일차원 국한 미세 환경에서 세포의 자발적인 이동을 연구하는 정량적 방법이 설명된다. 이 방법은 미세 채널을 활용하고 번의 실험에서 서로 다른 조건 하에서 세포의 다수의 이동을 연구하기 위해 이용 될 수있다.
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이 논문에서
요약
초록
여기에 설명 된 방법은 하나의 차원에 감금에서 세포 이동의 연구를 할 수 있습니다. 그것은 물리적 제약에 의해 세포에 편광 표현형을 부과 미세 채널의 사용에 기초한다. 앞으로 또는 뒤로 이동 : 내부 채널되면, 세포는 두 가지 가능성이있다. 방향성이 제한되어있는이 지연 마이그레이션 세포의 자동 추적 및 세포의 움직임을 설명하기 위해 정량적 파라미터의 추출을 용이하게한다. 이러한 매개 변수는 이동 중에 휴대 속도, 방향 변경 및 일시 정지 (가) 있습니다. 마이크로 채널은 형광 마커의 사용과 호환이 가능하며 높은 해상도의 세포 이동하는 동안 세포 내 소기관과 구조의 현지화를 연구하는 것이 적합하다. 마지막으로, 채널의 표면은 채널 또는 haptotaxis의 연구의 접착 특성의 조절을 허용하는 다른 기판으로 작용 될 수있다. 요약하면, 시스템 H설명 감수는 독립적 인 실험의 정규화 및 재현성을 용이 기하학과 환경의 생화학 적 성질 양쪽이 제어 된 상태에서 대 세포 수의 마이그레이션을 분석하기위한 것이다.
서론
마이그레이션 개발, 면역 반응 및 조직 재생 등의 다세포 생물의 많은 생리적 과정에 대한 중요한 복잡한 세포 기능입니다. 또, 종양의 침윤과 전이 같은 특정한 병리학 적 상황은 세포 운동성 하나에 의존한다. 이러한 이유로, 세포의 이동은 기본 및 번역 두 연구의 맥락에서 연구의 주요 분야가되고있다. 생체 내 대부분의 조직이 풍부한 세포 외 기질 (extracellular matrix)과 높은 세포 밀도를 특징으로하고 있습니다. 세포의 이동, 따라서 생리적 인 조건 하에서, 복잡한 제한 환경에서 발생합니다. 고전적으로, 가장으로 인해 역사적인 이유와 기술적 한계와 가능성, 세포의 이동은 제한 등의 조직에서 발견되는 환경의 여러 속성을 복제하지 않는 평면 2D 시스템에서 연구되고있다. 또한, 2 차원 운동에 필수적인 세포 부착과 같은 요인은 최근 necessa하지에 보여 주었다되었습니다RILY 2D와 다른 환경에서 세포의 운동을 지배하는 메커니즘이 2 별개 것을 제안, 생체 내에서 또는 젤 내부의 마이그레이션이 필요합니다. 몇몇 시스템은 세포 외 매트릭스 조성물 (3)의 특성을 recapitulating 목표 조직, 가장 유명한 존재 콜라겐 겔의 복잡한 특성을 모방하기 위해 개발되었다. 여기에서 우리는 ....
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프로토콜
중요 사항 :이 프로토콜은 원하는 마이크로의 형태를 포함하는 형이 이미 만들어진 것으로 가정합니다. 금형의 준비에 대한 자세한 정보가 이미 10을 발표했습니다. 이 프로토콜은 또한 골수 DC의 문화를 알고 있다고 가정합니다.
1. 칩 제조
- 플라스틱 컵의 중량비 10:1 PDMS 오일 및 경화제를 혼합한다. 철저하게 두 화합물을 혼합.
- 금형 베어링 마이크로에 믹스를 캐스팅합니다. 총 높이가 0.5 cm 사이 여야합니다.
- 1 시간 동안 진공 항아리 종에 공기 방울을 제거합니다.
- 65 ℃에서 2 시간 동안 오븐에서 후자를 배치하여 금형 강화 PDMS
- PDMS는 실온에서되면, 수술 칼날 구조의 주위에 큰 조각을 잘라 금형 (그림 1A)에서 벗긴다.
- 세포가 주입 할 구멍 (일반적으로 2mm)를 드릴 PDMS에게 크기를 조정마이그레이션 (그림 1B)를 평가한다있는 유리 바닥 요리에 크기에 맞게 수술 블레이드. 계속 진행하기 전에 용지를 청소 렌즈를 사용하여 요리에서 잔여 먼지를 제거합니다. 이 단계 1.10에 설명 된 유리에 PD....
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결과
각 실험에서 PDMS의 표면이 연구의 관심에 적응 분자로 코팅된다. 전에 (단계 2.4)으로 세척 한 후에 형광 분자, PLL-g-PEG로 코팅이 방송 채널 도표. 이러한 실험은 채널의 코팅의 균일 성을 제어 할 수 있습니다.
셀 로딩 후, 비디오 현미경은 세포 이동을 따라 수행 될 수있다.도 3a는 DC가 세포를 추적하기 위해 적절한 밀도로 마이크로 채널 마이그레이션의 일례를 나타낸다. , 위상차 및 훽스트 염색 모두 (설명 참조) 이러한 목적을 위해 사용될 수있다. 기술은 또한 더 높은 해상도에서 형광 공 초점 현미경과 호환 가능하며,.도 4b는 LifeActGFP 발현 수지상 마이그레이션 중합 액틴의 동적의 예를 도시 소기관 또는 셀룰러 구조를 추적하는 데 사용될 수있다.
세포의 정량의 예이주의 DC.......
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토론
여기에서 우리는 하나의 실험에서 세포의 많은 수의 철새 특성을 연구하기위한 방법으로 마이크로 구성 장치에 대해 설명합니다. 이 실험 시스템은 내생 철새 세포 조직에서 발견되는 좁은 환경의 제약을 모방. 그러나, 하나의 차원에서 이주를 강요함으로써, 자동 세포 추적 및 measurables의 추출 (그림 5)을 용이하게한다. 우리는 또한 우리의 장치는 형광 현미경과 호환되며, 따라서 세포 운동성의 다른 단계 (그림 4) 동안 세포 기관의 위치를 공부하기에 적합 할 수 있음을 보여준다.
프로토콜 내에서 중요한 단계는 채널의 품질이다. 이것은 유리 표면에 PDMS의 양호한 점착을 제어하는 것이 중요하다. 고집의 문제가 나타날 때 확인하는 최초의 것들 모두 표면의 청결과 플라즈마 청소기의 하나입니다. 중요 할 수있는 또 다른 매개 변수는 일입니다로드 세포의 전자 밀도. 자발적 이동은 튜브의 진입을 용이하게하는 채널을 셀.......
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공개 사항
저자가 공개하는 게 없다.
감사의 글
저자는 크게 문화원 퀴리 (CNRS UMR144)에서 PICT IBiSA 플랫폼을 인정합니다. 이 작품은에서 교부금에 의해 투자되었다 : AM.LD에 유럽 연구위원회 (Strapacemi 243103), 협회 국립 라 공들인 (ANR-09-PIRI-0027-PCVI), InnaBiosanté 재단 (Micemico가) MP40으로하고 오전을 붓는다. AM.LD.에 LD 및 ERC Strapacemi 젊은 수사관 부여
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 폴리디메틸실록산(PDMS) | GE 실리콘 | RTV615 | 90% 실리콘 베이스 및 10% 경화제 패키지 |
| 코어 샘플 커터 | Ted Pella Int. | Harris Uni-Core | 직경 2.5mm |
| 유리 바닥 접시 | WPI | 불소 FD 35-100 | |
| 초음파 세척기 | Branson 초음파 | Branson 200 | |
| 플라즈마 세척제 | Harrick Plasma | PDC 32G | 작은 샘플(35개 접시)용. 더 큰 버전도 사용할 수 있습니다: |
| 소 혈장에서 추출한 피브로넥틴 | Sigma Aldrich | F0895 | |
| PolyLysine grafted PEG(Pll-g-PEG) | Susos | PLL(20)-g[3.5]-PEG(5), | |
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | B2261 | |
| Y27632 | TOCRIS | 1254 |
참고문헌
- Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. Cell migration: a physically integrated molecular process. Cell. 84 (3), 359-369 (1996).
- Lämmermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008). <....
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재인쇄 및 허가
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