wormsorter 형광 기자의 표현에 따라 웜을 정렬하여 예쁜 꼬마 선충의 유전자 화면을 용이하게한다. 여기에서, 우리는 새로운 사용 설명 : GFP - 표현 병원체에 의한 식민지에 따라 정렬을, 우리는 면역 반응을 시작하기에 병원체의 인식의 불완전하게 이해 역할을 조사하기 위해 그것을 사용합니다.
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이 논문에서
요약
초록
wormsorter이 예쁜 꼬마 선충의 연구에 사용되는 FACS 기계와 유사한 악기, 일반적으로 형광 기자의 식을 기반으로 웜을 정렬합니다. 여기에서, 우리는 GFP - 표현 병원체에 의한 식민지 자신의 정도에 따라 벌레를 정렬,이 악기의 다른 사용을 강조 표시합니다. 이 새로운 사용은 우리가 웜 소장과 면역 반응의 유도의 식민지 사이의 관계를 해결 할 수있었습니다. 동안 C. 다른 병원균에 elegans의 면역 반응은이를 시작 무엇 여전히 알 수없는, 문서화되었습니다. (상호 배타적이지) 두 가지 가능성이 병원체 - 관련 분자 패턴을 인식, 감염에 의한 손상을 감지합니다. 두 가지 가능성을 구분하기 위해 병원체에 노출이 원인이되는 손상으로부터 해리해야합니다. 그램-N 광범위 - 식민지가 된 웜의 wormsorter 활성화 분리식민지 유사하게 노출 된 웜 가능성이 병원균 부하로 인한 손상,, 그러나, 또는 가장자리와를 egative 병원체 녹농균,. 이러한 구별 인구 병원체로드 전사 및 면역 반응의 유도와의 관계를 평가하기 위해 사용되었다. 결과는 두 가지가 병원체 인식의 가능성을 지원 해리되도록 제안한다.
서론
자동 웜 정렬은,이 튜브에 곧게 통과 (일반적으로 기자 단백질의 유전자 발현에 의해 제공) 웜에 형광 신호를 측정하여 운영 리디렉션으로 Collection 튜브 /도 또는 폐기물 용기에 따라 수 많은 FACS처럼 연구원 1로 설정 매개 변수를 게이팅. wormsorter은 여러 가지 방법으로 연구를 촉진 할 수있다; 분석 도구로서 채용하는 예는 거의 1000 유전자 2 프로모터 활성의 시공간적 패턴을 따라 연구이다.
그러나 wormsorter의 주요 용도는 표적 유전자의 발현 수준 또는 웜 3-5의 축을 따라 형광 단백질의 지역화 다음, 유전 화면이다.
여기에서, 우리는 찬란 태그 병원체에 의해 웜의 식민지 다음의, wormsorter에 대한 새로운 응용 프로그램을 설명합니다. 이와 함께 도구로 우리는 pathog 사이의 관계에 초점을 맞춘식민지 / 부하와 면역 반응 도중에 웜에 면역 반응의 개시를 담당하는 메커니즘에 새로운 통찰력을 얻을 수 있습니다.
현재까지 연구의 거의 모든 생물에서, 미생물 병원체에 타고난 면역 반응의 시작은 병원체 - 관련 분자 패턴 (PAMPS)의 인식에 따라, 및 / 또는 위험 ....
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프로토콜
1. 젊은 성인 동물의 동기화 문화를 얻기
- OP50-1 E. 시드 여러 NGM 플레이트에 벌레를 성장 대장균 박테리아는 (10 배는 포화 문화 집중) 많은 벌레가 임신하는 단계에 도달 할 때까지.
- 동기화 문화 (계란)을 획득 달걀 준비 솔루션으로 임신하는 동물을 처리합니다.
- 여러 60 mm NGM 플레이트에 플레이트 계란은 대략 150 ~ 200 계란 / 판의 밀도로 10 배 농축 OP50-1 시드.
- (- 젊은 성인 단계 웜 L4에 도달 할 때까지) 2 일 동안 25 ° C에서 접시를 품어.
2. 녹농균 플레이트를 준비 및 웜 감염
- 달걀 준비 (단계 1.1)의 날에 100 μg / ML의 최종 농도에서 왕의 B 미디어 포함 리팜피신 2 ㎖로 PA14 :: GFP 문화를 접종. 교반 O / N과 37 ° C에서 문화를 품다
- PA14 :: GFP 막 플레이트분석에 필요한만큼 천천히 죽이는 판 (SKP)에 진짜야. 각 150mm SKP 페트리 접시 피펫에 75 ~ 100 포화 문화의 μL 및 멸균 유리 스프레더를 사용하여 균일하게 확산. 20 ~ 24 시간 동안 37 ° C에서....
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결과
나이와 일치하는 경우, 유 전적으로 동일한 C. 엘레은 P.에 노출되어 녹농균은 넓은 분포는 식민지 (그림 1A)의 수준에서 관찰된다. 식민지 웜 noncolonized의 효율적인 분리 (그림 1B) 달성 할 수있다 여기에 설명 된 프로토콜의 도움으로. noncolonized 웜과는 달리, 식민지 웜은 부진 감소 배변 19과 같은 손상의 징후를 보여줍니다. 후자는 벌레가 P. 식민지 이유가 될 수있다 aeruginosa에 어려움이 감염을 삭제있다. 이 noncolonized로 분류 벌레가 이전에 정착되지 않은 것을 제안 설명 된 프로토콜에 대한 직접적인 영향을 미칠 수있다. 바로이 주장이 올바른지 여부를 테스트하기 위해, 손으로 수확 식민지 웜은 정렬 실험에서와 유사한 세척 단계를 실시하고 그 후 형광 현미경으로 관찰 하였다; 만 56분의 4는 병원체를 삭제. 따라서 가능성 번째입니다.......
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토론
우리가 설명하는 방법은 웜과 그 환경 사이의 상호 작용을 수행하기 위해, 웜 외부 기관의 형광 라벨을 활용합니다. 우리는 선물의 경우, 분리는 병원체의 라벨을 기준으로 한없이 (또는 빛) 부하를 가진 사람에서 무거운 병원체 부하 별도의 웜을 사용 하였다. 이후 유전자 발현 분석은이 병원균 부하 독립적 이었다는 것을 건의하는 두 그룹 사이의 면역 반응에 차이를 찾을 수 없습니다. 반응을 개시 신호가 물리적으로이 신호가 PAMP 될 수 있다는 것을 제안 아니라 분비되지 않고, 세균과 연관된 것으로 밖에 도시 하였다. 함께,이 결과는 PAMP 인식 C.에서 면역 반응을 개시하는 역할을 가설을지지 엘레 19.
상기 선별 프로토콜의 하나의 장점은 모두 정착 및 noncolonized 웜은 단일 모집단으로부터 격리되어있다. 일이다 noncolonized 대 식민지가되는 동물의 최적 분포와 인구를 가진에 따라 달라집니다. 우리는 발견 그.......
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공개 사항
저자는 공개 아무것도 없어.
감사의 글
저자는 그들의 지원을 위해 엘리슨 의료 재단 감사합니다. 우리는 wormsorter을 사용하여에 대한 지원은 애비 Dernburg 실험실의 구성원을 감사하는 것이 좋겠다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 준비한 | M9 버퍼 | wormbook.org | |
| Rifampicin | Sigma | R3501 | |
| 준비한 | 계란 준비 용액 | 물 50ml; 표백제 40ml; 집에서 | |
| 준비 | NGM 플레이트 | ||
| 준비한 wormbook.org SKP 플레이트에서 레시피NGM과 동일한 레시피: 0.25% 대신 0.35% 펩톤, | |||
| 제어 테스트 입자 | Union Biometrica | 310-5071-001 |
참고문헌
- Pulak, R. Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system. Methods Mol. Biol. , 275-286 (2006).
- Dupuy, D., et al. Genome-scale analysis of in vivo spatiotemporal promoteractivity i....
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재인쇄 및 허가
