방법 논문

를 사용하여 폐렴 구균 식민지에서 생균제의 효과를 조사 체외 준수의 분석

DOI:

10.3791/51069

⸱

2014년 4월 28일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Pneumococcal Research, Murdoch Childrens Research Institute, 2Allergy & Immune Disorders, Murdoch Childrens Research Institute, 3Department of Otolaryngology, The University of Melbourne, 4Department of Microbiology & Immunology at the Peter Doherty Institute for Infection & Immunity, The University of Melbourne

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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체외에서 준수의 분석은 세포 단층 상피하는 등 폐렴 구균 식민지를 억제하기위한 프로 바이오 틱의 사용과 같은 잠재적 인 개입을 조사하기 위해 폐렴 구균의 부착을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

초록

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비 인두의 상피에 폐렴 구균 (폐렴 구균)의 준수는 식민지가 발생할 수 있습니다합니다. 체외 준수의 분석이 세포를 상피 폐렴 구균의 부착을 연구하는 데 사용할 수있는 폐렴 및 중이염 등의 폐렴 구균 감염을위한 전제 조건으로 간주됩니다 단층과 같은 프로 바이오 틱의 사용과 같은 잠재적 인 개입을 조사하는 폐렴 구균 식민지을 억제 할 수 있습니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 (때때로 HEP-2 세포로 지칭) 인간 상피 세포주 CCL-23 폐렴 구균의 부착에 생균제 스트렙토 코커스 살리 바리우스의 영향을 조사하기 위해 사용된다. 분석은 세 가지 주요 단계를 포함한다 : 상피 세포와 박테리아 세포의 1) 준비, 세포 단층 상피 박테리아의 2) 또한, 실행 가능한 횟수 (시리얼 희석 도금) 또는 정량 실시간 PCR (qPCR에 의한 부착 폐렴 구균의 3) 검출 ). 이 절반hnique은 비교적 간단하고 조직 문화 설정 이외의 특수 장비를 필요로하지 않습니다. 분석은 다른 생균제 종 및 / 또는 폐렴 구균 군체의 잠재적 억제제를 시험하는데 사용될 수 있고 쉽게 폐렴 구균 부착 및 침윤에 관한 다른 과학 문제를 해결하기 위해 수정 될 수있다.

서론

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연쇄상 구균 폐렴 (폐렴 구균)는 폐렴, 중이염, 수막염 등의 감염을 일으킬 수있는 그람 양성 세균이다. 그것은 저소득 국가 어린이 매년 1 5 세 미만 어린이의 약 80 죽음에 책임이있는 질병의 주요 원인입니다. 폐렴 구균은 종종 어린이의 비 인두에서 수행됩니다. 이 식민지는 일반적으로 자각 증상이없는 것으로 간주되어 있지만, 그것은 폐렴 구균 감염을 앞에 인간의 인구 2의 박테리아를위한 저수지 역할을한다. 폐렴 구균 결합되는 예방 접종이 효과적으로 백신에 포함 된 혈청 형의 운송을 줄일 수 있습니다. 그러나, 90 폐렴 구균 혈청 형에, 그리고 예방 접종은 백신 혈청 형의 제거가 nonvaccine 혈청 형 3에 의한 운송과 질병의 상승 뒤에된다 혈청 형의 교체로 이어질 수 있습니다. 또한, 약간의 위험이 높은 집단에서, 폐렴 구균식민지는 종종 이전에 첫 번째 백신 투여 량 4.5의 관리에, 초기 생활에서 발생합니다. 최근, 프로바이오틱스의 사용은 폐렴 식민 6,7을 억제하는 추가의 전략으로서 제안되었다. 체외 부착 분석법은 폐렴 구균 부착 8,9를 검사하는데 사용되어왔다. 이러한 분석은 폐렴 구균 준수 (10)의 프로....

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프로토콜

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1. 상피의 제조 및 균체

  1. CCL-23 상피 세포의 해동
    1. ~ 30 분 동안 37 ° C의 물 중탕에서 10 % 태아 소 혈청 (FBS)을 함유하는 최소 필수 Prewarm 매체 (MEM).
    2. 사용하기 전에 적어도 10 분 동안 자외선을 조직 배양 승인 생물 안전 캐비닛을 소독하고, 70 % 에탄올로 작업 영역을 닦습니다. 생물 안전 캐비닛에 70 %의 에탄올과 장소 가온 미디어의 병을 닦습니다.
    3. 25 ML 피펫을 사용하여, T-75 플라스크에 미디어의 14 ML을 전송합니다. 세포 (섹션 1.1.4) 해동하는 동안 37 ° C 배양기에서 플라스크를 놓습니다.
    4. ~ 80 %가 해동 될 때까지 37 ° C의 물을 욕조에 적절한 안전주의 사항과 따뜻한을 사용하여 액체 질소 저장에서 CCL-23 세포의 유리 병을 제거합니다.
    5. 생물 안전 캐비닛 섹션 1.1.3에서 제조 된 플라스크를 반환합니다. T에 70 %의 에탄올과 내용을 전송 (1 ㎖)으로 CCL-23 세포의 유리 병의 외부 표면을 닦아P1000 피펫을 사용하여 -75 플라스크.
    6. 37 ° C에서 5 % CO 2, 95 % 상대 습도의 조직 문화 인큐베이터 하룻밤 (16 ~ ....

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결과

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대표적인 실험의 결과가되는 폐렴 구균에 (S. pneumoniae에 PMP843, 정착 19F 분리)를 1 시간 S의 첨가 후 CCL-23 세포에 추가 된 살리 바리우스, 및 폐렴 구균 부착이 가능한 횟수 및 리타 qPCR의 양에 의해 정량화되었다 표 2에 나타낸다. 결과 개수로 표준화 박테리아의 절대 수 (CFU / ㎖로 표시) 및 % 부착, 모두이 방법 간의 일치했다 혼자 폐렴 구균을 포함하는 우물의 부착 폐렴 구균. 이 폐렴 구균 부착을 억제하는 것으로 알려져 있으므로 폐렴 구균 + 헤파린 상태에서 감소가 부착 (일반적으로 <40 % 형 폐렴 구균에 비해). S.에게 성공적인 분석 나타내는 바와 같이 헤파린은 대조군으로 사용 표 2, S.의 고농도 같이 살리 바리우스는 용량 의존적 방식으로 폐렴 구균 부착을 억제 살리 바리우스 (.......

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토론

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이 분석의 중요한 부분은 S.의 적절한 농도를 추가하고 섹션 3.1.7 및 3.1.12에 살리 바리우스와 폐렴 구균. 농도는 OD의 수치를 사용하여 추정되지만 플레이트 다음날 계산 될 때까지 정확한 접종이 결정되지 않습니다. 이러한 이유로, 우리는 중간 로그 위상을 식별하고 OD하여 농도를 추정을 지원하기 위해 분석에서 사용 된 모든 세균 균주에 대해 시간 OD 및 균수 (CFU / ㎖)를 측정하기 위해 성장 곡선을 수행하는 추천한다. 또한, 폐렴 구균 균주는 준수의 특성에 실질적으로 다를 수 있습니다. 좋은 부착 (> 3 시간 배양 후 상피 세포에 부착 접종의 10 %)가 폐렴 구균 부착을 억제하는 프로 바이오 틱의 능력을 조사 분석에 대한 추천과 긴장. 숙련 된 작업자에 의해 실시하는 경우에도 부착 수준은도 5에서 볼 비교적 큰 오차 막대에 의해 입증되는 바와 같이, 분석에 분석을 변화 할 수있다. 들면이러한 이유로 우리는 각각의 분석 조건에 대한 중복 된.......

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공개 사항

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저자가 공개하는 게 없다.

감사의 글

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이 작품은 머독 아동 연구소와 빅토리아 정부의 운영 인프라 지원 프로그램에서 자금에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
최소 필수 매체(MEM)Thermo Fisher ScientificSH30244.01 
소 태아 혈청 (FBS)Thermo Fisher ScientificSH30084.03 
T-75 플라스크눅크156472 
CCL-23 셀ATCCCCL-23 
트립신생명 기술15090046 
24웰 세포 배양 플레이트Nunc142475 
말 혈액 한천 (HBA) 플레이트OxoidPP2001양 혈액 한천 플레이트도 허용
Todd-Hewitt BrothOxoidCM0189 
효모 추출물Beckton Dickinson212750 
디지토닌시그마-알드리치D141-100MG&nbsp;
일회용 큐벳Kartell1938 
헤파린화이자21121055,000 IU/5m/ 의 멸균 앰플에 들어 있습니다.
멸균 스프레더TechnoplasS10805050대안적으로, 유리 스프레더는 96% 에탄올에 담그고 화염 멸균
매번 LysozymeSigma-AldrichL6876을
무탄올리신시그마-알드리치M9901 
단백질분해효소 KQiagen19133 
SDS 20% 솔루션AmbionAM9820 
RNase A키아겐19101 
QIAamp DNA 미니 키트 (250)Qiagen51306 
LytA F 프라이머Sigma-Aldrich맞춤 제작5' -> 3' 시퀀스 ACGCAATCTAGCAGATGAAGCA
LytA R 프라이머Sigma-Aldrich맞춤 제작5' -> 3' 시퀀스  TCGTGCGTTTTTTAATTCCAGCT
LytA 프로브Eurogentec맞춤 제작5' -> 3' 시퀀스 Cy5-TGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG-BHQ3, 대체 형광체를 사용할 수 있습니다
Nuclease free waterAmbionAM9906 
Brilliant III 초고속 QPCR 마스터믹스Agilent Technologies600880 
Thermo-Fast 96 감지 플레이트 써모 피셔 사이언티픽AB-1100 
Ultraclear qPCR 캡 스트립Thermo Fisher ScientificAB-0866 
Mx3005 QPCR 시스템애질런트 기술401449 
*대체로 나열된 
은 전에 사용할 수 있습니다.. 대부분의/모든 제품에 대해 대체 소스가 사용 가능합니다

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. O'Brien, K. L., et al. Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates. Lancet. 374, 893-902 (2009).
  2. Bogaert, D., de Groot, R., Hermans, P. W. M. Streptococcus pneumoniae colo....

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Streptococcus salivariusqPCRCCL 23

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