야생형 마우스와 돌연변이 마우스의 개별 심근세포는 수축성과 칼슘 과도 상태를 연구하기 위해 심장에서 분리할 수 있습니다. 이를 통해 모든 원인에서 심장 기능 장애에 대한 세포 기능 장애의 기여도를 특성화할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
심장의 주력 세포인 심근세포는 혈액을 펌프질하는 데 사용되는 수축력을 생성하는 정교하게 조직된 세포골격 및 수축 요소를 포함하고 있습니다. 심장 근육의 생리학과 구조를 더 잘 연구하기 위해 40여 년 전에 개별 심근세포를 처음으로 분리했습니다. 기술은 관상 동맥 관류를 통한 효소 소화를 포함하도록 빠르게 개선되었습니다. 보다 최근에는 고립된 근세포의 수축성과 칼슘 플럭스를 분석하면서 심부전의 세포 및 세포 내 분석에 중요한 도구를 제공했습니다. 심장초음파검사와 심전도검사는 장기 수준에서만 심장에 대한 정보를 제공합니다. 심근세포 세포 배양 시스템이 존재하지만, 세포에는 심장 내 근세포 기능에 필요한 조직화된 육관 및 T-세뇨관과 같은 생리학적으로 필수적인 구조가 없습니다. 여기에 제시된 프로토콜에서 심근세포는 Langendorff 관류를 통해 분리됩니다. 쥐에서 심장을 떼어내고, 대동맥을 통해 캐뉼라에 장착하고, 소화 효소를 관류하고, 세포에 칼슘 농도를 증가시킵니다. Edge and sarcomere 검출 소프트웨어는 수축성을 분석하는 데 사용되며, 칼슘 결합 형광 염료는 전기적으로 진행되는 심근세포의 칼슘 과도 상태를 시각화하는 데 사용됩니다. 심장 기능 장애에서 세포 변화의 역할에 대한 이해가 높아지고 있습니다. 전통적으로 심근세포에 대한 약물 효과를 테스트하는 데 사용되었지만, 이 시스템을 사용하여 확장성 심근병증을 유발하는 돌연변이가 있는 WT 마우스와 마우스의 근세포를 비교합니다. 이 프로토콜은 심장 기능과 유전학이 알려진 마우스의 살아있는 세포를 비교한다는 점에서 독특합니다. 유전적 또는 환경적 조작, 감염, 약물 치료 등을 포함한 많은 실험 조건을 신뢰할 수 있게 비교합니다. 생리학적 데이터 외에도, 분리된 심근세포는 세포골격계 요소를 위해 쉽게 고정되고 염색됩니다. 관류를 통해 심근세포를 분리하는 것은 매우 다재다능한 방법으로, 다양한 실험 조건에서 심부전을 동반하거나 심부전으로 이어지는 세포 변화를 연구하는 데 유용합니다.
서론
심근세포는 심장에 수축력을 제공합니다. 각 근세포는 수축에 필수적인 조직화된 세포골격 및 수축 요소를 포함합니다. 심장에는 심근세포뿐만 아니라 섬유아세포, 결합 조직, 푸르키녜 섬유와 같은 변형된 근세포도 포함되어 있습니다. 이러한 세포 유형 중 일부 또는 전부의 변화는 심부전에서 볼 수 있으며, 이로 인해 심장 기능 장애의 궁극적인 원인을 파악하기가 어렵습니다. 심장 기능 부전으로 인한 심실 수축성 감소는 다양한 정도의 섬유 조직 축적과 심근 세포의 비대 및 기능 장애에 의해 선행된다1. 부정맥은 전도성 세포의 기능 장애2, 심장 전도를 방해하는 섬유화3 또는 심근세포의 이온 채널 발현 변화1,4로 인해 발생할 수 있습니다. 실제로 이러한 문제는 종종 복잡한 방식으로 공존합니다.
심근세포를 분리하고 연구하면 전반적인 심장 기능의 맥락에서 개별 근세포의 수축 및 전기 기능 장애를 조사할 수 있습니다. 개별 심장 근세포를 분리하는 기술은 심장의 이 '일꾼' 세포의 생리학을 더 잘 연구하기 위한 노력의 일환으로 40여 년 전에 개발되었습니다. 분리 기술은 세포의 수율과 품질을 높이기 위해 개선되었으며, 1970년에 처음 수행된 대동맥 캐뉼레이션을 통한 관상 동맥 관류의....
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프로토콜
동물과 관련된 모든 절차가 적절한 동물 사용의 승인을 확인하고 몸을 관심.
1 사전에 주식 버퍼를 준비합니다
- 이 L 재고 칼슘 무료 타이로드의 (표 1)을 준비합니다. NaOH로 7.4로 pH를 조정합니다.
- 이 L 재고 1.2 밀리미터 칼슘 타이로드의 (표 2)을 준비합니다. NaOH로 7.4로 pH를 조정합니다.
실험의 날 2는, 관류, 전송, 소화 버퍼를 준비합니다
- 칼슘 + 무료 타이로드의 (표 3)에 150 ml의 관류 버퍼를 준비하고 0.2 μm의 필터를 통해 필터링합니다.
- 35 ML을 준비 칼슘 무료 전송 "버퍼" "버퍼 B"(표 5)를 포함 (표 4)과 25 ㎖의 칼슘. 0.2 μm의 필터를 통해 각각의 필터.
- 공의 솔루션을 준비0.06, 0.24, 0.6, 및 혼합 버퍼 1.2 밀리미터 칼슘과 B
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결과
수축력이 과도 트레이싱 (도 2)를 수집되면, 데이터는 쉽게 적절한 소프트웨어로 분석한다. 전체 추적, 또는 그 일부 (도 3)을 평균화 할 수있다. 수축력은 다양한 방식으로 분석 될 수있다. 수축기 함수, 한 단축과 피크 부분 단축, 또는 시간의 속도로 수축 수축의 크기 및 수축 속도를 평가할 수있다. 이완기 기능은 50 % 단축 및 휴식 속도와 시간을 유사하게 분석 할 수 있습니다. 칼슘 과도를 들어, 유사한 데이터베이스 라인과 피크의 Fura-2 비율 및 시간 뾰족하거나 기준 (표 8)를 포함하여 비교 될 수있다. 이러한 분석은 유사한 전체 장기 부전으로 마음에서 변경 될 수있는있는 수축기 및 이완기 세포 수축 기능에 대한 WT와 KO 마음뿐만 아니라 칼슘 플럭스에서 비교 데이터를 제공합니다. 또한, 동일한 세포로부터 분리 할 수있다면역 조직 화학 염색 (도 4)를 포함하는 프로토콜에 나열된 다른 .......
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토론
품질 심근의 분리 연습 및 최적화의 어떤 수준을 필요로한다. 이 프로토콜은 크게 소화의 결과에 영향을 미칠 수있는 주요 단계가 포함되어 있습니다. 수행 및 프로토콜 문제를 해결할 때이 신중하게 고려되어야한다. 삽관 및 재관류에 마음의 제거까지의 시간은 이상적 이하 오분보다 최소로 할 것. 얼음처럼 차가운 버퍼에 마음을 마우스에서 제거하고 해부 및 cannulating 후 얼음처럼 차가운 관류 버퍼에 즉시 마음을 세척하는 것도 품질 소화의 기회를 증가 할 것이다. 삽관 자체는 중요한 단계입니다. 이 관상 동맥의 관류를 차단하므로 캐뉼라의 선단은 아니지만 뇌실로 대동맥판 통해서 대동맥 제 분기 아래에 배치되어야한다. 관상 동맥 관류 품질 소화에 필수적이다. 이 연구실에서는, 캐 뉼러는 관류 버퍼 가득 주사기에 부착된다. 부드럽게 스말을 주입설치 및 혈액의 명확한 관상 동맥 삽관의 적합성을 테스트 할 수 있습니다보고 후 재관류 버퍼의 리터의 양입니다.
이 프로토콜 문제 해결을주의 .......
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공개 사항
우리는 공개 할게 없다.
감사의 글
세포 및 발생 생물학 비디오 촬용 장비학과의 사용에 대한 마크 워즈니악.
밴더빌트 대학의 세포 이미징 공유 리소스.
이 작품은 DMB하기 위해 ERP에 AHA 부여 12PRE10950005, DMB하는 AHA 부여 11GRNT7690040, NIH 보조금 R01 HL037675에 의해 지원됩니다. DMB는 심장 혈관 연구의 글래디스 P. Stahlman 의자입니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| NaCl | RPI | S23020 | |
| KCl | 시그마 | P-3911 | |
| MgCl2 | Sigma | M-8266 | |
| Hepes | EM Science | S320 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S5011 | |
| CaCl2· 2H2O | Fisher | C79 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7528 | |
| 2,3-부탄디온-모노심(BDM) | Sigma | B-0753 | |
| 타우린 | Sigma | T-0625 | |
| 소 혈청 알부민(BSA) | Sigma | A-7030 | |
| 콜라겐분해효소 B | Roche 진단 | 1-088-823 | |
| Collagenase D | Roche Diagnostics | 1-088-882 | |
| Protease XIV | Sigma | P-5147 | |
| Heparin | APP Pharmaceuticals, LLC | 401586D | |
| Isofluorane | Butler Schein | 11695-6776-2 | |
| Fura-2 AM | Teflabs | 103 | |
| DMSO – 무수 | Sigma | 276855 | |
| IonOptix 세포 페이싱 및 형광 분석 시스템 | IonOptix | ||
| 250 μ m 나일론 메쉬 필터 | Sefar America | Lab Pak 03-250/50 | |
| 23G Luer-stub 어댑터 | Becton Dickinson | 1482619E | |
| PE-50 튜빙 | Becton Dickinson | 427410 |
참고문헌
- Babick, A. P., Dhalla, N. S. Role of Subcellular Remodeling in Cardiac Dysfunction due to Congestive Heart Failure. Medical Principles and Practice. 16, 81-89 (2007).
- Nogami, A. Purkinje-Related Arrhythmias Part I....
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재인쇄 및 허가
