를 사용하여 폐렴 구균 식민지에서 생균제의 효과를 조사 체외 준수의 분석

요약

체외에서 준수의 분석은 세포 단층 상피하는 등 폐렴 구균 식민지를 억제하기위한 프로 바이오 틱의 사용과 같은 잠재적 인 개입을 조사하기 위해 폐렴 구균의 부착을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

초록

비 인두의 상피에 폐렴 구균 (폐렴 구균)의 준수는 식민지가 발생할 수 있습니다합니다. 체외 준수의 분석이 세포를 상피 폐렴 구균의 부착을 연구하는 데 사용할 수있는 폐렴 및 중이염 등의 폐렴 구균 감염을위한 전제 조건으로 간주됩니다 단층과 같은 프로 바이오 틱의 사용과 같은 잠재적 인 개입을 조사하는 폐렴 구균 식민지을 억제 할 수 있습니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 (때때로 HEP-2 세포로 지칭) 인간 상피 세포주 CCL-23 폐렴 구균의 부착에 생균제 스트렙토 코커스 살리 바리우스의 영향을 조사하기 위해 사용된다. 분석은 세 가지 주요 단계를 포함한다 : 상피 세포와 박테리아 세포의 1) 준비, 세포 단층 상피 박테리아의 2) 또한, 실행 가능한 횟수 (시리얼 희석 도금) 또는 정량 실시간 PCR (qPCR에 의한 부착 폐렴 구균의 3) 검출 ). 이 절반hnique은 비교적 간단하고 조직 문화 설정 이외의 특수 장비를 필요로하지 않습니다. 분석은 다른 생균제 종 및 / 또는 폐렴 구균 군체의 잠재적 억제제를 시험하는데 사용될 수 있고 쉽게 폐렴 구균 부착 및 침윤에 관한 다른 과학 문제를 해결하기 위해 수정 될 수있다.

서론

연쇄상 구균 폐렴 (폐렴 구균)는 폐렴, 중이염, 수막염 등의 감염을 일으킬 수있는 그람 양성 세균이다. 그것은 저소득 국가 어린이 매년 ¹ 5 세 미만 어린이의 약 80 죽음에 책임이있는 질병의 주요 원인입니다. 폐렴 구균은 종종 어린이의 비 인두에서 수행됩니다. 이 식민지는 일반적으로 자각 증상이없는 것으로 간주되어 있지만, 그것은 폐렴 구균 감염을 앞에 인간의 인구 ^2의 박테리아를위한 저수지 역할을한다. 폐렴 구균 결합되는 예방 접종이 효과적으로 백신에 포함 된 혈청 형의 운송을 줄일 수 있습니다. 그러나, 90 폐렴 구균 혈청 형에, 그리고 예방 접종은 백신 혈청 형의 제거가 nonvaccine 혈청 형 ^3에 의한 운송과 질병의 상승 뒤에된다 혈청 형의 교체로 이어질 수 있습니다. 또한, 약간의 위험이 높은 집단에서, 폐렴 구균식민지는 종종 이전에 첫 번째 백신 투여 량 ^4.5의 관리에, 초기 생활에서 발생합니다. 최근, 프로바이오틱스의 사용은 폐렴 식민 ^6,7을 억제하는 추가의 전략으로서 제안되었다. 체외 부착 분석법은 폐렴 구균 부착 ^8,9를 검사하는데 사용되어왔다. 이러한 분석은 폐렴 구균 준수 ^(10)의 프로 바이오 틱 유산균 rhamnosus GG (LGG)의 영향을 조사하기 위해 적용되었다.

LGG 유용한 유산균 이외에, 스트렙토 코커스 살리 바리우스, 구강 공통 상주 인해 잠재적 체외 ^{(11) 내에} 폐렴 구균 및 다른 호흡기 병원체를 억제하는 능력의 정착에 호흡기 대한 잠재적 생균제로서 연구되어왔다 ^{- 13.} 여기에 제시된 프로토콜은 S.의 효과를 조사하기 위해 사용되는 접착 분석을 설명 폐렴 구균 준수에 살리 바리우스 K12인간의 상피 세포 라인 CCL-23. 성장과 준수 속성을 분리 ^10,14 사이에 실질적으로 다를 수있는 분석에 사용하기 전에, 폐렴 구균 균주는 준수의 기능을 평가 하였다. 폐렴 구균과 S.의 성장 곡선 살리 바리우스는 (OD, 그림 1) 광학 밀도 중반 로그 단계 및 추정 농도 (콜로니 형성 단위 또는 CFU / ㎖)을 결정하기 위해 수행되었다. 그것은 각각의 분석에서 사용하기 전에 분리를 위해 가능한 수와 OD로 성장을 검사하는 것이 좋습니다. 이 분석은 표준 조직 배양 시설 및 장비 모든 실험실에서 수행 할 수 있습니다. 이 프로토콜에서, S의 3 회에의 영향 살리 바리우스 이전 S.의 준수에 대한 폐렴 구균의 추가로 1 시간을 관리 폐렴 PMP843, 비 인두 면봉에서 파생 된 혈청 형 19F 캐리지 분리가 검사됩니다. 부착 폐렴 구균을 정량화하는 두 가지 방법이 제시되어 있습니다 억제 혈액 한천에 도금내 가능한 수, DNA 추출 및 qPCR에 ^(15)에 의해 폐렴 구균 리타 유전자의 검출. 기본적인 부착 분석 프로토콜은 쉽게 여러 복용량 또는 프로바이오틱스의 투여 시간을 시험하기 위하여 변형 될 수 있고, 또한 다른 균주 또는 종으로 사용될 수있다.

프로토콜

1. 상피의 제조 및 균체

1. CCL-23 상피 세포의 해동
   1. ~ 30 분 동안 37 ° C의 물 중탕에서 10 % 태아 소 혈청 (FBS)을 함유하는 최소 필수 Prewarm 매체 (MEM).
   2. 사용하기 전에 적어도 10 분 동안 자외선을 조직 배양 승인 생물 안전 캐비닛을 소독하고, 70 % 에탄올로 작업 영역을 닦습니다. 생물 안전 캐비닛에 70 %의 에탄올과 장소 가온 미디어의 병을 닦습니다.
   3. 25 ML 피펫을 사용하여, T-75 플라스크에 미디어의 14 ML을 전송합니다. 세포 (섹션 1.1.4) 해동하는 동안 37 ° C 배양기에서 플라스크를 놓습니다.
   4. ~ 80 %가 해동 될 때까지 37 ° C의 물을 욕조에 적절한 안전주의 사항과 따뜻한을 사용하여 액체 질소 저장에서 CCL-23 세포의 유리 병을 제거합니다.
   5. 생물 안전 캐비닛 섹션 1.1.3에서 제조 된 플라스크를 반환합니다. T에 70 %의 에탄올과 내용을 전송 (1 ㎖)으로 CCL-23 세포의 유리 병의 외부 표면을 닦아P1000 피펫을 사용하여 -75 플라스크.
   6. 37 ° C에서 5 % CO _2, 95 % 상대 습도의 조직 문화 인큐베이터 하룻밤 (16 ~ 20 시간)에 옆에 술병을 품어.
   7. 건강한 형태를 확인하기 위해 현미경으로 세포를 검사 용지를 제거하고 새로운 15 ㎖로 교체, MEM + 10 % FBS를 데워진.
2. CCL-23 상피 세포의 유지
   1. 세포 ~ 80 %의 합류 (1-2 일), 25 ㎖ 피펫을 사용하여 미디어를 제거하고 부드럽게 80-10로 두 번 세포를 세척하여 통과가되면 ㎖를 10 ㎖ 피펫을 사용하여 데워진 인산염 완충 생리 식염수 (PBS).
   2. PBS를 제거하고 멸균 된 0.25 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 1 ㎖ (0.25 % (W / V) 트립신, 0.1 mM의 EDTA)를 추가합니다. 옆에 술병을 돌려, 트립신은 세포의 합류 층을 커버 수 있도록하고, 37 ° C, 5 % CO ₂ 배양기에서 2 ~ 3 분 동안 플라스크를 배양 회전.
   3. 바이오 안전 캐비넷에 플라스크를 반환, 추가 9 ㎖를 위아래로 6 MEM + 10 % FBS, 피펫을 데워진 -8 배 셀을 제거하는 플라스크의 측면 아래로 액체를 배출, 세포를 재현 탁합니다.
   4. 셀 분할 1:15 (1 ㎖ + 14 ML의 MEM + 10 % FBS) 또는 1시 반 (0.5 ㎖ + 14.5 ㎖의 MEM + 10 % FBS)을 초과하는 세포를 폐기하고, 37 ° C, 5 % CO에 플라스크를 반환 ₂ 배양기.
   5. 통로 적어도 두번 부착 분석에서 사용하기 전에 세포. 일반적으로 세포를 3 ~ 4 일은 모든 분할됩니다.
3. CCL-23 상피 세포의 시딩 (일일 사전 분석, 프로토콜 2를 준수합니다)
   1. 데워진 MEM에 재현 탁 섹션 1.2.1-1.2.3에서 설명한 합류 세포 분열 + 5 % FBS (FBS 농도 분석에서 간섭 혈청 성분의 가능성을 줄이기 위해 감소된다.) 세포의 20 μl를 제거하고 트리 판 블루 염색 및 혈구를 사용하여 계산합니다.
   2. 멸균 50 ㎖ 튜브에서 1.5 × ¹⁰⁵ 세포 / ml의 농도로 데워진 MEM + 5 % FBS에서 세포를 희석.
   3. 씨 1 세포의 ML / 잘 조직문화는 24 웰 플레이트를 처리.
4. 박테리아의 준비
   이 절차는 폐렴 구균과 S.의 준비에 따라 할 수있다 살리 바리우스. 박테리아의 성장 매체는 일반적으로 (오염 된 경우 일반적으로 흐린 나타납니다) prewarm 및 무균 시험을 밤새 37 ° C 배양기에서 유지된다.
   1. 말 혈액 한천 (HBA) 접시에 분석, 줄무늬 박테리아를 준수하고 35 ~ 37 ° C와 18 ~ 24 시간 동안 5 % CO ₂ 부화하기 전에 두 가지 일. 양 혈액 한천 대안으로 사용될 수있다.
   2. 다음 날, 멸균 30 ML 튜브에 0.5 % 효모 추출물 (THB + YE) 배지로 10 ㎖ 토드 휴이트 국물을 피펫 팅하여 각 종의 박테리아에 대한 야간 문화를 준비합니다. 10 μL 루프를 사용, 약 10 ~ 12도 분리 된 콜로니를 접종. 간단히 소용돌이와 35-37 ° C와 14 ~ 16 시간 동안 5 % CO _2에서 품어. 국물 문화에 너무 오래 방치하면 폐렴 구균이 autolyze 것이라고합니다.

2 준수 분석 :. 세포 단층 상피 박테리아의 추가

1. 폐렴 구균과 S. 중순 로그인 세균성 문화의 준비 살리 바리우스
   1. 피펫 두 멸균 30 ML 튜브, 하나의 레이블이 폐렴 구균 및 다른 S. 각각에 데워진 THB + YE 10 ㎖ 살리 바리우스.
   2. 중반 로그 단계에 도달하기 위해, 폐렴 구균은 ~ 3 시간 및 S를 필요로 살리 바리우스 (그림 1 참조) ~ 2 시간의 배양이 필요합니다. 동시에 두 문화를 시작합니다. 소용돌이 (3-5 초) 밤새 세균 배양 및 추가 100 μL의 폐렴 구균 및 100 ㎕의 S. 해당 관에 살리 바리우스.
   3. 간단히 소용돌이와 S. 약 2 시간 동안 37 ° C에서 문화를 품다 살리 바리우스와 폐렴 구균에 대한 3 시간.
2. 준수의 분석을위한 CCL-23 세포의 준비
   1. 거꾸로 현미경을 사용하여, confluen의 24 웰 플레이트를 확인건강한 세포의 형태와 T 단층. 단층 세포 응집 또는 준수의 세포 반올림 또는 손실 (그림 2 참조)와 같은 세포 변성 효과의 증거도없이,> 80 % 합류해야한다.
   2. 각이 잘 세포 단일 층을 방해하지 않도록 약간 접시를 기울이기, 전송 피펫을 사용하여 용지를 제거합니다.
   3. 부드럽게 세포를 씻어 각이 잘 혈청 피펫을 사용하여에 ~ 500 ㎕의 예비 가온 PBS를 추가하고 약간 접시를 기울이기, 전송 피펫으로 제거합니다. PBS를 폐기하십시오. 한 번 세척 단계를 반복합니다.
   4. 각 웰에 데워진 MEM + 5 % FBS 500 μl를 추가합니다. 세균 배양을 준비하는 동안 CO ₂ 배양기에 24 웰 플레이트를 돌려줍니다.
      참고 : 감염 (MOI)의 다양성에 대한 정확한 CCL-23 세포 수를 확인하려면, 두 개의 우물 트립신과 감염의 날에 계산 될 수있다.

3. 준수의 분석

1. 폐렴 구균에 추가MOI ~ 10:1 CCL-23 세포. 중복 우물에 표 1에 열거 된 조건을 테스트합니다.
   1. S. 1 ㎖의 ₆₀₀ (OD)의 광학 밀도를 측정 살리 바리우스 문화. OD는 0.3 ~ 0.6 사이 여야합니다.
   2. S. 5 ㎖로 이동 4 분 1,870 XG에 10 ML 튜브와 원심 분리기에 살리 바리우스 문화.
   3. 뜨는을 취소하고 3.1.1 절에서 OD 읽기를 기반으로, S.는 재현 탁 0.85 %의 NaCl (최종 농도 ~ 1.5 ^× 109 CFU / ㎖)의 200 ~ 1000 μL에서 살리 바리우스. 일반적인 지침으로, 0.375의 OD 260 μL에 재현 탁됩니다. S. 1:10과 1:100 희석을 준비 살리 바리우스는 염화나트륨 0.85 %를 사용.
      참고 : 총, S.의 (높은, 중간 및 낮은 복용량을 대표하는) 세 가지 농도 살리 바리우스는 분석에서 테스트됩니다. 높은 투여 량은 10 ~ S.의 비율 살리 바리우스 1 폐렴 구균, 매체 1 ~ S. 살리 바리우스 : 1 폐렴 구균, 그리고 낮은 1 ~ S에게 있습니다. 살리 바리우스 : 10 폐렴 구균.
   4. 인큐베이터에서 24 웰 플레이트를 꺼내.
   5. 헤파린 제어 우물에서 미디어의 40 μl를 제거하고 100 U / ㎖의 최종 농도에 대한 헤파린의 50 μL (1,000 U / ㎖ 주식 농도)를 추가합니다.
   6. CCL-23 세포만을 및 CCL-23 세포와 폐렴 구균 (S. 더 살리 바리우스)를 포함하는 우물을 포함 우물에 0.85 %의 NaCl 10 μl를 추가합니다.
   7. 10 원액의 UL, 1:10 S.의 1:100 추가 각각의 우물에 살리 바리우스.
      참고 : S. 폐렴 구균 (후 첨가) 생균제 투여의 시간의 효과를 조사하는 후 살리 바리우스도 폐렴 구균 (coaddition) 또는 1 시간 등을 동시에 첨가 할 수있다.
   8. 셀 층과 세균의 접촉을 촉진하고, 37 ° C, 5 % CO _2에서 1 시간 동안 배양 3 분 114 XG에 24 - 웰 플레이트를 원심 분리기.
   9. S.의 연속 희석을 수행 중복 HBA에 0.85 %의 NaCl 및 플레이트 살리 바리우스 주식균수에 대한 접시. 첫째, 10 ^-1 희석하기 위해 0.85 %의 NaCl 450 μL에 주식의 50 μl를 추가하고 소용돌이 (5 초) 변경 팁 펄스, 0.85 % NaCl을 450 μL에 10 ^-1 희석의 50 μl를 추가 등 최대 ^{10-7 10-2} 희석을하고 있습니다.
   10. 플레이트 (100) ^10-5의 μL, HBA 플레이트에 중복에 ^10-6 및 ^10-7 희석하고 멸균 스프레더로 확산. 37 ° C, 5 % CO _2에서 하룻밤 반전 HBA의 번호판을 품어.
   11. 1 시간 배양 끝으로, 폐렴 구균에 대한 섹션에게 3.1.1-3.1.3를 반복합니다. 약물 과용이라면서 0.2 ~ 0.7 사이 여야합니다. 아래 폐렴 구균 문화 1 ㎖를 뽑아 ~ 1.5 ^× 108 CFU / ㎖의 농도로 (OD 읽기 기준) 0.85 %의 NaCl 300-2,000 μL에 펠렛을 재현 탁. 일반적인 지침으로, 0.3의 OD 500 μL에 재현 탁됩니다.
   12. S. 1 시간 배양 한 후, 살리 바리우스는 10 μ 추가음수 제어 우물을 제외한 모든 우물에 L 희석 폐렴 구균 (세포를 포함하는 전용).
   13. 3 분 114 XG에 24 - 웰 플레이트를 원심 분리기와 37 ° C, 3 시간 동안 5 % CO _2에서 배양한다. 섹션 3.1.9 및 플레이트 희석 ^10-4, 균수에 대한 중복 HBA 플레이트에 ^10-5 및 ^10-6에 설명 된대로 0.85 %의 NaCl에서 폐렴 구균의 주식을 희석을 수행합니다.
2. 3 시간 후, 단일 층 (그림 2 참조) 건강한 볼 수 있도록 현미경으로 세포를 확인합니다. 물론 각에서 용지를 제거하고 부드럽게 2.2.3 절에 설명 된대로 세포에게 3 회 씻는다. 각 조건에 대해 서로 다른 피펫을 사용하여. 이 단계는 비 접착 성 폐렴 구균을 제거하는 것이 필수적입니다. 단일 층은 세척 과정에서 떨어져 오지한다 이것은 현미경으로 다시 검사하여 확인 될 수있다.

참고 :이 단계에서 제거 미디어 (추가 분석을 위해 -20 ° C에 저장할 수 있습니다 예 사이토킨 수준의 측정).

1. 물론 각각 0.1 % 디기 토닌 (부드러운 세제) 200 μl를 추가하고 7 37 ° C에서 최소 5 % CO ₂ 알을 품다.
2. 물론 각 THB 미디어 800 μl를 추가합니다. 필요한 경우, 최대 피펫 아래로, 그리고에 의해를 Lyse 세포는 확실히 세포 단일 층이 완전히 제거되었는지 확인하기 위해 피펫 팁과 우물 3 배를 다 쳤어요. 우물 사이의 팁을 변경합니다.
3. 각이 잘 P1000 피펫을 사용하여 내용을 제거하고 레이블의 미세 튜브에 전송할 수 있습니다.

자기편 폐렴 구균 4. 정량

부착 폐렴 구균은 가능한 수를 결정 (시리얼 희석 혈액 한천에 도금) 또는 정량 실시간 PCR에 의해 정량화 될 수있다.

1. 가능한 계산 방법
   이 방법은 즉시 준수 분석 단계 3.5 이후에 수행해야합니다.
   1. 각 분석 잘 들어, 수집 샘플의 시리얼 희석을 준비0.85 % 염화나트륨, 펄스 소용돌이로 교반 450 μL로 샘플의 50 μl를 추가하고, ^10-6 희석 최대 섹션 3.1.9에 설명 된대로 순차적으로 희석하여 부착 분석의 5 단계.
   2. 100 ^10-3 μL, ^{10-4, 10-5,} 및 플레이트 혈액 한천에 중복에 ^10-6 희석이, 멸균 스프레더로 확산, 37 ° C에서 하룻밤 거꾸로 번호판을 품어, 5 % CO _2. 혼자 CCL-23 세포를 포함하는 우물은 박테리아를 포함 할 수 없습니다 및 도금 될 수 있습니다 깔끔한 (100 ㎕의 원액) 불임으로 제어하는​​ 것을들 수있다.
   3. 다음 날, 준수의 분석의 섹션 3.1.13 준비 (30-300 식민지를 포함하는) 적절한 희석 접시에 식민지를 계산하여 폐렴 구균 접종을 결정합니다. 두 접시에서 평균 값을 사용하여 접종의 CFU / ㎖을 계산합니다. 마찬가지로, S.를 결정 준비된 접시에 식민지를 세어 살리 바리우스의 접종섹션 3.1.10에서.
      주 : 플레이트는 폐렴 구균을 포함해야한다; 다른 종의 존재는 분석이 오염 결과가 유효하지 않은 것을 나타냅니다.
   4. 폐렴 구균 준수 수준을 확인하려면 섹션 4.1.1에서 제조 된 각각의 샘플 (30-300 폐렴 구균 식민지를 포함하는) 적절한 희석 판을 계산합니다. 참고 S. 그림 3과 같이 폐렴 구균이, α-용혈을 평평하고 녹색 때문일 것입니다 반면 살리 바리우스의 식민지, 작고 흰 것입니다., 폐렴 구균 준수를 계산 조건 B에서 부착 폐렴 구균의 수를 정상화. CCL-23 세포는 + 100 %로 폐렴 구균 및 기타 조건에서이 조건에 부착 폐렴 구균을 비교합니다.
2. qPCR의 방법
   준수 분석에서 수집 된 샘플은 3.5 DNA 추출 할 때까지 -20 ° C에 저장할 수 있습니다 단계. DNA 추출은 상용 키트를 사용하여 수행하고 절에서 설명 4.2.1-4.2.9 및 qPCR에 그대로섹션 4.2.10-4.2.20에서 말한다.
   1. 효소 용해 버퍼 (50 mM의 인산염 포함하는 버퍼의 pH 6.7 1 ㎎ / ㎖ 리소자임, 0.075 ㎎ / ㎖ mutanolysin, 2 ㎎ / ㎖ 프로 테 K)을 준비합니다. 다음 조리법 사용될 수있다 (충분히 50 추출 용) 10 ㎖로 만든다. 효소 용해 버퍼 갓 사용하기 전에 준비를해야합니다.
      
      50 mM의 인산염 완충 용액 7.25 ㎖ (pH를 6.7)
      최종 [1 ㎎ / ㎖] 1.00 ㎖를 10 ㎎ / ㎖ 리소자임 주식
      1 mg을 825 ㎖를 / 최종 [0.075 ㎎ / ㎖]에 대한 재고를 mutanolysin 밀리리터
      최종 [2 ㎎ / ㎖] 1.00 ㎖를 20 ㎎ / ㎖ 테 K 주식
      
   2. 얼음 또는 4 ° C에서 샘플을 해동 소용돌이와 라벨의 미세 튜브에 전송 각 시료 100 μL 씩 분주합니다. 다시 -20 ° C 냉동고에 원래의 샘플을 돌려줍니다.
   3. 10 분 동안 6,700 XG에서 샘플을 원심 분리기.
   4. 제거하고 상층 액을 버린다. 펠렛 및 재현 탁하는 소용돌이에 효소 용해 버퍼 200 μl를 추가합니다. Incub30 분 동안 56 ° C에서 샘플을 먹었다. 튜브의 바닥에 액체를 수집하는 6,700 XG에 원심 분리기 짧게 (5 초).
   5. 세포 용해를 완료하고 2 분 동안 실온에서 부드럽게 섞어 20 % SDS의 10 μl를 추가합니다.
   6. 의 RNase A (100 ㎎ / ㎖ 주)의 4 μl를 추가하고 (로커 또는 튜브를 반전) 2 분 동안 실온에서 부드럽게 섞는다.
   7. 200 버퍼 AL ㎕의 (키트)와 15 초 동안 소용돌이를 추가합니다. 10 분 동안 70 ° C에서 샘플을 품어. 튜브의 바닥에 액체를 수집하는 6,700 XG에 원심 분리기 짧게 (5 초).
   8. 15 초 동안 100 %의 EtOH와 소용돌이의 200 μl를 추가합니다. 림없이 습윤 (2 ㎖ 수집 관) 스핀 컬럼 (있는 침전물을 포함한다)의 혼합물을 전송 한 후, 튜브의 아래쪽에 액체를 수집하기 위해 짧게 스핀. 제조 업체의 프로토콜의 따라 세척 단계에 따라 (여기에 표시되지 않음).
   9. , DNA를 용출 레이블의 미세 튜브에 열을 전송하려면, 버퍼 AE의 50 μl를 추가 (FR톰 키트), 2 분 동안 실온에서 품어. 1 분 4,300 XG에 원심 분리기. 100 μL의 최종 용출 볼륨에 대해 한 번 반복합니다. DNA는 사용할 때까지 -20 ° C에 저장할 수 있습니다.
   10. 15 분 전에 시작하는 qPCR에을 수행하려면, UV 빛을 가진 후드를 소독. 각 샘플에 잘 위치를 기록 할 수있는 96 - 웰 플레이트지도 워크 시트를 준비하는 것이 좋습니다.
   11. (참고 균주 ATCC 6305에서 추출) 게놈 폐렴 구균 DNA의 10 NG / μL 주식을 사용하여 표준 곡선을 준비합니다.
       1. 폐렴 구균 재고 DNA를 해동하고 탁상 원심 분리기에 잠깐 (5 초)를 스핀 다운.
       2. 각 희석 사이 팁과 소용돌이로 교반을 변경, 27 μL의 핵산 분해 효소가없는 H ₂ O 3 μL의 DNA를 추가하여 6 prelabeled의 미세 튜브 1:10 연속 희석을 수행합니다. 1, 0.1, 0.01, 0.001, 0.0001, 그리고 0.00001 NG / μL : 최종 희석 시리즈는 6 관으로 구성되어 있습니다.
          참고 : 다음은 최대 1 주일 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
   12. Prepar멸균 PCR 후드에서 멸균 15 ML 원뿔 튜브에 다음과 같이 전자 리타는 mastermix. 얼음 사용하기 직전에 소용돌이의 구성 요소를 녹여.

       구성 요소	반응 당	X 102 (전체 판)
       리타 F	10 μM 주식의 0.25 μL	25.5 μL
       리타 R	10 μM 주식의 0.25 μL	25.5 μL
       리타 프로브	10 μM 주식의 0.5 μL	51 μL
       H 2 O	9.5 ㎕의	969 μL
       마스터 믹스	12.5 μL	1,275 μL
       최종 부피	23 μL	2,346 μL

       주 : 일부 실시간 PCR 기계 일부 상업적 mastermixes에 포함되거나 별도로 첨가 될 수있는 참조 염료의 사용을 필요로한다. 이 프로토콜은 96 - 웰 플레이트에 25 μL 반응을 실행하도록 설계되지만 다른 실시간 PCR 기계를 수용하도록 조정될 수있다. 프라이머 및 프로브 시퀀스는 원래 카르발류 등. ^(15)에 의해 출판 및 자료의 목록에 표시됩니다.
   13. 리타의 소용돌이와 부하 23 μL / 잘 적절한 우물에 섞는다. 판지도를 참조하십시오.
   14. 샘플 로딩 또한 지역 (별도의 방에서 바람직 살균 캐비닛) 템플릿에 전송 플레이트.
   15. 각 웰에 대한 팁을 변경, 샘플을로드하는 P2 피펫을 사용합니다. 모든 샘플은 이중으로 실행됩니다. 위치 판의지도를 참조하십시오.
   16. 표준 곡선 우물의 경우, 1 μL / 잘 표준 곡선의 DNA 플러스 1 μL의 적절한 희석을 추가 / 잘 H ₂ O 25 μL에 최종 볼륨을 가지고 있습니다.템플릿이없는 컨트롤 우물의 경우, 2 μL의 H _2를 O를 추가
   17. 적절한 우물에 2 μL / 잘 샘플 DNA를 추가합니다.
   18. 사용의 모든 우물을 모자. 확인 모자는 꼭 맞게 닫혀있다. 빠르게 실시간 PCR 기계로 판을로드하기 전에 PCR 플레이트 (5 초) 회전.
   19. 기계 제조업체에서 제공하는 지침에 따라 PCR 기계와 실행의 qPCR에로드 플레이트. 다음 가수 분해 프로브 순환 조건을 권장합니다 :

       1 단계 (1X)	95 ° C에서 3 분
       2 단계 (40 배)	95 ° C에서 20 초
       	60 ° C에서 20 초

   20. 데이터를 수집하고 표준 곡선을 사용하여 폐렴 구균 DNA의 양을. 이전 게놈 DNA의 1 PG는 447.4 세포에 해당하는 것으로 추정, ^17를 설명하고, CFU / ㎖ (가정 O로보고 된 세균 하중 계산네브라스카 CFU 당 게놈, 게놈 당 리타의 사본; 그림 4 참조). 성공적인 분석의 경우, R ² 값이 0.98 ≥해야하며, 표준 곡선의 범위 내의 모든 긍정적 인 결과 (CT가 0.00001 겨에 의한 것 이상 값 / 표준 곡선 점 μL 배경 / 리타가 음수로 간주됩니다).
       참고 : 일부 실시간 PCR 시스템은 표준 곡선을 구성하고 미지수를 계산하는 데 사용할 수있는 분석 소프트웨어와 함께 제공됩니다. 그렇지 않으면, 이러한 계산은 Excel 또는 유사한 프로그램에서 수행 될 수있다. 예를 표준 곡선은도 4에 도시된다.
   21. 폐렴 구균 부착을 계산하기 위해, 조건 B에서 접착 폐렴 구균의 수를 정상화. CCL-23 세포는 + 100 %로 폐렴 구균 및 기타 조건에서이 조건에 부착 폐렴 구균을 비교합니다.

결과

대표적인 실험의 결과가되는 폐렴 구균에 (S. pneumoniae에 PMP843, 정착 19F 분리)를 1 시간 S의 첨가 후 CCL-23 세포에 추가 된 살리 바리우스, 및 폐렴 구균 부착이 가능한 횟수 및 리타 qPCR의 양에 의해 정량화되었다 표 2에 나타낸다. 결과 개수로 표준화 박테리아의 절대 수 (CFU / ㎖로 표시) 및 % 부착, 모두이 방법 간의 일치했다 혼자 폐렴 구균을 포함하는 우물의 부착 폐렴 구균. 이 폐렴 구균 부착을 억제하는 것으로 알려져 있으므로 폐렴 구균 + 헤파린 상태에서 감소가 부착 (일반적으로 <40 % 형 폐렴 구균에 비해). S.에게 성공적인 분석 나타내는 바와 같이 헤파린은 대조군으로 사용 표 2, S.의 고농도 같이 살리 바리우스는 용량 의존적 방식으로 폐렴 구균 부착을 억제 살리 바리우스 (...

토론

이 분석의 중요한 부분은 S.의 적절한 농도를 추가하고 섹션 3.1.7 및 3.1.12에 살리 바리우스와 폐렴 구균. 농도는 OD의 수치를 사용하여 추정되지만 플레이트 다음날 계산 될 때까지 정확한 접종이 결정되지 않습니다. 이러한 이유로, 우리는 중간 로그 위상을 식별하고 OD하여 농도를 추정을 지원하기 위해 분석에서 사용 된 모든 세균 균주에 대해 시간 OD 및 균수 (CFU / ㎖)를 측정하기 위해 성장 곡선을 수행하는 추천한다. 또한, 폐렴 구균 균주는 준수의 특성에 실질적으로 다를 수 있습니다. 좋은 부착 (> 3 시간 배양 후 상피 세포에 부착 접종의 10 %)가 폐렴 구균 부착을 억제하는 프로 바이오 틱의 능력을 조사 분석에 대한 추천과 긴장. 숙련 된 작업자에 의해 실시하는 경우에도 부착 수준은도 5에서 볼 비교적 큰 오차 막대에 의해 입증되는 바와 같이, 분석에 분석을 변화 할 수있다. 들면이러한 이유로 우리는 각각의 분석 조건에 대한 중복 된...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
최소 필수 매체(MEM)	Thermo Fisher Scientific	SH30244.01
소 태아 혈청 (FBS)	Thermo Fisher Scientific	SH30084.03
T-75 플라스크	눅크	156472
CCL-23 셀	ATCC	CCL-23
트립신	생명 기술	15090046
24웰 세포 배양 플레이트	Nunc	142475
말 혈액 한천 (HBA) 플레이트	Oxoid	PP2001	양 혈액 한천 플레이트도 허용
Todd-Hewitt Broth	Oxoid	CM0189
효모 추출물	Beckton Dickinson	212750
디지토닌	시그마-알드리치	D141-100MG&	nbsp;
일회용 큐벳	Kartell	1938
헤파린	화이자	2112105	5,000 IU/5m/ 의 멸균 앰플에 들어 있습니다.
멸균 스프레더	Technoplas	S10805050	대안적으로, 유리 스프레더는 96% 에탄올에 담그고 화염 멸균
매번 Lysozyme	Sigma-Aldrich	L6876	을
무탄올리신	시그마-알드리치	M9901
단백질분해효소 K	Qiagen	19133
SDS 20% 솔루션	Ambion	AM9820
RNase A	키아겐	19101
QIAamp DNA 미니 키트 (250)	Qiagen	51306
LytA F 프라이머	Sigma-Aldrich	맞춤 제작	5' -> 3' 시퀀스 ACGCAATCTAGCAGATGAAGCA
LytA R 프라이머	Sigma-Aldrich	맞춤 제작	5' -> 3' 시퀀스  TCGTGCGTTTTTTAATTCCAGCT
LytA 프로브	Eurogentec	맞춤 제작	5' -> 3' 시퀀스 Cy5-TGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG-BHQ3, 대체 형광체를 사용할 수 있습니다
Nuclease free water	Ambion	AM9906
Brilliant III 초고속 QPCR 마스터믹스	Agilent Technologies	600880
Thermo-Fast 96 감지 플레이트	써모 피셔 사이언티픽	AB-1100
Ultraclear qPCR 캡 스트립	Thermo Fisher Scientific	AB-0866
Mx3005 QPCR 시스템	애질런트 기술	401449
*대체로 나열된