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방법 논문

마우스 심근의 분리 및 생리 학적 분석

23.4K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/51109

⸱

2014년 9월 7일

 ,  , 
1Department of Medicine, Vanderbilt University, 2Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University

이 논문에서

요약

야생형 마우스와 돌연변이 마우스의 개별 심근세포는 수축성과 칼슘 과도 상태를 연구하기 위해 심장에서 분리할 수 있습니다. 이를 통해 모든 원인에서 심장 기능 장애에 대한 세포 기능 장애의 기여도를 특성화할 수 있습니다.

초록

심장의 주력 세포인 심근세포는 혈액을 펌프질하는 데 사용되는 수축력을 생성하는 정교하게 조직된 세포골격 및 수축 요소를 포함하고 있습니다. 심장 근육의 생리학과 구조를 더 잘 연구하기 위해 40여 년 전에 개별 심근세포를 처음으로 분리했습니다. 기술은 관상 동맥 관류를 통한 효소 소화를 포함하도록 빠르게 개선되었습니다. 보다 최근에는 고립된 근세포의 수축성과 칼슘 플럭스를 분석하면서 심부전의 세포 및 세포 내 분석에 중요한 도구를 제공했습니다. 심장초음파검사와 심전도검사는 장기 수준에서만 심장에 대한 정보를 제공합니다. 심근세포 세포 배양 시스템이 존재하지만, 세포에는 심장 내 근세포 기능에 필요한 조직화된 육관 및 T-세뇨관과 같은 생리학적으로 필수적인 구조가 없습니다. 여기에 제시된 프로토콜에서 심근세포는 Langendorff 관류를 통해 분리됩니다. 쥐에서 심장을 떼어내고, 대동맥을 통해 캐뉼라에 장착하고, 소화 효소를 관류하고, 세포에 칼슘 농도를 증가시킵니다. Edge and sarcomere 검출 소프트웨어는 수축성을 분석하는 데 사용되며, 칼슘 결합 형광 염료는 전기적으로 진행되는 심근세포의 칼슘 과도 상태를 시각화하는 데 사용됩니다. 심장 기능 장애에서 세포 변화의 역할에 대한 이해가 높아지고 있습니다. 전통적으로 심근세포에 대한 약물 효과를 테스트하는 데 사용되었지만, 이 시스템을 사용하여 확장성 심근병증을 유발하는 돌연변이가 있는 WT 마우스와 마우스의 근세포를 비교합니다. 이 프로토콜은 심장 기능과 유전학이 알려진 마우스의 살아있는 세포를 비교한다는 점에서 독특합니다. 유전적 또는 환경적 조작, 감염, 약물 치료 등을 포함한 많은 실험 조건을 신뢰할 수 있게 비교합니다. 생리학적 데이터 외에도, 분리된 심근세포는 세포골격계 요소를 위해 쉽게 고정되고 염색됩니다. 관류를 통해 심근세포를 분리하는 것은 매우 다재다능한 방법으로, 다양한 실험 조건에서 심부전을 동반하거나 심부전으로 이어지는 세포 변화를 연구하는 데 유용합니다.

서론

심근세포는 심장에 수축력을 제공합니다. 각 근세포는 수축에 필수적인 조직화된 세포골격 및 수축 요소를 포함합니다. 심장에는 심근세포뿐만 아니라 섬유아세포, 결합 조직, 푸르키녜 섬유와 같은 변형된 근세포도 포함되어 있습니다. 이러한 세포 유형 중 일부 또는 전부의 변화는 심부전에서 볼 수 있으며, 이로 인해 심장 기능 장애의 궁극적인 원인을 파악하기가 어렵습니다. 심장 기능 부전으로 인한 심실 수축성 감소는 다양한 정도의 섬유 조직 축적과 심근 세포의 비대 및 기능 장애에 의해 선행된다1. 부정맥은 전도성 세포의 기능 장애2, 심장 전도를 방해하는 섬유화3 또는 심근세포의 이온 채널 발현 변화1,4로 인해 발생할 수 있습니다. 실제로 이러한 문제는 종종 복잡한 방식으로 공존합니다.

심근세포를 분리하고 연구하면 전반적인 심장 기능의 맥락에서 개별 근세포의 수축 및 전기 기능 장애를 조사할 수 있습니다. 개별 심장 근세포를 분리하는 기술은 심장의 이 '일꾼' 세포의 생리학을 더 잘 연구하기 위한 노력의 일환으로 40여 년 전에 개발되었습니다. 분리 기술은 세포의 수율과 품질을 높이기 위해 개선되었으며, 1970년에 처음 수행된 대동맥 캐뉼레이션을 통한 관상 동맥 관류의 중요한 발달이 이루어졌다5. 이 기사에서는 심근세포 분리 후 비율계량 형광 및 세포 치수 측정 데이터 수집 소프트웨어를 사용하여 수축성 및 칼슘 과도 현상을 측정하는 방법에 대해 설명합니다. 심장 질환의 유전적 및 환경적 모델 모두에서 이 프로토콜을 사용하면 세포 수축성, 육종 수축성 및 이완, 칼슘 과도 현상 및 세포골격 파괴에 대한 핵심 정보를 얻을 수 있습니다. 이 시스템은 종종 분리된 심근세포에 대한 약물의 효과를 테스트하는 데 사용됩니다6,7. 우리는 이 시스템을 사용하여 야생형 마우스와 확장성 심근병증을 유발하는 돌연변이가 있는 마우스 사이의 심근세포의 수축성과 칼슘 과도 상태를 비교합니다.

개별 심장 근세포를 연구하는 것은 심장 해부학 및 생리학을 연구하는 데 일반적으로 사용되는 다른 방법에 비해 많은 이점이 있습니다. 심장초음파검사와 심전도검사는 심장의 수축 기능과 전반적인 전기 전도에 대한 정보를 제공합니다. 이 방법들 중 어느 것도 전체 장기 수준 이하의 기능 장애의 원인이나 본질을 설명하지 못한다. 가장자리 감지 및 육상 길이 알고리즘을 사용하여 개별 심근세포의 수축성을 측정하면 심장의 수축 세포 내의 변화가 전체 심장 기능 장애 내에 존재한다는 것을 입증할 수 있습니다. 칼슘 과도 현상을 측정하면 세포 수준에서 이온 플럭스의 변화가 수축성 기능 장애 또는 부정맥에 미치는 영향을 보여줍니다.

이 프로토콜은 전체 장기 연구를 보완하는 것 외에도 세포 내 구성 요소에 대해 쉽게 염색되는 세포를 제공합니다. 심장 전체의 조직 부분을 염색하여 세포골격 변화를 볼 수 있습니다. 그러나 세포의 단면만 시각화할 수 있습니다. 전체 심근세포는 일반적인 조직 섹션보다 두껍고, 심근세포의 배열과 길이를 감안할 때 단일 섹션에서 전체 세포를 보기는 어렵습니다. 분리된 심근세포는 즉시 고정하고 다양한 세포골격 요소와 이온 채널에 대해 염색할 수 있습니다. 컨포칼 이미지는 세포의 전체 두께 z-스택으로 컴파일할 수 있습니다. 또한 분리된 심장 근세포를 염색하면 t-세뇨관으로 알려진 막 침습과 같이 단면에서 시각화할 수 없는 구성 요소를 염색할 수 있습니다.

심장 근세포의 배양된 세포주가 존재하며, 그 중 일부는 심장 근세포와 유사한 전사 프로필과 표현형 특징을 가지고 있습니다. HL-1 세포주와 같은 일부 세포주는 일부 육종 조직과 기초적인 수축 능력을 유지하기도 합니다8. 이러한 특성에도 불구하고 배양된 세포는 심근세포의 "박스카" 모양과 t-세뇨관 구조가 부족하고 육종 조직이 적습니다. 이러한 성분은 in vivo에서 심근세포의 기능에 필수적입니다. 또한 배양된 세포를 사용하면 유전자 조작이 가능하지만 생체 내 생리학적 조작은 불가능합니다. 분리된 심근세포는 연구를 할 수 있을 만큼 충분히 오랫동안 세포 조직을 유지하지만 여전히 쉽게 이미지화되고 심지어 형질전환도 가능합니다9.

분리된 심근세포는 매우 다재다능하여 다양한 실험 조건에서 세포를 동일하게 분석할 수 있는 기질을 제공합니다. 근세포의 분리 및 생리학적 분석은 수많은 실험실에서 약물6,7 또는 저분자10, 환경적 스트레스 요인11, 감염12, 질병13 또는 유전적 돌연변이14,15가 수축성 및/또는 칼슘 과도 상태에 미치는 영향을 연구하고 심근세포15-17 내에서 수축성 및 칼슘 방출의 조절을 연구하는 등 다양한 실험에 사용되어 왔습니다. 이러한 스트레스 요인 중 하나가 적용되면 심장 기능의 변화는 심근세포 자체의 변화와 흉터, 전도도의 변화 또는 세포외 기질의 변화와 같은 심장 주변 환경의 변화의 조합으로 인해 발생할 수 있습니다. 이것은 모든 원인으로 인한 심부전의 맥락에서 개별 근세포 구조 및 기능에 관한 연구 질문에 답하기 위한 이상적인 프로토콜입니다.

다른 기술에 비해 수많은 장점이 있지만 고립된 심근세포의 생리학적 분석이 모든 연구 질문에 이상적인 것은 아닙니다. 분리는 말기 절차이므로 심근세포는 마우스의 일생 동안 한 번만 평가할 수 있습니다. 이는 코호트를 사용하여 질병 발병 과정에 따라 개별 마우스를 희생하거나 격리 전에 임상적으로 유의한 심부전이 있는지 여부를 확인하기 위해 마우스를 모니터링함으로써 부분적으로 극복할 수 있습니다. 이 프로토콜은 심근세포 기능 장애가 발생했는지 여부를 결정할 수 있지만, 추가적인 실험 정보 없이는 이 기능 장애가 심부전의 근본 원인이라는 결론을 내릴 수 없습니다. 심근세포 기능 장애 자체는 심장의 다른 변화에 비해 이차적인 것일 수 있습니다. 이러한 어려움에도 불구하고 심근세포에 대한 연구는 특히 다른 실험과 결합할 때 심장 기능 장애의 본질을 결정하는 데 귀중한 정보를 제공합니다.

다음 프로토콜은 밴더빌트 대학의 Chee Lim 박사가 제공한 프로토콜에서 수정한 것입니다. 수축성 및 칼슘 플럭스 데이터는 재현성이 높고 심장을 유전적 또는 환경적 조작과 비교하는 데 유용하지만, 격리 자체는 기술 의존적인 프로토콜로 남아 있어 최적화가 필요합니다. 마우스에서 심장을 제거하고 대동맥 삽관을 통해 심장을 관류하는 사이의 시간을 최소화하는 것은 양질의 소화를 위해 필수적입니다. 또한 분해 시간과 효소 농도를 최고 품질의 근세포에 최적화할 수 있습니다. 최적화가 필요할 수 있는 단계와 최적화를 위한 제안이 아래에 설명되어 있습니다.

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프로토콜

동물과 관련된 모든 절차가 적절한 동물 사용의 승인을 확인하고 몸을 관심.

1 사전에 주식 버퍼를 준비합니다

  1. 이 L 재고 칼슘 무료 타이로드의 (표 1)을 준비합니다. NaOH로 7.4로 pH를 조정합니다.
  2. 이 L 재고 1.2 밀리미터 칼슘 타이로드의 (표 2)을 준비합니다. NaOH로 7.4로 pH를 조정합니다.

실험의 날 2는, 관류, 전송, 소화 버퍼를 준비합니다

  1. 칼슘 + 무료 타이로드의 (표 3)에 150 ml의 관류 버퍼를 준비하고 0.2 μm의 필터를 통해 필터링합니다.
  2. 35 ML을 준비 칼슘 무료 전송 "버퍼" "버퍼 B"(표 5)를 포함 (표 4)과 25 ㎖의 칼슘. 0.2 μm의 필터를 통해 각각의 필터.
  3. 공의 솔루션을 준비0.06, 0.24, 0.6, 및 혼합 버퍼 1.2 밀리미터 칼슘과 B 표 6 당.
  4. 마우스의 체중 (BW)에 기초하여 25 ㎖의 관류 완충액 (표 7)에 소화 효소를 용해하여 25 ㎖의 분해 완충액을 준비한다. 사용하기 전에 0.2 μm의 필터를 통해 필터링합니다.

3 실험 설정

  1. 시판 또는 3 ㎖의 유속을 허용하는 연동 펌프, 배관 및 열 교환기 코일을 사용하여, 정 유량 랑겐 돌프 장치를 조립 / 37 ° C로 가열 된 관류 액의 분. 간단한 도식 벨 2,011 리뷰 제공, 그 외 18됩니다.
  2. 정맥으로부터 유출 3 ㎖ / 분의 유속으로 37 ° C에서 그래서 랑겐 돌프 장치의 순환 수조 온도 (~ 47 ° C)를 설정.
  3. 초순수 타입 I 물 100 ㎖ 다음에 15 분 동안 관류 시스템을 통해 70 % 에탄올을 실행. 정기적 복용을 통해 실행 관류 버퍼5 분간 m은 기포를 제거하면서.
  4. 원하는 방법으로 모든 수술 도구를 소독.
  5. 23 G 루어 스텁 어댑터의 끝 부분에 PE-50 튜브의 짧은 조각 (약 3mm)를 부착하여 정맥을 만듭니다. 튜브의 열 팁은 대동맥이 배치 될 동안 입술을 만들 수 있습니다.

4 심근 격리

  1. 복강 내 주사를 통해, 0.2 ml의 헤파린 용액 (1000 IU / ml)로 마우스를 주입한다.
  2. 5 분 후, 이소 플루오 란에 마우스를 마취. 완전히 (강한 발 핀치에 대한 응답)를 마취하지 않는 경우, 70 % EtOH로 가슴에 스프레이. 가슴을 열고 신속하게 4 ° C 관류 버퍼의 대동맥과 장소를 손상되지 않도록주의하면서 마음을 절제. 잡고 마음에서 들어 올려 곡선 집게를 사용합니다. 이 미세 가위로 마음의 뒤에 첨부 파일을 트림 공간을 만듭니다.
  3. 부드럽게 잘 포셉 이쌍과 대동맥의 가장자리를 잡고 조심스럽게 openi을 당겨 마음을 Cannulate캐 뉼러의 입술을 통해 대동맥의 NG. 이 관상 동맥을 통해 심장의 재관류을 억제하므로, 캐뉼라의 선단 대동맥판지나 뇌실에 있지 않은지 확인.
  4. 즉시 정맥의 입술 위의 대동맥 주위에 5-0 실크 봉합사의 루프를 매서 캐 뉼러에 대동맥을 고정합니다.
  5. 참고 : 4.4을 통해 4.2 가능한 한 빨리 최고 품질의 소화 완료해야 단계를 반복합니다.
  6. 주 : 마음은 이미 관류 버퍼를 흐르는 랑겐 돌프의 장치에 부착 된 정맥에 직접 걸 수 있습니다. 그러나, 해부 현미경으로 관류 버퍼의 작은 주사기에 부착 된 정맥에 마음을 매달려 가장 성공적인 것으로 밝혀졌다. 이것은 관류 완충액 소량 관상 동맥의 삭제에 대한 시청 안전하게 캐뉼라에 부착되는 심장을 보장 통해 푸시 될 수있다. 정맥은 관류 버퍼를 실행하는 랑겐 돌프에 걸려있다.
  7. 관류2 ~ 3 분 동안 3 ㎖ / min의 유량 칼슘 무료 관류 버퍼 마음.
  8. 소화 버퍼 효소 및 7 ~ 10 분 동안 관류로 전환, 마음은 색상 부드럽고 가벼운 될 것입니다.
  9. 주 : 분해 시간은 효소 활성 및 심장 크기에 따라 조정될 수있다.
  10. 마음이 palpably 이완되면, 버퍼 (칼슘 무료 전송 버퍼)와 멸균 P60 접시에 정맥과 장소에서 마음을 제거합니다.
  11. 심방과 큰 혈관을 제거합니다. 원하는 경우 우심실을 제거합니다. 핀셋으로 작은 조각으로 심실을 구분합니다. 멸균 5 ML 전송 피펫 피펫 여러 번 더 세포를 분산합니다.
  12. 250 μm의 나일론 메쉬 필터를 통해 50 ml의 원추형 튜브에 세포 현탁액을 필터.
  13. 서스펜션은 약 10 분 동안 펠렛을 허용합니다.
  14. 0.06 밀리미터 칼슘 용액에 펠렛을 전송합니다. 세포는 10 분 동안 펠렛을 허용합니다. 대부분의 사균 플로트 반면 건강한 세포 펠렛 것이다.
  15. 뜨는을 기음과 0.24 mM의 칼슘 용액에 펠렛을 전송합니다.
  16. 10 분 배양, 구토물이기도를 반복 한 세포가 1.2 mM의 용액에 때까지 나머지 두 칼슘 솔루션을 통해 전송할 수 있습니다. 이 시점에서, 세포의 대부분은 막대 모양의 근세포이어야한다.

(5) 측정 수축성과 칼슘 과도

  1. 주 : 수축성 칼슘 과도 모두 동시에 측정 할 수있다.
  2. 1 μg / μL의 농도로 무수 DMSO에 재현 탁에서의 Fura-2 오전 솔루션을 준비합니다. 의 Fura-2 오전 솔루션은 -20 ° C에서 데시 케이 터에 저장 될 수 있습니다.
  3. 부하 1 μL의 Fura - 오전 2시와 정지 세포의 1 ML. 세포가 어두운 10 분 후 흡인 상등액에 앉아 할 수 있습니다. 세포는 세척 사이 10 분 동안 어둠 속에서 펠렛 할 수 있도록 칼슘 타이로드의 솔루션으로 두 번 씻으십시오.
  4. 가열 체육을 할 수있는 무대 삽입에 유리 커버 슬립을 배치심근 필드 자극기와 페이싱 rfusion / 흡인 전극. 거꾸로 현미경에 배치 무대 삽입 오일 침지 목표를 사용하는 경우 렌즈에 오일 한 방울을 추가, 형광 측정을 위해 설정합니다.
  5. 1.2 밀리미터 칼슘 타이로드의 솔루션을 가열 중력 관류를 설정 무대에서 솔루션은 37 ° C에 도달 할 수 있도록. 진공 흡입을 연결합니다. 전극을 연결합니다.
  6. 현미경 시스템의 전원을 켜고 비율 계량 형광 및 세포 치수 데이터 수집 소프트웨어를 엽니 다.
  7. 일시적으로 혈류를 차단하는 것은 건강한 세포가 정착 할 수 있도록 무대 삽입에의 Fura - 오전 2로드 세포의 몇 방울을 추가합니다.
  8. 원하는 셀을 찾으려면 40 배 목표를 사용합니다. 건강한 세포는 막대 모양의 자발적 계약을 체결하지해야합니다. 그것은 눈에 띄게 균일 계약 셀은 5 ~ 20 V.에 진행되는시기
  9. 주 : 생리 학적 분석은 고품질의 소화를 필요로한다. 그것은 건강한 보이지만 연평균하지 않는 세포를 가질 수 있습니다 생리 학적 분석을 위해 잘 CE. 소화 프로토콜은 높은 품질, 건강한 근육 세포를 얻기 위해 정제가 필요할 수 있습니다. 또한, 돌연변이 또는 질병 마음 프로토콜에 대한 수정이 필요할 수 있습니다.
  10. 렌즈 회전 및 변경 조리개 그렇게에 원하는 화면 및 배경에 가로로 줄 지어 조정합니다 볼 수 없습니다.
  11. 심근 세포의 양 끝을 에지 검출 막대를 맞추고 임계 값을 조정합니다. 균일 한 sarcomeres와 세포의 일부에 근절 검출을 맞 춥니 다. 더 이상 당신이 줄을 만들 수 있습니다, 근절 길이의보다 정확한 수학적 모델이 너무 오래가 sarcomeres의이 인구에 없기 때문에 것입니다.
  12. 페이스 세포 2 Hz에서 녹음하기 전에 10 ~ 15 초 동안 5 ~ 20 V에서.
  13. 기록 추적. 주변 광에 가장 칼슘 과도 녹화 최소화해야한다.

(6) 분석

  1. 비율 적 형광 및 셀 치수 데이터 수집 소프트웨어를 사용하여 트레이스를 분석한다.
제목 "> 7. 또한 연구

  1. 고정 및 면역 염색, 직접 약물 효과, 단기 문화, 원자력 현미경 평가 :이 프로토콜을 포함한 다른 다양한 실험에 사용할 수있는 과량의 세포를 제공한다.

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결과

수축력이 과도 트레이싱 (도 2)를 수집되면, 데이터는 쉽게 적절한 소프트웨어로 분석한다. 전체 추적, 또는 그 일부 (도 3)을 평균화 할 수있다. 수축력은 다양한 방식으로 분석 될 수있다. 수축기 함수, 한 단축과 피크 부분 단축, 또는 시간의 속도로 수축 수축의 크기 및 수축 속도를 평가할 수있다. 이완기 기능은 50 % 단축 및 휴식 속도와 시간을 유사하게 분석 할 수 있습니다. 칼슘 과도를 들어, 유사한 데이터베이스 라인과 피크의 Fura-2 비율 및 시간 뾰족하거나 기준 (표 8)를 포함하여 비교 될 수있다. 이러한 분석은 유사한 전체 장기 부전으로 마음에서 변경 될 수있는있는 수축기 및 이완기 세포 수축 기능에 대한 WT와 KO 마음뿐만 아니라 칼슘 플럭스에서 비교 데이터를 제공합니다. 또한, 동일한 세포로부터 분리 할 수​​있다면역 조직 화학 염색 (도 4)를 포함하는 프로토콜에 나열된 다른 ...

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토론

품질 심근의 분리 연습 및 최적화의 어떤 수준을 필요로한다. 이 프로토콜은 크게 소화의 결과에 영향을 미칠 수있는 주요 단계가 포함되어 있습니다. 수행 및 프로토콜 문제를 해결할 때이 신중하게 고려되어야한다. 삽관 및 재관류에 마음의 제거까지의 시간은 이상적 이하 오분보다 최소로 할 것. 얼음처럼 차가운 버퍼에 마음을 마우스에서 제거하고 해부 및 cannulating 후 얼음처럼 차가운 관류 버퍼에 즉시 마음을 세척하는 것도 품질 소화의 기회를 증가 할 것이다. 삽관 자체는 중요한 단계입니다. 이 관상 동맥의 관류를 차단하므로 캐뉼라의 선단은 아니지만 뇌실로 대동맥판 통해서 대동맥 제 분기 아래에 배치되어야한다. 관상 동맥 관류 품질 소화에 필수적이다. 이 연구실에서는, 캐 뉼러는 관류 버퍼 가득 주사기에 부착된다. 부드럽게 스말을 주입설치 및 혈액의 명확한 관상 동맥 삽관의 적합성을 테스트 할 수 있습니다보고 후 재관류 버퍼의 리터의 양입니다.

이 프로토콜 문제 해결을주의 ...

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공개 사항

우리는 공개 할게 없다.

감사의 글

세포 및 발생 생물학 비디오 촬용 장비학과의 사용에 대한 마크 워즈니악.

밴더빌트 대학의 세포 이미징 공유 리소스.

이 작품은 DMB하기 위해 ERP에 AHA 부여 12PRE10950005, DMB하는 AHA 부여 11GRNT7690040, NIH 보조금 R01 HL037675에 의해 지원됩니다. DMB는 심장 혈관 연구의 글래디스 P. Stahlman 의자입니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
NaClRPIS23020
KCl시그마P-3911
MgCl2SigmaM-8266
HepesEM ScienceS320
NaH2PO4SigmaS5011
CaCl2· 2H2OFisherC79
D-(+)-GlucoseSigmaG7528
2,3-부탄디온-모노심(BDM)SigmaB-0753
타우린SigmaT-0625
소 혈청 알부민(BSA)SigmaA-7030
콜라겐분해효소 BRoche 진단1-088-823
Collagenase DRoche Diagnostics1-088-882
Protease XIVSigmaP-5147
HeparinAPP Pharmaceuticals, LLC401586D
IsofluoraneButler Schein11695-6776-2
Fura-2 AMTeflabs103
DMSO – 무수Sigma276855
IonOptix 세포 페이싱 및 형광 분석 시스템IonOptix
250 μ m 나일론 메쉬 필터Sefar AmericaLab Pak 03-250/50
23G Luer-stub 어댑터Becton Dickinson1482619E
PE-50 튜빙Becton Dickinson427410

참고문헌

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