방법 논문

세포독성 활성을 측정하기 위한 세포 기반 유세포 분석 분석

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DOI:

10.3791/51105

⸱

2013년 12월 17일

 ,  , 
1Vaccine and Gene Therapy Institute of Florida

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 민감한 세포 기반 세포 독성 분석을 설명합니다. 이 분석은 effector CD8+ T 세포의 수가 증가할 때 살아있는 표적 CD4+ T 세포의 빈도 감소를 열거함으로써 항원 특이적 CD8+ T 세포의 세포 용해 활성을 직접 평가할 수 있습니다.

초록

CD8+ T 세포의 세포 용해 활성은 거의 평가되지 않습니다. 여기에서는 항원 특이적 CD8+ T 세포가 동족 펩타이드가 로드된 CD4+ T 세포를 죽이는 능력을 측정하기 위한 새로운 세포 기반 분석법을 설명합니다. 표적 CD4+ T 세포는 두 가지 농도의 CFSE로 표지된 두 개의 집단으로 나뉩니다. 한 집단은 관심 펩타이드(CFSE-low)로 펄스되고 다른 집단은 펄스되지 않은(CFSE-high) 상태로 유지됩니다. pulsed 및 un-pulsed CD4+ T cell을 동일한 비율로 혼합하고 점점 더 많은 수의 정제된 CD8+ T cell과 함께 배양합니다. 자가 표적 CD4+ T 세포의 특이적 사멸은 펩타이드/MHCI 사량체 염색에 의해 검출된 항원 특이적 효과기 CD8+ T 세포를 포함하는 CD8+ T 세포와 공동 배양 후 유세포 분석으로 분석됩니다. 타겟 CD4+ T cell의 specific lysis는 effector 대 target ratio에서 측정되어 lytic units LU30/106 cells를 계산할 수 있습니다. 이 간단하고 간단한 분석을 통해 표적 CD4+ T 세포를 사멸시키는 CD8+ T 세포의 고유 용량을 정확하게 측정할 수 있습니다.

서론

세포 용해 활성은 CD8+ T 세포의 주요 기능이지만 이러한 목적으로 사용되는 분석이 번거롭고 표준화가 어렵기 때문에 여전히 거의 측정되지 않습니다. CD8+ T 세포의 effector 기능을 특성화할 때 이 기능의 정확한 측정이 가장 중요한데, 효과적인 세포 매개 세포독성에 대한 신뢰할 수 있는 예측 인자는 아직 설명되지 않았기 때문입니다1,2. 여기에서는 표적 CD4+ T 세포에서 항원 특이적 CD8+ T 세포의 세포독성 활성을 측정하기 위한 새로운 기능 분석을 제안합니다. 황금 표준인 크롬 방출 분석에 대한 대안을 제공하기 위해 여러 가지 접근 방식이 개발되었습니다. 우리는 살아있는 표적 세포의 사멸을 측정하면서 전체 사멸 과정을 보여주는 세포 기반 분석을 제시합니다. 이 방법은 유세포 분석 기반 세포 독성 분석 프로토콜에서 파생되었습니다in vivo in mouse 4,5 및 in vitro in human6. 이 프로토콜에서는 전체 CD8+ T 세포 집단에 포함된 항원 특이적 CD8+ T 세포를 효과기 세포로 사용하고 자가 CD4+ T 세포를 표적 세포로 사용합니다. 관심 있는 이펙터 CD8+ T 세포는 MHCI/펩타이드 사량체7을 사용하여 열거합니다. 타겟 세포의 사멸은 펩타이드 로드/비로드 CD4+ T 세포 간의 비율로 계산됩니다. 우리는 이전에 이 방법이 재현 가능하고 민감하며 특이적이며 전체 CD8+ T 세포 집단8 내의 효과기 세포 수에 의존하지 않는다는 것을 보여주었습니다. coculture 분석에서 effector 및 target cell의 수를 모두 열거함으로써 target cell을 죽이는 CD8+ T cell의 고유 용량을 계산하고 lytic units9로 표현할 수 있습니다.

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프로토콜

1. Effector CD8+ T 세포의 제조

  1. 극저온 보존된 PBMC(50 x 106개 셀의 2-3개 바이알)를 액체 질소에서 37°C 수조로 옮겨 자가 동결 보존된 PBMC를 해동합니다.
  2. 튜브에 완전한 RPMI(4mM L-글루타민, 100U/ml 페니실린 및 스트렙토마이신, 10% FBS 보충)를 50ml까지 채워 세포를 세척합니다. PBMC를 계수하고 완전한 RPMI에서 5 x 106/ml의 농도로 세포를 재현탁합니다.
  3. PBMC에 특정 펩타이드(5μg/ml) 및 IL-2(10ng/ml)를 첨가합니다.
  4. 96 깊은 웰 플레이트에서 배양을 설정합니다. 각 웰에 1ml의 세포 현탁액을 파종합니다.
  5. 배양 3일 후 세포 배양 배지의 절반을 새로운 완전한 RPMI로 교체합니다.
  6. 배양 6일 후, 멀티채널 피펫으로 모든 PBMC를 수집하고 멸균 저장소에서 세포를 옮깁니다.
  7. 14ml 둥근 바닥 튜브의 권장 분리 버퍼에서 5 x 107/ml로 PBMC를 계산, 세척 및 재현탁합니다. 50 μl/ml 세포에서 human CD8+ T cell enrichment cocktail을 추가합니다. 섞어서 실온에서 10분 동안 배양합니다. 150 μl/ml의 자성 입자를 첨가하고 5분 동안 배양합니다.
  8. 분리 버퍼를 추가하여 세포 현탁액을 최대 7ml까지 가져옵니다. 튜브를 자석에 삽입하여 손길이 닿지 않은 CD8+ T 세포의 면역자기 분리를 진행합니다. 5분 후 튜브를 자석에 넣은 상태에서 관심 세포를 새 15ml 원뿔형 튜브에 붓습니다. 작은 부분 표본을 취하여 4°C에서 30분 동안 1X PBS-2% FBS의 CD3 및 CD8에 대한 항체로 세포를 염색합니다. 그런 다음 CD8+ T cell의 순도는 95% 이상의 예상 순도로 유세포 분석을 통해 측정할 수 있습니다.
  9. CD8+ T 세포를 완전한 RPMI로 450μl에 재현탁합니다.
  10. 225 μl의 완전한 RPMI를 5개의 스크류 캡 튜브에 추가합니다.
  11. 225 μl의 CD8+를 다음 튜브로 옮겨 연속 희석(1:2에서 1:32까지)을 준비합니다(그림 1 상단 패널 참조).

2. 타겟 CD4+ T 세포의 준비

  1. 저온 보존된 PBMC(50 x 106셀 바이알 1개)를 액체 질소에서 37°C 수조로 옮겨 자가 동결 보존된 PBMC를 해동합니다.
  2. 세포 현탁액을 10ml의 RPMI가 들어 있는 50ml 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
  3. 14ml 둥근 바닥 튜브에 분리 버퍼를 사용하여 5 x 107/ml에서 세포를 세척하고 PBMC를 재현탁합니다. 50 μl/ml 세포에서 human CD4+ T cell enrichment cocktail을 추가합니다. 섞어서 실온에서 10분 동안 배양합니다. 100 μl/ml에서 자성 입자를 첨가하고 실온에서 5분 동안 배양합니다.
  4. 분리 버퍼를 추가하여 세포 현탁액을 최대 7ml까지 가져옵니다. 튜브를 자석에 삽입하여 CD4+ T 세포의 분리를 진행합니다. 5분 후 튜브를 자석 안에 넣은 상태에서 원하는 셀을 새 15ml 원뿔형 튜브에 붓습니다. 작은 부분 표본을 취하여 4°C에서 30분 동안 1x PBS-2% FBS의 CD3 및 CD4에 대한 항체로 세포를 염색합니다. 그런 다음 CD4+ T cell의 순도를 95% 이상의 예상 순도로 유세포 분석을 통해 측정할 수 있습니다.
  5. CD4+ T 세포를 세어 2개의 15ml 원뿔형 튜브로 나누고 따뜻한 1x PBS로 세척합니다.
  6. 따뜻한 PBS에서 0.4μM CFSE 높이의 작업 용액을 준비합니다.
  7. 따뜻한 PBS에서 10x CFSE 고작용 용액의 일부를 희석하여 0.04μM CFSE-low working 용액을 준비합니다.
  8. 20 x 106/ml의 PBS에서 세포를 재현탁하고(CD4+ T 세포의 수가 10 x 10미만인 경우 6/ml, 0.5ml의 PBS에서 세포를 재현탁) 동일한 부피의 0.4μM CFSE-높은 작업 용액(최종 농도 0.2μM)을 1개의 동일한 부피로 첨가하여 CD4+ T 세포의 절반을 염색합니다. 예를 들어, 세포 1ml의 경우 CFSE 작업 용액 1ml를 추가합니다. 0.04μM CFSE-저작업 용액(최종 농도 0.02μM)을 동일한 부피로 1개 첨가하여 CD4+의 나머지 절반을 염색합니다. 5% CO2 대기에서 37°C에서 15분 동안 셀을 염색합니다.
  9. 배양 후 펠렛 세포를 1,500rpm에서 5분 동안 가열하고 1ml의 따뜻한 완전 RPMI에 재현탁하여 라벨링 반응을 소멸시킵니다.
  10. 전체 RPMI에 5 μg/ml의 최종 농도에서 관심 펩타이드를 첨가하여 CFSE-low CD4+ T 세포를 펄스하고 37°C의 5% CO2 분위기에서 45분 동안 배양합니다.
  11. CFSE-high 및 CFSE-low CD4+ T cell을 완전한 RPMI로 세척합니다. 총 두 번 세탁을 반복합니다. 완전한 RPMI에서 각각 2 x 105 cells/ml의 농도로 재현탁합니다.
  12. 두 대상 모집단을 1:1(CFSE-High:CFSE-Low)의 비율로 혼합합니다(그림 1 하단 패널 참조).

3. 공동 문화

  1. CD8+ T 세포를 희석할 때마다 100μl를 둥근 바닥 96웰 플레이트에 복제하여 시드합니다.
  2. 혼합된 타겟 CD4+ T 세포(100μl)를 effector cell의 각 희석액에 추가하여 최종 부피 200μl를 얻습니다.
  3. basal apoptosis를 측정하려면 타겟 세포만 있는 3개의 웰을 시드합니다.
  4. 37 ° C에서 5 % CO2 대기에서 6 시간 동안 공동 배양을 배양합니다.

4. 유세포 분석 염색 및 획득

  1. 세포를 V-bottom 96-well plate로 옮기고 37°C에서 5% CO2 분위기에서 15분 동안 PE 복합 pMHC 사량체로 염색합니다.
  2. 1x PBS-2% FBS로 세척하고 Far Red LIVE/DEAD fixable dead cell, αCD3-Alexa700, αCD8-Percp, αCD4-Brilliant Violet 650으로 4°C에서 30분 동안 빛으로부터 보호하여 세포를 염색합니다.
  3. 1x PBS-2% FBS로 세포를 한 번 세척하고 1x PBS에서 2% 포름알데히드로 100μl에 재현탁합니다.
  4. 유세포분석기에서 세포를 획득합니다.

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결과

그림 1의 모식도는 분석 과정을 요약하여 보여줍니다. 정제된 CD8+ T 세포(작용 세포)를 450 µl의 완전 RPMI에 재현탁하고, CD8+ T 세포 225 µl를 225 µl의 배지가 들어 있는 다음 튜브에 추가하여 연속 희석을 수행하였습니다(상단 패널). 정제된 CD4+ T 세포(표적 세포)의 수를 측정하여 두 개의 튜브로 나누고, 프로토콜에 설명된 대로 두 가지 다른 농도의 CFSE(고농도 및 저농도)로 염색하였습니다. CFSE-low CD4+ T 세포에는 관심 펩타이드를 처리하였고, CFSE-high CD4+ T 세포는 대조군으로서 처리하지 않은 상태로 두었습니다. CFSE-high 및 CFSE-low CD4+ T 세포를 2 x 105/ml 농도로 재현탁한 후 1:1 비율로 혼합하였습니다(하단 패널). 혼합된 CD4+ T 세포를 각 웰에 100 µl씩 분주하였습니다. 혼합된 CD4+ T 세포만 포함된 세 개의 웰은 CD4+ T 세포 단독 대조군의 삼반복 실험으로 사용되...

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토론

여기에 설명된 분석은 CD8+ T 세포의 주요 기능인 세포 용해 활성의 정량화를 허용합니다. 이전 연구에서는 이 기능과 항원 특이적 CD8+ T 세포의 사이토카인 분비 사이의 불일치가 보고되었기 때문에 CD8+ T 세포의 이펙터 기능을 특성화할 때 이 기능의 정확한 측정이 가장 중요합니다10,11. 짧은 공동 배양 배양 시간(6시간)과 자가 표적 세포의 사용으로 인해 표적 세포의 비특이적 사멸률이 낮습니다. 따라서 이 분석은 매우 구체적이고 신뢰할 수 있습니다. 이 분석은 또한 다른 세포 하위 집합을 분석하기 위해 쉽게 수정할 수 있습니다. 이펙터 CD8+ T 세포는 생 체 내 사멸 분석법12에서 최근에 기술된 바와 같이 CD4+ T 세포와 같은 다른 세포 유형으로 대체될 수 있다. 표적 CD4+ T 세포는 이전에 자가 B 세포를 표적 세포로 사용하는 것을 설명한 바와 같이 다른 세포 유형으로도 대체될 수 있습니다8. 이 시스템에서는 항원의 기원도 대체될...

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공개 사항

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 작업은 플로리다 관광, 무역 및 경제 개발국의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
EasySep Human CD4+ T 세포 농축 키트줄기세포19052
EasySep Human CD8+ T 세포 농축 키트줄기세포19053
CellTrace CFSE 세포 증식 키트 - 유세포 분석InvitrogenC34554
Far Red LIVE/DEAD fixable dead cellInvitrogenL10120
Alexa Fluor 700 Mouse Anti-Human CD3BD
Brilliant Violet 650 Anti-Human CD4 AntibodyBiolegend317435
PerCP anti-human CD8 AntibodyBiolegend344707
RPMI 1640 Medium 1xVWR10-040-CV
Penicillin-Streptomycin 100x SolutionInvitrogen15070063
Fetal Bovine Serum - Gold, Heat InactivatedPAAA15-252
96웰 플레이트; 처리; U-바닥; 뚜껑 포함BD Falcon353077
25ml 멸균 폴리스티렌, 개별 포장 저장용기USA Scientific2321-2230
96웰 U-바닥, 멸균 2ml 딥 웰 플레이트Thermo Scientific275743
Human IL-2 (v126), 연구 등급Miltenyi Biotec130-093-096
RoboSep Buffer, 분리 완충액줄기세포20104
15 ml 폴리 프로필렌 원뿔 튜브BD 팔콘352097
14 ml 둥근 바닥 튜브, 폴리 프로필렌BD 팔콘352059
큰 쉬운 EasySep 자석줄기 세포18001
PBS 1xVWR21-040-CV
96-well; 뚜껑이 있는 V-바닥 플레이트Fisher12-565-481
포름알데히드 용액, ACS 시약, H2O에서 37wt%Sigma-Aldrich252549-500ML
1.5ml 나사 캡 마이크로튜브, 원뿔형Sarstedt72.692.005
557943

참고문헌

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  11. Trautmann, L., et al. Profound metabolic, functional, and cytolytic differences characterize HIV-specific CD8 T cells in primary and chronic HIV infection. Blood. 120, 3466-3477 (2012).
  12. Hildemann, S. K., et al. High Efficiency of Antiviral CD4(+) Killer T Cells. PLoS One. 8, (2013).

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CD8 TMHCCFSE

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