실험 패혈증은 맹장 결찰과 천자 (CLP) 방법을 사용하여 마우스에서 유발 될 수있다. CLP - 유도 패혈증의 컨텍스트에서 생체에 autophagy를 평가하는 현재의 프로토콜이 여기에 제시된다 : (GFP) - LC3 마우스를 사용 autophagy에 측정을위한 프로토콜, 및 전자 현미경에 의해 autophagosome 형성을 측정하기위한 프로토콜.
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이 논문에서
요약
초록
실험 패혈증은 맹장 결찰과 천자 polymicrobial 패혈증 발생 (CLP) 방법을 사용하여 마우스에서 유발 될 수있다. 여기서, 프로토콜 CLP 기술을 사용하여 마우스에 다양한 중증도의 패혈증을 유발하도록 제공된다. autophagy에 스트레스와 병원균 침입에 대한 근본적인 조직의 반응이다. 실험 패혈증의 맥락에서 생체 내에서 autophagy에를 평가하기 위해 현재의 두 프로토콜도 여기에 표시됩니다. (I), 녹색 형광 단백질 (GFP) - LC3 융합 단백질을 발현하는 형질 전환 마우스는 CLP을 실시한다. GFP 신호 (puncta에)의 현지화 강화는 면역 또는 공 촛점 분석에 의해 하나 정량으로, 향상된 autophagosome 형성을 감지하고, autophagy에 경로의 따라서 변경 활성화하는 데 사용할 수 있습니다. (autophagy에 자극 마커 등) 단위 조직 면적당 (II) 향상된 autophagic 액포 (autophagosome) 형성은 전자 현미경을 사용하여 정량화 될 수있다. 패혈증 autophagic 반응의 연구는 중요한 샘플입니다조직이 감염에 반응하는 메커니즘을 이해 onent. 이 지역에있는 연구 결과는 궁극적 중요한 치료 의학의 주요 문제를 나타내는 패혈증의 발병 기전을 이해에 기여할 수있다.
서론
패혈증, 감염에 대한 전신 염증 반응은 비판적으로 아픈 환자 1에서 사망의 주요 원인을 나타냅니다. 자주 polymicrobial 패혈증에 이르는 복강 내 감염, 최대 60 % 2의 상당한 사망률이있는, 패혈증 케이스의 20 %를 차지하고있다. 패혈증 관련 사망률은 주로 다음 장기 부전 3,4에 다 장기 부전의 결과. 이 질병의 발병 메커니즘에 추가적인 조사가 급하게 신규하고보다 효과적인 치료법의 개발을 촉진하기 위해 필요하다.
맹장 결찰술 및 천자 (CLP) 방법은 생체 내에서 모델링 패혈증 일반적으로 사용되는 절차입니다. 궁극적으로 맹장 박테리아 가득으로, polymicrobial 복막염에서의 천자 결과, 혈액 (균혈증)에 박테리아의 전위, 패 혈성 쇼크, 다 장기 부전 및 사망 5. 그것은 일반적으로 CLP 임상 반영 접수더 정확하게 설치류에 독소 또는 정제 된 박테리아의 주사와 같은 이전 기술보다 현실 따라서, CLP는 패혈증의 발병 기전의 조사, 따라서 실험 유도 6 (하지 제한없이이기는하지만) 황금 표준으로 간주된다. 이 논문에서, 우리는 패혈증의 발병 메커니즘은 autophagy에 포함 여부를 평가하기위한 프로토콜....
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프로토콜
참고 : 브리검 여성 병원 / 하버드 의과 대학 지역의 기관 동물 관리 및 사용위원회는 다음과 같은 절차를 승인했다.
1. 맹장 내고와 빵꾸
같은 배경의 마우스를 사용합니다 (C57BL / 6), 8-10 주 된 남성. 암컷 생쥐는 패혈증에 의한 치사율에 대한 남성보다 더 강한입니다. 팔주 세 이상 마우스는 CLP 후 생존의 측면에서 젊은 쥐보다 변수 결과를 생산하고 있습니다. 약 N은 비교 그룹에 10 마우스는 생존 분석을 위해 사용되어야한다 =. N = 3-5 마우스는 autophagy에 분석 실험에 적합하다.
- 설치류 수술에 적합해야한다 멸균 작은 수술기구 (즉 메스, 가위 무딘 해부 집게를) 사용합니다.
- 마취 혼합물을 제조 : PBS의 7.95 mL에 자일 라진 (AnaSed 주사 100 ㎎ / ㎖)의 150 μL와 케타민 (Ketaset 700 μl를 추가 CIII, 100 ㎎ / mL).
- 절차를 수행하는 동안 무균 조건을 보장하기 위해, 장갑, 얼굴 마스크와 수술 가운을 착용한다.
- 동물의 무게를. intraperitonally 주입을 마취
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결과
균혈증은 초기 CLP-유도 패혈증 14 후 6 시간으로 마우스에 존재한다. (오한, tachypnoea 및 손상 모터 활동 포함) 패혈증의 임상 증상은 수술 후 약 12 시간으로 나타납니다. 마우스는 복막염의 유도 후 약 18 시간에서 죽기 시작 CLP를 실시. 더 심한 더 증가 패혈증은 치사율 (15)이다. CLP 후 7 일에서 60 %의 사망률 중급 패혈증 결과 (이 시간 제한을 넘어, 사망자가 예상되지는) 동안 구체적으로, 고급 패혈증 (그림 1) 2 ~ 3 일 이내에 100 % 사망의 원인이됩니다. 대조적으로, 모의 생쥐의 사망률이 0이어야
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토론
CLP의 주요 장점은 연구원이 (저에 대한 중간 및 높은 수준에서 즉) 다른 심각도의 패혈증을 조사 할 수 있다는 것입니다. 유도 패혈증의 심각도는 맹장 결찰의 길이 (가장 중요한 결정 인자)에 의해 영향을받는, 천자 사용 바늘의 크기와 구멍의 수는 15을 수행 하였다. 또한, 마우스의 피로와 성별은 패혈증의 정도에 영향을 미칠 수 있으며, 몇 가지 계통이 다른 사람보다 더 민감하고 남성은 일반적으로 여성 (19, 20)보다 더 취약합니다. 함께 찍은 위의 요인은 CLP에 의한 사망률을 결정합니다.
우리의 경험에 근거하여 달성 CLP 인한 사망률과 관련 연구자 간의 차이가있다. . 예를 들어, Rittirsch는 등 60 %의 사망률 (15)를 달성하기 위해 '관통 한'천자 (두 개의 구멍) 50 % 내고, 21 G, 1을 사용, 우리의 연구 그룹을 필요로.......
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공개 사항
저자는 선언 할 경쟁 금융의 이익이 없다
감사의 글
이 작품은 AMK 최에 NIH 부여 P01의 HL108801, R01 - HL60234, R01 - HL55330, R01-HL079904에 의해 지원되었다. S. Ryter는 난봉꾼 호흡기 연구소에서 급여 지원을 받았다.....
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| GFP-LC3 형질전환 마우스 | Riken (일본) | RBRC00806 | GFP-LC3#53 |
| Xylazine | Henry-Schein | 568-0606 | Xylazine HCl 주입 수의사 |
| 케타민 | Henry-Schein | 995-2949 | Ketaset Inj 100 mg/ml |
| EtOH | Fisher | A405-20 | |
| Sterilizatiion용 | EtOH | Fisher | A407-1 |
| 실크 외과 봉합사 6-0 | Owens & 미성년자 | 2300-0078OG, 017624 | |
| 부프레노르핀-HCl | Henry-Schein | 614-5157 | 부프레넥스 앰플 |
| 파라포름알데히드(37%) 용액 | JT Baker | S898-09 | |
| 크실렌 | Fisher | X3P-1GAL | |
| anti-GFP 단클론 항체 | Life Technologies | G10362 | |
| Hoescht | Sigma | 944403 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| OCT | VWR scientific | 25608-930 | |
| 수단 블랙 | 산타 크루즈 | sc-203760 | |
| EM 등급 글루 타르 알데히드 2.5 % cacodylate | 나트륨 전자 현미경 과학 | 15960 | |
| 프로필렌 옥사이드 | 시그마 | 240397 | |
| 한천 100 수지 | 한천 과학 | R1045 | |
| 도데세닐숙신산 무수물 | 시그마 | 46346 | |
| 메틸나딕 무수물 | 시그마 | 45359 | |
| N-벤질디메틸아민 | 시그마 | 185582 |
참고문헌
- Hotchkiss, R. S., Karl, I. E. The pathology and treatment of sepsis. N. Engl. J. Med. 348, 138-150 (2003).
- Anaya, D. A., Nathens, A. B. Risk factors for severe sepsis in secondary peritonitis. Surg. Infect. 4, 355-362 (2003).
- Bone, R. C., Grodzin, C. J., Balk, R. A.
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