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Summary

체외에서 준수의 분석은 세포 단층 상피하는 등 폐렴 구균 식민지를 억제하기위한 프로 바이오 틱의 사용과 같은 잠재적 인 개입을 조사하기 위해 폐렴 구균의 부착을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

Abstract

비 인두의 상피에 폐렴 구균 (폐렴 구균)의 준수는 식민지가 발생할 수 있습니다합니다. 체외 준수의 분석이 세포를 상피 폐렴 구균의 부착을 연구하는 데 사용할 수있는 폐렴 및 중이염 등의 폐렴 구균 감염을위한 전제 조건으로 간주됩니다 단층과 같은 프로 바이오 틱의 사용과 같은 잠재적 인 개입을 조사하는 폐렴 구균 식민지을 억제 할 수 있습니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 (때때로 HEP-2 세포로 지칭) 인간 상피 세포주 CCL-23 폐렴 구균의 부착에 생균제 스트렙토 코커스 살리 바리우스의 영향을 조사하기 위해 사용된다. 분석은 세 가지 주요 단계를 포함한다 : 상피 세포와 박테리아 세포의 1) 준비, 세포 단층 상피 박테리아의 2) 또한, 실행 가능한 횟수 (시리얼 희석 도금) 또는 정량 실시간 PCR (qPCR에 의한 부착 폐렴 구균의 3) 검출 ). 이 절반hnique은 비교적 간단하고 조직 문화 설정 이외의 특수 장비를 필요로하지 않습니다. 분석은 다른 생균제 종 및 / 또는 폐렴 구균 군체의 잠재적 억제제를 시험하는데 사용될 수 있고 쉽게 폐렴 구균 부착 및 침윤에 관한 다른 과학 문제를 해결하기 위해 수정 될 수있다.

Introduction

연쇄상 구균 폐렴 (폐렴 구균)는 폐렴, 중이염, 수막염 등의 감염을 일으킬 수있는 그람 양성 세균이다. 그것은 저소득 국가 어린이 매년 ¹ 5 세 미만 어린이의 약 80 죽음에 책임이있는 질병의 주요 원인입니다. 폐렴 구균은 종종 어린이의 비 인두에서 수행됩니다. 이 식민지는 일반적으로 자각 증상이없는 것으로 간주되어 있지만, 그것은 폐렴 구균 감염을 앞에 인간의 인구 ^2의 박테리아를위한 저수지 역할을한다. 폐렴 구균 결합되는 예방 접종이 효과적으로 백신에 포함 된 혈청 형의 운송을 줄일 수 있습니다. 그러나, 90 폐렴 구균 혈청 형에, 그리고 예방 접종은 백신 혈청 형의 제거가 nonvaccine 혈청 형 ^3에 의한 운송과 질병의 상승 뒤에된다 혈청 형의 교체로 이어질 수 있습니다. 또한, 약간의 위험이 높은 집단에서, 폐렴 구균식민지는 종종 이전에 첫 번째 백신 투여 량 ^4.5의 관리에, 초기 생활에서 발생합니다. 최근, 프로바이오틱스의 사용은 폐렴 식민 ^6,7을 억제하는 추가의 전략으로서 제안되었다. 체외 부착 분석법은 폐렴 구균 부착 ^8,9를 검사하는데 사용되어왔다. 이러한 분석은 폐렴 구균 준수 ^(10)의 프로 바이오 틱 유산균 rhamnosus GG (LGG)의 영향을 조사하기 위해 적용되었다.

LGG 유용한 유산균 이외에, 스트렙토 코커스 살리 바리우스, 구강 공통 상주 인해 잠재적 체외 ^{(11) 내에} 폐렴 구균 및 다른 호흡기 병원체를 억제하는 능력의 정착에 호흡기 대한 잠재적 생균제로서 연구되어왔다 ^{– 13.} 여기에 제시된 프로토콜은 S.의 효과를 조사하기 위해 사용되는 접착 분석을 설명 폐렴 구균 준수에 살리 바리우스 K12인간의 상피 세포 라인 CCL-23. 성장과 준수 속성을 분리 ^10,14 사이에 실질적으로 다를 수있는 분석에 사용하기 전에, 폐렴 구균 균주는 준수의 기능을 평가 하였다. 폐렴 구균과 S.의 성장 곡선 살리 바리우스는 (OD, 그림 1) 광학 밀도 중반 로그 단계 및 추정 농도 (콜로니 형성 단위 또는 CFU / ㎖)을 결정하기 위해 수행되었다. 그것은 각각의 분석에서 사용하기 전에 분리를 위해 가능한 수와 OD로 성장을 검사하는 것이 좋습니다. 이 분석은 표준 조직 배양 시설 및 장비 모든 실험실에서 수행 할 수 있습니다. 이 프로토콜에서, S의 3 회에의 영향 살리 바리우스 이전 S.의 준수에 대한 폐렴 구균의 추가로 1 시간을 관리 폐렴 PMP843, 비 인두 면봉에서 파생 된 혈청 형 19F 캐리지 분리가 검사됩니다. 부착 폐렴 구균을 정량화하는 두 가지 방법이 제시되어 있습니다 억제 혈액 한천에 도금내 가능한 수, DNA 추출 및 qPCR에 ^(15)에 의해 폐렴 구균 리타 유전자의 검출. 기본적인 부착 분석 프로토콜은 쉽게 여러 복용량 또는 프로바이오틱스의 투여 시간을 시험하기 위하여 변형 될 수 있고, 또한 다른 균주 또는 종으로 사용될 수있다.

Protocol

1. 상피의 제조 및 균체

1. CCL-23 상피 세포의 해동
   1. ~ 30 분 동안 37 ° C의 물 중탕에서 10 % 태아 소 혈청 (FBS)을 함유하는 최소 필수 Prewarm 매체 (MEM).
   2. 사용하기 전에 적어도 10 분 동안 자외선을 조직 배양 승인 생물 안전 캐비닛을 소독하고, 70 % 에탄올로 작업 영역을 닦습니다. 생물 안전 캐비닛에 70 %의 에탄올과 장소 가온 미디어의 병을 닦습니다.
   3. 25 ML 피펫을 사용하여, T-75 플라스크에 미디어의 14 ML을 전송합니다. 세포 (섹션 1.1.4) 해동하는 동안 37 ° C 배양기에서 플라스크를 놓습니다.
   4. ~ 80 %가 해동 될 때까지 37 ° C의 물을 욕조에 적절한 안전주의 사항과 따뜻한을 사용하여 액체 질소 저장에서 CCL-23 세포의 유리 병을 제거합니다.
   5. 생물 안전 캐비닛 섹션 1.1.3에서 제조 된 플라스크를 반환합니다. T에 70 %의 에탄올과 내용을 전송 (1 ㎖)으로 CCL-23 세포의 유리 병의 외부 표면을 닦아P1000 피펫을 사용하여 -75 플라스크.
   6. 37 ° C에서 5 % CO _2, 95 % 상대 습도의 조직 문화 인큐베이터 하룻밤 (16 ~ 20 시간)에 옆에 술병을 품어.
   7. 건강한 형태를 확인하기 위해 현미경으로 세포를 검사 용지를 제거하고 새로운 15 ㎖로 교체, MEM + 10 % FBS를 데워진.
2. CCL-23 상피 세포의 유지
   1. 세포 ~ 80 %의 합류 (1-2 일), 25 ㎖ 피펫을 사용하여 미디어를 제거하고 부드럽게 80-10로 두 번 세포를 세척하여 통과가되면 ㎖를 10 ㎖ 피펫을 사용하여 데워진 인산염 완충 생리 식염수 (PBS).
   2. PBS를 제거하고 멸균 된 0.25 % 트립신 – EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 1 ㎖ (0.25 % (W / V) 트립신, 0.1 mM의 EDTA)를 추가합니다. 옆에 술병을 돌려, 트립신은 세포의 합류 층을 커버 수 있도록하고, 37 ° C, 5 % CO ₂ 배양기에서 2 ~ 3 분 동안 플라스크를 배양 회전.
   3. 바이오 안전 캐비넷에 플라스크를 반환, 추가 9 ㎖를 위아래로 6 MEM + 10 % FBS, 피펫을 데워진 -8 배 셀을 제거하는 플라스크의 측면 아래로 액체를 배출, 세포를 재현 탁합니다.
   4. 셀 분할 1:15 (1 ㎖ + 14 ML의 MEM + 10 % FBS) 또는 1시 반 (0.5 ㎖ + 14.5 ㎖의 MEM + 10 % FBS)을 초과하는 세포를 폐기하고, 37 ° C, 5 % CO에 플라스크를 반환 ₂ 배양기.
   5. 통로 적어도 두번 부착 분석에서 사용하기 전에 세포. 일반적으로 세포를 3 ~ 4 일은 모든 분할됩니다.
3. CCL-23 상피 세포의 시딩 (일일 사전 분석, 프로토콜 2를 준수합니다)
   1. 데워진 MEM에 재현 탁 섹션 1.2.1-1.2.3에서 설명한 합류 세포 분열 + 5 % FBS (FBS 농도 분석에서 간섭 혈청 성분의 가능성을 줄이기 위해 감소된다.) 세포의 20 μl를 제거하고 트리 판 블루 염색 및 혈구를 사용하여 계산합니다.
   2. 멸균 50 ㎖ 튜브에서 1.5 × ¹⁰⁵ 세포 / ml의 농도로 데워진 MEM + 5 % FBS에서 세포를 희석.
   3. 씨 1 세포의 ML / 잘 조직문화는 24 웰 플레이트를 처리.
4. 박테리아의 준비
   이 절차는 폐렴 구균과 S.의 준비에 따라 할 수있다 살리 바리우스. 박테리아의 성장 매체는 일반적으로 (오염 된 경우 일반적으로 흐린 나타납니다) prewarm 및 무균 시험을 밤새 37 ° C 배양기에서 유지된다.
   1. 말 혈액 한천 (HBA) 접시에 분석, 줄무늬 박테리아를 준수하고 35 ~ 37 ° C와 18 ~ 24 시간 동안 5 % CO ₂ 부화하기 전에 두 가지 일. 양 혈액 한천 대안으로 사용될 수있다.
   2. 다음 날, 멸균 30 ML 튜브에 0.5 % 효모 추출물 (THB + YE) 배지로 10 ㎖ 토드 휴이트 국물을 피펫 팅하여 각 종의 박테리아에 대한 야간 문화를 준비합니다. 10 μL 루프를 사용, 약 10 ~ 12도 분리 된 콜로니를 접종. 간단히 소용돌이와 35-37 ° C와 14 ~ 16 시간 동안 5 % CO _2에서 품어. 국물 문화에 너무 오래 방치하면 폐렴 구균이 autolyze 것이라고합니다.
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2 준수 분석 :. 세포 단층 상피 박테리아의 추가

1. 폐렴 구균과 S. 중순 로그인 세균성 문화의 준비 살리 바리우스
   1. 피펫 두 멸균 30 ML 튜브, 하나의 레이블이 폐렴 구균 및 다른 S. 각각에 데워진 THB + YE 10 ㎖ 살리 바리우스.
   2. 중반 로그 단계에 도달하기 위해, 폐렴 구균은 ~ 3 시간 및 S를 필요로 살리 바리우스 (그림 1 참조) ~ 2 시간의 배양이 필요합니다. 동시에 두 문화를 시작합니다. 소용돌이 (3-5 초) 밤새 세균 배양 및 추가 100 μL의 폐렴 구균 및 100 ㎕의 S. 해당 관에 살리 바리우스.
   3. 간단히 소용돌이와 S. 약 2 시간 동안 37 ° C에서 문화를 품다 살리 바리우스와 폐렴 구균에 대한 3 시간.
2. 준수의 분석을위한 CCL-23 세포의 준비
   1. 거꾸로 현미경을 사용하여, confluen의 24 웰 플레이트를 확인건강한 세포의 형태와 T 단층. 단층 세포 응집 또는 준수의 세포 반올림 또는 손실 (그림 2 참조)와 같은 세포 변성 효과의 증거도없이,> 80 % 합류해야한다.
   2. 각이 잘 세포 단일 층을 방해하지 않도록 약간 접시를 기울이기, 전송 피펫을 사용하여 용지를 제거합니다.
   3. 부드럽게 세포를 씻어 각이 잘 혈청 피펫을 사용하여에 ~ 500 ㎕의 예비 가온 PBS를 추가하고 약간 접시를 기울이기, 전송 피펫으로 제거합니다. PBS를 폐기하십시오. 한 번 세척 단계를 반복합니다.
   4. 각 웰에 데워진 MEM + 5 % FBS 500 μl를 추가합니다. 세균 배양을 준비하는 동안 CO ₂ 배양기에 24 웰 플레이트를 돌려줍니다.
      참고 : 감염 (MOI)의 다양성에 대한 정확한 CCL-23 세포 수를 확인하려면, 두 개의 우물 트립신과 감염의 날에 계산 될 수있다.

3. 준수의 분석

1. 폐렴 구균에 추가MOI ~ 10:1 CCL-23 세포. 중복 우물에 표 1에 열거 된 조건을 테스트합니다.
   1. S. 1 ㎖의 ₆₀₀ (OD)의 광학 밀도를 측정 살리 바리우스 문화. OD는 0.3 ~ 0.6 사이 여야합니다.
   2. S. 5 ㎖로 이동 4 분 1,870 XG에 10 ML 튜브와 원심 분리기에 살리 바리우스 문화.
   3. 뜨는을 취소하고 3.1.1 절에서 OD 읽기를 기반으로, S.는 재현 탁 0.85 %의 NaCl (최종 농도 ~ 1.5 ^× 109 CFU / ㎖)의 200 ~ 1000 μL에서 살리 바리우스. 일반적인 지침으로, 0.375의 OD 260 μL에 재현 탁됩니다. S. 1:10과 1:100 희석을 준비 살리 바리우스는 염화나트륨 0.85 %를 사용.
      참고 : 총, S.의 (높은, 중간 및 낮은 복용량을 대표하는) 세 가지 농도 살리 바리우스는 분석에서 테스트됩니다. 높은 투여 량은 10 ~ S.의 비율 살리 바리우스 1 폐렴 구균, 매체 1 ~ S. 살리 바리우스 : 1 폐렴 구균, 그리고 낮은 1 ~ S에게 있습니다. 살리 바리우스 : 10 폐렴 구균.
   4. 인큐베이터에서 24 웰 플레이트를 꺼내.
   5. 헤파린 제어 우물에서 미디어의 40 μl를 제거하고 100 U / ㎖의 최종 농도에 대한 헤파린의 50 μL (1,000 U / ㎖ 주식 농도)를 추가합니다.
   6. CCL-23 세포만을 및 CCL-23 세포와 폐렴 구균 (S. 더 살리 바리우스)를 포함하는 우물을 포함 우물에 0.85 %의 NaCl 10 μl를 추가합니다.
   7. 10 원액의 UL, 1:10 S.의 1:100 추가 각각의 우물에 살리 바리우스.
      참고 : S. 폐렴 구균 (후 첨가) 생균제 투여의 시간의 효과를 조사하는 후 살리 바리우스도 폐렴 구균 (coaddition) 또는 1 시간 등을 동시에 첨가 할 수있다.
   8. 셀 층과 세균의 접촉을 촉진하고, 37 ° C, 5 % CO _2에서 1 시간 동안 배양 3 분 114 XG에 24 – 웰 플레이트를 원심 분리기.
   9. S.의 연속 희석을 수행 중복 HBA에 0.85 %의 NaCl 및 플레이트 살리 바리우스 주식균수에 대한 접시. 첫째, 10 ^-1 희석하기 위해 0.85 %의 NaCl 450 μL에 주식의 50 μl를 추가하고 소용돌이 (5 초) 변경 팁 펄스, 0.85 % NaCl을 450 μL에 10 ^-1 희석의 50 μl를 추가 등 최대 ^{10-7 10-2} 희석을하고 있습니다.
   10. 플레이트 (100) ^10-5의 μL, HBA 플레이트에 중복에 ^10-6 및 ^10-7 희석하고 멸균 스프레더로 확산. 37 ° C, 5 % CO _2에서 하룻밤 반전 HBA의 번호판을 품어.
   11. 1 시간 배양 끝으로, 폐렴 구균에 대한 섹션에게 3.1.1-3.1.3를 반복합니다. 약물 과용이라면서 0.2 ~ 0.7 사이 여야합니다. 아래 폐렴 구균 문화 1 ㎖를 뽑아 ~ 1.5 ^× 108 CFU / ㎖의 농도로 (OD 읽기 기준) 0.85 %의 NaCl 300-2,000 μL에 펠렛을 재현 탁. 일반적인 지침으로, 0.3의 OD 500 μL에 재현 탁됩니다.
   12. S. 1 시간 배양 한 후, 살리 바리우스는 10 μ 추가음수 제어 우물을 제외한 모든 우물에 L 희석 폐렴 구균 (세포를 포함하는 전용).
   13. 3 분 114 XG에 24 – 웰 플레이트를 원심 분리기와 37 ° C, 3 시간 동안 5 % CO _2에서 배양한다. 섹션 3.1.9 및 플레이트 희석 ^10-4, 균수에 대한 중복 HBA 플레이트에 ^10-5 및 ^10-6에 설명 된대로 0.85 %의 NaCl에서 폐렴 구균의 주식을 희석을 수행합니다.
2. 3 시간 후, 단일 층 (그림 2 참조) 건강한 볼 수 있도록 현미경으로 세포를 확인합니다. 물론 각에서 용지를 제거하고 부드럽게 2.2.3 절에 설명 된대로 세포에게 3 회 씻는다. 각 조건에 대해 서로 다른 피펫을 사용하여. 이 단계는 비 접착 성 폐렴 구균을 제거하는 것이 필수적입니다. 단일 층은 세척 과정에서 떨어져 오지한다 이것은 현미경으로 다시 검사하여 확인 될 수있다.

참고 :이 단계에서 제거 미디어 (추가 분석을 위해 -20 ° C에 저장할 수 있습니다 <EM> 예 사이토킨 수준의 측정).

1. 물론 각각 0.1 % 디기 토닌 (부드러운 세제) 200 μl를 추가하고 7 37 ° C에서 최소 5 % CO ₂ 알을 품다.
2. 물론 각 THB 미디어 800 μl를 추가합니다. 필요한 경우, 최대 피펫 아래로, 그리고에 의해를 Lyse 세포는 확실히 세포 단일 층이 완전히 제거되었는지 확인하기 위해 피펫 팁과 우물 3 배를 다 쳤어요. 우물 사이의 팁을 변경합니다.
3. 각이 잘 P1000 피펫을 사용하여 내용을 제거하고 레이블의 미세 튜브에 전송할 수 있습니다.

자기편 폐렴 구균 4. 정량

부착 폐렴 구균은 가능한 수를 결정 (시리얼 희석 혈액 한천에 도금) 또는 정량 실시간 PCR에 의해 정량화 될 수있다.

1. 가능한 계산 방법
   이 방법은 즉시 준수 분석 단계 3.5 이후에 수행해야합니다.
   1. 각 분석 잘 들어, 수집 샘플의 시리얼 희석을 준비0.85 % 염화나트륨, 펄스 소용돌이로 교반 450 μL로 샘플의 50 μl를 추가하고, ^10-6 희석 최대 섹션 3.1.9에 설명 된대로 순차적으로 희석하여 부착 분석의 5 단계.
   2. 100 ^10-3 μL, ^{10-4, 10-5,} 및 플레이트 혈액 한천에 중복에 ^10-6 희석이, 멸균 스프레더로 확산, 37 ° C에서 하룻밤 거꾸로 번호판을 품어, 5 % CO _2. 혼자 CCL-23 세포를 포함하는 우물은 박테리아를 포함 할 수 없습니다 및 도금 될 수 있습니다 깔끔한 (100 ㎕의 원액) 불임으로 제어하는​​ 것을들 수있다.
   3. 다음 날, 준수의 분석의 섹션 3.1.13 준비 (30-300 식민지를 포함하는) 적절한 희석 접시에 식민지를 계산하여 폐렴 구균 접종을 결정합니다. 두 접시에서 평균 값을 사용하여 접종의 CFU / ㎖을 계산합니다. 마찬가지로, S.를 결정 준비된 접시에 식민지를 세어 살리 바리우스의 접종섹션 3.1.10에서.
      주 : 플레이트는 폐렴 구균을 포함해야한다; 다른 종의 존재는 분석이 오염 결과가 유효하지 않은 것을 나타냅니다.
   4. 폐렴 구균 준수 수준을 확인하려면 섹션 4.1.1에서 제조 된 각각의 샘플 (30-300 폐렴 구균 식민지를 포함하는) 적절한 희석 판을 계산합니다. 참고 S. 그림 3과 같이 폐렴 구균이, α-용혈을 평평하고 녹색 때문일 것입니다 반면 살리 바리우스의 식민지, 작고 흰 것입니다., 폐렴 구균 준수를 계산 조건 B에서 부착 폐렴 구균의 수를 정상화. CCL-23 세포는 + 100 %로 폐렴 구균 및 기타 조건에서이 조건에 부착 폐렴 구균을 비교합니다.
2. qPCR의 방법
   준수 분석에서 수집 된 샘플은 3.5 DNA 추출 할 때까지 -20 ° C에 저장할 수 있습니다 단계. DNA 추출은 상용 키트를 사용하여 수행하고 절에서 설명 4.2.1-4.2.9 및 qPCR에 그대로섹션 4.2.10-4.2.20에서 말한다.
   1. 효소 용해 버퍼 (50 mM의 인산염 포함하는 버퍼의 pH 6.7 1 ㎎ / ㎖ 리소자임, 0.075 ㎎ / ㎖ mutanolysin, 2 ㎎ / ㎖ 프로 테 K)을 준비합니다. 다음 조리법 사용될 수있다 (충분히 50 추출 용) 10 ㎖로 만든다. 효소 용해 버퍼 갓 사용하기 전에 준비를해야합니다.
      
      50 mM의 인산염 완충 용액 7.25 ㎖ (pH를 6.7)
      최종 [1 ㎎ / ㎖] 1.00 ㎖를 10 ㎎ / ㎖ 리소자임 주식
      1 mg을 825 ㎖를 / 최종 [0.075 ㎎ / ㎖]에 대한 재고를 mutanolysin 밀리리터
      최종 [2 ㎎ / ㎖] 1.00 ㎖를 20 ㎎ / ㎖ 테 K 주식
      
   2. 얼음 또는 4 ° C에서 샘플을 해동 소용돌이와 라벨의 미세 튜브에 전송 각 시료 100 μL 씩 분주합니다. 다시 -20 ° C 냉동고에 원래의 샘플을 돌려줍니다.
   3. 10 분 동안 6,700 XG에서 샘플을 원심 분리기.
   4. 제거하고 상층 액을 버린다. 펠렛 및 재현 탁하는 소용돌이에 효소 용해 버퍼 200 μl를 추가합니다. Incub30 분 동안 56 ° C에서 샘플을 먹었다. 튜브의 바닥에 액체를 수집하는 6,700 XG에 원심 분리기 짧게 (5 초).
   5. 세포 용해를 완료하고 2 분 동안 실온에서 부드럽게 섞어 20 % SDS의 10 μl를 추가합니다.
   6. 의 RNase A (100 ㎎ / ㎖ 주)의 4 μl를 추가하고 (로커 또는 튜브를 반전) 2 분 동안 실온에서 부드럽게 섞는다.
   7. 200 버퍼 AL ㎕의 (키트)와 15 초 동안 소용돌이를 추가합니다. 10 분 동안 70 ° C에서 샘플을 품어. 튜브의 바닥에 액체를 수집하는 6,700 XG에 원심 분리기 짧게 (5 초).
   8. 15 초 동안 100 %의 EtOH와 소용돌이의 200 μl를 추가합니다. 림없이 습윤 (2 ㎖ 수집 관) 스핀 컬럼 (있는 침전물을 포함한다)의 혼합물을 전송 한 후, 튜브의 아래쪽에 액체를 수집하기 위해 짧게 스핀. 제조 업체의 프로토콜의 따라 세척 단계에 따라 (여기에 표시되지 않음).
   9. , DNA를 용출 레이블의 미세 튜브에 열을 전송하려면, 버퍼 AE의 50 μl를 추가 (FR톰 키트), 2 분 동안 실온에서 품어. 1 분 4,300 XG에 원심 분리기. 100 μL의 최종 용출 볼륨에 대해 한 번 반복합니다. DNA는 사용할 때까지 -20 ° C에 저장할 수 있습니다.
   10. 15 분 전에 시작하는 qPCR에을 수행하려면, UV 빛을 가진 후드를 소독. 각 샘플에 잘 위치를 기록 할 수있는 96 – 웰 플레이트지도 워크 시트를 준비하는 것이 좋습니다.
   11. (참고 균주 ATCC 6305에서 추출) 게놈 폐렴 구균 DNA의 10 NG / μL 주식을 사용하여 표준 곡선을 준비합니다.
       1. 폐렴 구균 재고 DNA를 해동하고 탁상 원심 분리기에 잠깐 (5 초)를 스핀 다운.
       2. 각 희석 사이 팁과 소용돌이로 교반을 변경, 27 μL의 핵산 분해 효소가없는 H ₂ O 3 μL의 DNA를 추가하여 6 prelabeled의 미세 튜브 1:10 연속 희석을 수행합니다. 1, 0.1, 0.01, 0.001, 0.0001, 그리고 0.00001 NG / μL : 최종 희석 시리즈는 6 관으로 구성되어 있습니다.
          참고 : 다음은 최대 1 주일 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
   12. Prepar멸균 PCR 후드에서 멸균 15 ML 원뿔 튜브에 다음과 같이 전자 리타는 mastermix. 얼음 사용하기 직전에 소용돌이의 구성 요소를 녹여. </table> 주 : 일부 실시간 PCR 기계 일부 상업적 mastermixes에 포함되거나 별도로 첨가 될 수있는 참조 염료의 사용을 필요로한다. 이 프로토콜은 96 – 웰 플레이트에 25 μL 반응을 실행하도록 설계되지만 다른 실시간 PCR 기계를 수용하도록 조정될 수있다. 프라이머 및 프로브 시퀀스는 원래 카르발류 등.^(15)에 의해 출판 및 자료의 목록에 표시됩니다.
       리타의 소용돌이와 부하 23 μL / 잘 적절한 우물에 섞는다. 판지도를 참조하십시오.
       샘플 로딩 또한 지역 (별도의 방에서 바람직 살균 캐비닛) 템플릿에 전송 플레이트.
       각 웰에 대한 팁을 변경, 샘플을로드하는 P2 피펫을 사용합니다. 모든 샘플은 이중으로 실행됩니다. 위치 판의지도를 참조하십시오.
       표준 곡선 우물의 경우, 1 μL / 잘 표준 곡선의 DNA 플러스 1 μL의 적절한 희석을 추가 / 잘 H ₂ O 25 μL에 최종 볼륨을 가지고 있습니다.템플릿이없는 컨트롤 우물의 경우, 2 μL의 H _2를 O를 추가
       적절한 우물에 2 μL / 잘 샘플 DNA를 추가합니다.
       사용의 모든 우물을 모자. 확인 모자는 꼭 맞게 닫혀있다. 빠르게 실시간 PCR 기계로 판을로드하기 전에 PCR 플레이트 (5 초) 회전.
       기계 제조업체에서 제공하는 지침에 따라 PCR 기계와 실행의 qPCR에로드 플레이트. 다음 가수 분해 프로브 순환 조건을 권장합니다 :

       구성 요소	반응 당	X 102 (전체 판)
       리타 F	10 μM 주식의 0.25 μL	25.5 μL
       리타 R	10 μM 주식의 0.25 μL	25.5 μL
       리타 프로브	10 μM 주식의 0.5 μL	51 μL
       H 2 O	9.5 ㎕의	969 μL
       마스터 믹스	12.5 μL	1,275 μL
       최종 부피	23 μL	2,346 μL

       1 단계 (1X)	95 ° C에서 3 분
       2 단계 (40 배)	95 ° C에서 20 초
       	60 ° C에서 20 초

   13. 데이터를 수집하고 표준 곡선을 사용하여 폐렴 구균 DNA의 양을. 이전 게놈 DNA의 1 PG는 447.4 세포에 해당하는 것으로 추정, ^17를 설명하고, CFU / ㎖ (가정 O로보고 된 세균 하중 계산네브라스카 CFU 당 게놈, 게놈 당 리타의 사본; 그림 4 참조). 성공적인 분석의 경우, R ² 값이 0.98 ≥해야하며, 표준 곡선의 범위 내의 모든 긍정적 인 결과 (CT가 0.00001 겨에 의한 것 이상 값 / 표준 곡선 점 μL 배경 / 리타가 음수로 간주됩니다).
       참고 : 일부 실시간 PCR 시스템은 표준 곡선을 구성하고 미지수를 계산하는 데 사용할 수있는 분석 소프트웨어와 함께 제공됩니다. 그렇지 않으면, 이러한 계산은 Excel 또는 유사한 프로그램에서 수행 될 수있다. 예를 표준 곡선은도 4에 도시된다.
   14. 폐렴 구균 부착을 계산하기 위해, 조건 B에서 접착 폐렴 구균의 수를 정상화. CCL-23 세포는 + 100 %로 폐렴 구균 및 기타 조건에서이 조건에 부착 폐렴 구균을 비교합니다.

Representative Results

Discussion

이 분석의 중요한 부분은 S.의 적절한 농도를 추가하고 섹션 3.1.7 및 3.1.12에 살리 바리우스와 폐렴 구균. 농도는 OD의 수치를 사용하여 추정되지만 플레이트 다음날 계산 될 때까지 정확한 접종이 결정되지 않습니다. 이러한 이유로, 우리는 중간 로그 위상을 식별하고 OD하여 농도를 추정을 지원하기 위해 분석에서 사용 된 모든 세균 균주에 대해 시간 OD 및 균수 (CFU / ㎖)를 측정하기 위해 성장 곡선을 수행하는 추천한다. 또한, 폐렴 구균 균주는 준수의 특성에 실질적으로 다를 수 있습니다. 좋은 부착 (> 3 시간 배양 후 상피 세포에 부착 접종의 10 %)가 폐렴 구균 부착을 억제하는 프로 바이오 틱의 능력을 조사 분석에 대한 추천과 긴장. 숙련 된 작업자에 의해 실시하는 경우에도 부착 수준은도 5에서 볼 비교적 큰 오차 막대에 의해 입증되는 바와 같이, 분석에 분석을 변화 할 수있다. 들면이러한 이유로 우리는 각각의 분석 조건에 대한 중복 된 우물로, 각 실험에 대한 세 가지 반복의 최소 권장합니다. 유사 가변성은 대장균 ^(18)를 사용하여 부착 분석법에서보고되었다. 이 프로토콜에서는, 세포는 폐렴 구균의 추가 다음 3 시간 동안 배양된다. 접착 시간 코스 실험을 수행하고 박테리아의 대부분은 배양 처음 시간 동안 부착 보여 경우 배양 시간이 단축 될 수있다.

이 프로토콜은 폐렴 구균 준수, qPCR에 실행 가능한 계수를 정량화하는 두 가지 방법을 제시한다. 두 가지 방법 모두 적합하며, 선택은 운전자의 취향 및 사용 가능한 실험실 장비 (실시간 PCR 시스템으로 예를 들어, 액세스)에 따라 달라집니다. 가능한 계산하여 정량화 추가적인 시약 또는 실시간 PCR 기계를 필요로하지 않는 저렴한 방법입니다. 그러나, (12 – 웰 분석 플레이트에 대해 일반적으로 80)는 많은 판을 사용하고 즉시 수행되어야분석의 끝에 LY, 및 폐렴 구균 콜로니를 계수하여 S. 다량 함유 플레이트상에서 어렵 살리 바리우스. qPCR에 의해 정량화 더 고가이고 긴 DNA 추출 단계를 필요로하지만, 샘플은 효율성을 증가 냉동 및 일괄 처리 저장 될 수있다. 추출 된 DNA는 또한 부착 S.의 qPCR의 검출과 같은 다른 목적을 위해 사용될 수있다 살리 바리우스. S.를 조사하는 경우 살리 바리우스의 준수, 그것은 CCL-23 세포 플러스 S.와 우물을 포함하는 것이 좋습니다 살리 바리우스 (폐렴 구균 제외) 및 CCL-23 세포 플러스 S. 웰스 살리 바리우스와 헤파린과 같은 추가 컨트롤.

기본적인 분석은 또한 집락의 다른 과학 양상을 조사하기 위해 적응 될 수있다. 예를 들어, 사이토킨 생성에 대한 프로바이오틱스의 효과는 세포 상등액을 저장하고 시금 의해 평가 될 수있다. 분석은 오히려으로 준수보다 세균의 침입을 조사하기 위해 수정 될 수있다전에 수확 및 용균 세포에 세포 외 박테리아를 죽일 세포막 투과성 항생제로 세포를 배양. 여기에 설명 된 바와 같이, 분석은 부착 및 침입 (내면화) 폐렴 구균 구분하지 않습니다. 그러나, 이전의 연구는 내면화 된 폐렴 구균의 수준 (PMP843 포함) 대부분의 균주에 대해 이렇게 ¹⁰ (일반적으로 접종의 0.01 %를 ≤) 매우 작은 것으로 발견, 세포 관련 폐렴 구균의 대부분은 자기편이 아닌 내장되어 있습니다. 추가 응용 프로그램이 식민지를 억제하는 기능을 위해 다른 프로 바이오 틱 종을 테스트 및 / 또는 관심있는 특정 유전자의 역할을 조사하기 위해 돌연변이 균주를 찾고 있습니다.

이 시험 관내 분석의 명백한 한계는 설립 상피 세포, 면역 세포, 정상 식물, 또는 가능성이 생체 내에서 폐렴 구균의 식민지에 영향을 미치는 다른 요인을 포함하지 않는다는 것입니다. 완전히 여부 프로바이오틱스의 커플을 평가하려면LD는 동물 모델을 이용하여 인간의 임상 실험이 보증됩니다 생체 내 연구에서, 호흡기 병원체 식민을 방지하는 데 유용합니다. 그럼에도 불구하고, 체외 부착 분석법은 폐렴 구균 부착을 억제하는 전위를 가진 프로바이오틱스를 식별하기위한 유용한 스크린 겸해 우선 투여 전략에 대한 정보뿐만 아니라 역학적 연구에 사용할 수있는 실험 모델을 제공을 제공 할 수있다.

Materials

Minimum Essential Media (MEM)	Thermo Fisher Scientific	SH30244.01	 
Fetal Bovine Serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	SH30084.03	 
T-75 Flask	Nunc	156472	 
CCL-23 cells	ATCC	CCL-23	 
Trypsin	Life Technologies	15090046	 
24-well Cell culture plate	Nunc	142475	 
Horse blood agar (HBA) plates	Oxoid	PP2001	Sheep blood agar plates also acceptable
Todd-Hewitt Broth	Oxoid	CM0189	 
Yeast Extract	Beckton Dickinson	212750	 
Digitonin	Sigma-Aldrich	D141-100MG	 
Disposable cuvettes	Kartell	1938	 
Heparin	Pfizer	2112105	comes in sterile ampules at 5,000 IU/5m/ 
Sterile spreader	Technoplas	S10805050	alternatively, a glass spreader can be dipped in 96% ethanol and flame sterilized before each use
Lysozyme	Sigma-Aldrich	L6876	 
Mutanolysin	Sigma-Aldrich	M9901	 
Proteinase K	Qiagen	19133	 
SDS 20% solution	Ambion	AM9820	 
RNase A	Qiagen	19101	 
QIAamp DNA mini-kit (250)	Qiagen	51306	 
LytA F primer	Sigma-Aldrich	Custom made	5' -> 3' sequence ACGCAATCTAGCAGATGAAGCA
LytA R primer	Sigma-Aldrich	Custom made	5' -> 3' sequence  TCGTGCGTTTTAATTCCAGCT
LytA probe	Eurogentec	Custom made	5' -> 3' sequence Cy5-TGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG-BHQ3, alternative fluorophores can be used
Nuclease free water	Ambion	AM9906	 
Brilliant III Ultra Fast QPCR mastermix	Agilent Technologies	600880	 
Thermo-Fast 96 Detection plate 	Thermo Fisher Scientific	AB-1100	 
Ultraclear qPCR cap strips	Thermo Fisher Scientific	AB-0866	 
Mx3005 QPCR System	Agilent Technologies	401449	 
*alternative sources are available for most/all products listed