Method Article

신선한 수술 샘플에서 분리 및 인간의 심실 심근 기능 특성

DOI:

10.3791/51116

⸱

April 21st, 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department NeuroFarBa, Division of Pharmacology, University of Florence, 2Department of Clinical and Experimental Medicine, Division of Physiology, University of Florence

In This Article

Summary

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심장 질환의 세포 기준으로 현재의 지식은 주로 동물 모델에 대한 연구에 의존한다. 여기에서 우리는 기술과 인간의 심실의 심근의 작은 수술 샘플에서 하나의 실행 가능한 심근을 얻기 위해 새로운 방법을 확인합니다. 인간 심실 근세포은 전기 생리학 연구와 약물 검사를 위해 사용될 수있다.

Abstract

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병에 걸린 심장에서 심근 세포는 세포 구조의 변화, 여진 수축 결합 및 막 이온 전류를 포함하는 복잡한 리모델링 과정을 실시한다. 이러한 변화는 증가 부정맥 위험과 심장병 환자의 수축기 및 이완기 기능 장애로 이어지는 수축 변경에 대한 책임을 져야 할 가능성이있다. 그러나, 심장 질환에서 심근 기능의 변화에​​ 대한 대부분의 정보는 동물 모델에서왔다.

여기에 우리가 설명하고 심장 수술 작업을받은 환자에서 심실의 심근의 작은 수술 샘플에서 실행 가능한 심근 세포를 분리 할 수​​있는 프로토콜을 확인합니다. 프로토콜 상세하게 설명한다. 전기 생리학 및 세포 내 칼슘 측정이 방법으로 얻은 인간의 심실의 심근에서 단일 세포 측정의 숫자의 타당성을 입증하는 것으로보고있다.

이 프로토콜은 그에게보고다시 다른 심장 질환의 존재에서 인간의 마음의 기능 변경의 세포 및 분자 단위의 미래 연구에 유용 할 수 있습니다. 또한,이 방법은 세포 수준에서 새로운 치료 표적을 식별하고 직접 병진 값으로, 인간의 심장 근세포에서 신규 화합물의 효과를 시험하는데 사용될 수있다.

Introduction

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심근의 전기 생리학 속성의 해부는 하나의 심장 근육 세포의 분리를위한 기술의 개발 이후에 현저하게 진행되고있다. 심장 흥분 수축 커플 링 (EC-커플 링)의 이해의 최근 발전은 그대로 조직의 모든 생리 학적 특성을 보유 가능한 단일 심근를 분리하는 능력에 의해 가능하게되었다. 패치 클램프 방법은 일상적 sarcolemmal 심장 이온 전류의 함수 및 약리학 적 변조를 연구하기 위해 사용된다. 칼슘 2 +에 민감한 염료와 세포 내 칼슘 역학의 녹음은 정기적으로 EC-커플 링의 생리에뿐만 아니라 내 Ca 2 +의 병리학 적 변화에 중요한 데이터를 제공하고, 건강하고 병에 걸린 다양한 모델에서 하나의 심장 근육 세포에서 수행됩니다 기계적 손상과 심장 질환의 증가 부정맥 부담으로 이어지는 항상성. 인포이 연구에서 기 임상 설정에서 약물의 전기 생리학 및 기계적 효과를 이해하는 데 매우 중요합니다. 그러나, 횡단 전류와 심장 활동 전위와 심장 역학의 특정 기능을 설명 EC-커플 링 단백질의 종 특정 차이가 있습니다. 비 인간의 포유 동물에서 분리 된 심근 세포의 연구는 생물 물리학 적 특성과 특정 횡단 이온 채널과 EC-결합 단백질의 생리 학적 역할을 밝혀 반면 따라서, 그들은 반드시 인간의 심장 근육 세포의 관련 모델을 제공하지 않습니다. 인간의 심근에서 실....

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Protocol

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인체 조직에 대한 실험 프로토콜은 Careggi 대학 병원 (, 2009 년 갱신 2006 / 0024713)의 윤리위원회에 의해 승인되었습니다. 각 환자는 서면 동의서를 주었다.

1. 솔루션 및 장비 제조

용액은 표 1에 기재되어있다. 세포 격리 절차의 간략화 흐름도는도 1에서 발견된다.

해결 CP DB KB TB PS EB1 EB2
시약 (MM) KH 2 PO 4 (50)
망초 8 1.2 5

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Results

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비 실패한 비 비후성 수술 환자 (21)와 비교하여 상술 한 방법은, 조작 절제술을 시행 비대성 심근증 (HCM)를 가진 환자의 심실 중격으로부터 격리 심근의 기능적 이상을 특성화하기 위해 사용 하였다. 이 섹션에 포함 된 결과를 해당 워크 (21)로부터 유도되며이 기술은 심장 질환 조건에서 심근 세포 기능의 변화를 특성화하는 데 사용될 수있는 방법의 예로서 여기에 도시되어있다.

HCM을 가진 환자의 담당자 수술 샘플은 그림 2A에 표시됩니다. 수술 용 샘플은 크기 및 내막 섬유상 줄무늬의 두께의 점에서 매우 변수되었습니다. 우리는 HCM 샘플에서 각각의 분리 절차를 사용 심근 조직의 양을 1g 주위에 있었다. 대신, 제어 샘플에 사용 조직의 양 (100 ~ 500 밀리그램). 작았 로우로 인해연구 조직의 가용성을 제공합니다. 조직 내에서 실행 가능한 심근 세포의 상대적인 양이 HCM 심근의 감소와 심 내막.......

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Discussion

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우리는 기술과 인간의 심실의 심근의 수술 샘플에서 실행 가능한 심근 세포를 분리하는 방법을 확인했다. 성공적으로 병에 걸린 심실의 심근에서 하나의 실행 가능한 심근 세포의 분리가 개발 및 미세 조정 된 수 있도록 심방 외과 샘플, 기술에서 고립 된 세포에 사용되었던 이전에 설명한 프로토콜에서 시작. 초기 보고서는 선택적으로, 생리 학적 자극 8,24에 변경된 전기 생리학 특성 및 응답의 결과로, 칼륨 전류를 repolarizing 장애인 심방과 심실 조직의 덩어리에서 단일 심근 분리 관상 동맥 관류를 통해 버퍼를 포함하는 효소의 배달이 지연 정류기을 손상하지 않은 반면 것으로 나타났다 분리 셀 (25)의 전류. 불행하게도, 심실 심근의 수술 표본에서 인간의 심실의 심근 세포의 분리는 관상 동맥 분지의 무결성 이후 관상 동맥 재관류에 의해 수행 할 수 없습니다외식 마음과 모순, 손실됩니다. 우리의 방법을 사용하여 심근 덩어리에서 분리 된 심근 페이싱 주파수의 변화에​​ 따라 활동 전위 기간.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

Acknowledgements

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이 작품은 EU (STREP 프로젝트 241577 "큰 마음,"제 7 회 유럽 프레임 워크 프로그램, CP), MENARINI 국제 운영 룩셈부르크 (AM), 텔레 톤 GGP07133 (CP)과 길르앗 과학 (AM)에 의해 지원되었다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
인산칼륨 일염기성 (KH2PO4)Sigma-AldrichP9791
황산마그네슘 헵타하이드레이트(MgSO4*7H2O)Sigma-AldrichM1880
HEPES시그마-알드리치H3375
아데노신시그마-알드리치A9251
D-(+)-포도당시그마-알드리치G8270
MannitolSigma-AldrichM4125
TaurineSigma-AldrichT0625
수산화칼륨 (KOH)Sigma-AldrichP5958
염화나트륨 (NaCl)Sigma-AldrichS7653
염화칼륨(KCl)Sigma-AldrichP9333
인산나트륨이염기성(Na2HPO4)Sigma-AldrichS7907
중탄산나트륨(NaHCO3)Sigma-AldrichS6297
중탄산칼륨 (KHCO3)Sigma-Aldrich237205
피루브산 나트륨Sigma-AldrichP2256
2,3-부탄디온 모노심시그마-알드리치B0753
수산화나트륨(NaOH)시그마-알드리치S8045
L-글루탐산 모노칼륨염 일수화물Sigma-Aldrich49601
피루브산시그마-알드리치107360
3-하이드록시부티르산시그마-알드리치166898
아데노신 5′-triphosphate dipotassium salt dihydrate (K2-ATP)Sigma-AldrichA8937
크레아틴시그마-알드리치C0780
숙신산시그마-알드리치S3674
에틸렌 글리콜-비스(2-아미노에틸에테르)-N,N,N&프라임;,N&프라임;-테트라아세트산(EGTA)시그마-알드리치E0396
소 혈청의 알부Sigma-AldrichA0281
염화마그네슘(MgCl2)Sigma-AldrichM8266
Clostridium histolyticum의 콜라겐분해효소, V형Sigma-AldrichC9263
Proteinase, 박테리아, XXIV형Sigma-AldrichP8038
염화칼슘 용액, H2OSigma-Aldrich21115
염화칼슘 0.1M 용액Sigma-Aldrich53704
칼륨 메탄설포네이시그마-알드리치83000
FluoForte 시약Enzo Life SciencesENZ-52015
전력부하 농축액, 100XLife TechnologiesP10020
관류 패스트 스텝 시스템Warner InstrumentsVC-77SP
암포테리신 B 가용화시그마-알드리치A9528
Multiclamp 700B 패치 클램프 증폭기분자 장치
Digidata 1440A분자 장치
pClamp10.0 분자 장치
소화 장치CUSTOMCUSTOM이 장치는 플라스틱 튜브, 주조 실가드 및 모터를 사용하여 우리 실험실에서 맞춤 제작됩니다. 그림 1C-1D 및 그림 7에 자세히 설명되어 있습니다. 요청 시 추가 세부 정보를 제공할 수 있습니다.
소화 장치의 브러시용 실리콘 엘라스토머Dow CorningSYLGARD® 184
소화 장치용 가변 속도 회전 모터CrouzetCrouzet 178-4765
주조 브러시용 금형N.A.해당 없음금형은 표준 PTFE 2.5cm 직경 막대로 맞춤 제작되었습니다.
민 트

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dow, J. W., Harding, N. G., Powell, T. Isolated cardiac myocytes. I. Preparation of adult myocytes and their homology with the intact tissue. Cardiovascular Research. 15, 483-514 (1981).
  2. Dow, J. W., Harding, N. G., Powell, T. Iso....

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