 마음을 perfuse. (70~100%) 에탄올의 비율을 증가하고 파라핀 블록에 삽입 고정 된 조직을 탈수.
    2. 제 형태 학적 분석을 위해 헤 마톡 실린 및 에오신 5 μm의 얼룩에서 마이크로톰 파라핀의 마음입니다.
    3. 메이슨의 트리 크롬 염색을 사용하여 결합 조직을 시각화.
    4. 슬라이드 스캐너 현미경 (도 1A, 2A, 3A, 3B 및 3C)에서 이미지를 분석하여 디지털 슬라이드 스캐너 현미경 (Figu을 사용하여 단축 뷰의 전체 심장을 시각화입술 1B 및 1C).
  2. 위의 분석은, 자일 렌의 심장 조직을 deparaffinize 후, 에탄올의 비율을 감소하는 표본을 잠수 (100 %의 물)과 주사 전자 현미경 (SEM)을위한 과정은 다음과 같이하여 재수 :
    1. 1 시간 동안 0.1 M 인산 버퍼에 1 % 탄닌산으로 탈 파라핀 블록을 품어.
    2. (25~100%) 에탄올의 비율을 증가하는 표본을 탈수.
    3. HMDS (헥사 메틸 디 실라 잔)을 건조 샘플.
    4. 애치슨은 다그 및 금 팔라듐 코팅을 가진 스텁에 시편을 장착합니다.
    5. 분석 스캐닝 전자 현미경 (그림 2B)에서보기 샘플.

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결과

우리는 긴 심근 (그림 1A)에 비해 조약돌 모양 (그림 1) 서로 다른 형태로 심장 세포에서 구별 HEK293 세포를 주입. HEK293 세포 때문에 그들의 증가 핵 콘텐츠 (그림 1A)의 가능성이 심근 (핑크 색상)에 비해 헤 마톡 실린 염색 (파란색)에 더 민감했다. 또한 호스트 조직으로부터 주입 된 세포를 구별하기 위해, HEK293 세포를 주사 전에 DAPI 2시간으로 표시했다. 도 1E에 도시 된 바와 같이 표지 된 세포가 심근 조직에 표시했다. 제어 가짜로 작동하는 마우스는 온 마음 (그림 1C)과 조직 (그림 1D)의 무결성에 손상을 보여 주었다.

심장의 전체 짧은 축보기에서 주입 된 세포는 주입의 영역 (그림 1B)의 균일 한 그룹으로 볼 수 있었다....

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토론

이 논문에서, 우리는 쥐의 심장 세포의 심근 내 주입을 수행하는 방법을 보여 주었다. 이 방법의 증거로, 우리는 HEK293 세포를 사용했습니다. 그것은 HEK293 세포가 어떤 세포 치료 연구에 사용하지 않으며, 따라서이 논문의 연구 결과는 치료 접근에 직접 번역에 적합하지 않은 것을 강조하는 것이 중요하다. 그러나, HEK293 세포는 세포 수축되지 않는 다른 종류의 세포에 transdifferentiate하지 않는다는 사실은 전달되는 세포의 특성 및 전달 경로와 같은 기술적 측면에주의를 집중한다.

그것은 관동맥 경로 부상 부위의 균질 분포를 제공 할 수있는 반면, 심근 내 경로, 심장 조직 (24, 26)에 포함 된 셀 클러스터를 야기하는 경향이 있다고보고되었다. 심근 교체, 이상적인 기증자의 세포는 전기 생리학, 구조 및 수축 properti을 전시한다심근의 ES 및 이식 전에 사용되는 세포 분화 프로그램에 대한 필요성을 제안, 숙주 조직에 구조적으...

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공개 사항

저자가 공개하는 게 없다.

감사의 글

우리는 현미경 분석과 심장 수리 기술자 및 우리의 동물 시설의 관리자를 포함하는 프로젝트를 지원하기위한 Magdi 야콥 연구소 (MYI를) 감사합니다. 이 작품은 영국 심장 재단 (BHF), 프로젝트 보​​조금 PG/10/019에 의해 지원되었다. MPS는 MYI와 BHF에 의해 지원됩니다. TP는 BHF-우수 연구 위원입니다. NR은 NH & MRC 호주 연구원입니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
아이솔레이터Pfi 시스템견적 필요
가열 패드Vet Tech SolutionsHE006작은 동물의 경우
MedetomidineNational Veterinary Service수의사 처방이 필요합니다
케타민 염산염National Veterinary Service수의사 처방이 필요합니다
Atipamezole국가 수의학 서비스수의사 처방이 필요
제모 크림상업 상점
부 프레 노르 핀NVS수의사 처방이 필요한
라이카 MZFLIII 현미경라이카모델 S6E스윙 암 스탠드 TS0
하마마츠 나노 줌머 디지털 슬라이드 스캐너하마 마츠RS 시리즈
주사 전자 현미경JeolJSM-6610
무딘 가위FST14084-09
MiniventHarvard Apparatus73-0043소형 Y 어댑터(73-0027) 및 삽관 캐뉼러(73-2844)
겸자FST11052-10
수축 시스템FST18200-20최대 200g의 동물용 키트
30 G 12 mm; ½ inchBBraunA210Fine yellow
Microliter syringeESSLAB81201또한 Hamilton 반복 디스펜서 PB 600-1 포함 카탈로그 번호 83700
6-0 실크 봉합EthiconW1614T
사

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