Method Article

라이브 배양 된 신경 세포의 항체 수유 후 세포 표면과 내면 단백질의 차등 라벨링

DOI:

10.3791/51139

⸱

February 12th, 2014

 ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy & Neuroscience, The University of Melbourne, 2Department of Neurobiology, Duke University Medical Center, 3Florey Institute of Neuroscience & Mental Health, The University of Melbourne

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 특정 폴리 클로 날 항체를 세포 에피토프를 사용하여 신경을 생활의 표면에 단백질을 레이블하는 방법을 설명합니다. 세포 표면에 결합 된 항체에 의해 연속적 endocytosis를 통해 내부화 단백질은 단백질의 나머지와 구별 또는 배양 중에 표면에 매매 될 수있다.

Abstract

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배양 된 신경에있는 추정상의 막 관통 수용체의 세포 표면 지역화을 입증하기 위해, 우리는 단백질의 세포 외 부분에 대해 발생하는 특정 일차 항체와 라이브 뉴런의 표면에 단백질을 표지. 세포를 고정 후 다음 세포 표면 및 내부 단백질이 동일한 레이블 차 항체에 의해 감지됩니다 permeabilized 경우 수용체가 표면과에서 인신 매매되는 것을 감안할 때. 여기서, 우리는 하나가 세포 표면에 남아 또는이 기간 동안 표면에 매매 된 항체 인큐베이션 단계와 단백질 중에 엔도 사이토 시스에 의해 내부화 되었었다 라벨 단백질을 차별적으로하는 단백질 매매 ( "항체 수유")을 연구하기 위해 사용되는 방법을 채택 . 단백질의 두 가지 풀을 구별하는 기능은 초기 incubatio 후 고농도의 레이블이없는 차 항체와 하룻밤 차단 단계의 결합을 통해 가능하게되었다형광 표지 된 이차 항체와 unpermeabilized 뉴런의 명. 다른 형광으로 표지 된 형광 차 항체로 내면화 풀의 검출을 허용하는 신경의 차단 단계, permeabilization 후. 우리는 그것이라고 밝혀,이 추정되는 수용체의 세포 내 위치에 대한 중요한 정보를 얻을 수가이 기술을 사용하여, 참으로, 신경 세포의 세포 표면에 인신 매매. 이 기술은 세포 에피토프에 적합한 항체를 제공하고, 세포의 종류와 세포 표면 단백질의 범위에 광범위하게 적용 할 수있는 것은 사용할 수 있습니다.

Introduction

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새로 확인 된 단백질의 기능을 확립, 문제의 단백질의 세포 내 현지화 및 인신 매매의 조사는 단백질 1,2의 가능성이 역할 / S에 대한 중요한 단서를 제공 할 수 있습니다. 개발 신피질 3의 사체의 생물 정보학 분석은 마우스의 뇌 corticogenesis 동안 변경 발현을 보이는 유전자의 목록을 우리에게 제공했다. 우리는 이들 유전자 중 하나 sez6에 의해 코드되는 단백질이 신경 세포의 개발에 중요한 역할을하고 있음을 확인하기 위해 유전자 녹아웃 방식을 채택했다. 우리는 발작 관련 유전자 6, Sez6, 단백질이 개발 수상 돌기에 있으며 또한 돌기 쪽, 수신 및 흥분성 신호를 통합하는 수상 돌기에 전문 구조에 존재하는 것을 관찰했다. 이 단백질이 결여되는 경우 또한, 덴 드라이트 및 흥분성 시냅스 올바르게 (4)을 형성하지 못한다. 단백질의 가능성이 지배적 인 이소는 transmembran의 기능을 가지고 있습니다전자 수용체 immunolabeled 단백질의 세포 내 분포를 공 초점 현미경으로 또는 면역 전자 현미경으로 검사했을 때, 비록 전부는 아니더라도 대부분 신호의 세포막에 표시된 거의, 또는 전혀, 단백질 somatodendritic 구획에있는 작은 소포와 관련된 등장 세포 표면으로.

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Protocol

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1. 해리 해마 신경 세포 문화

  1. 커버 슬립 (붕규산 유리)를 준비 :
    1. 100 % 에탄올로 세척 할 것.
    2. UV 조사에 따라 공기 건조.
    3. 폴리-D-라이신 (4 박 ° C에서 0.15 M 붕산 버퍼에 0.5 ㎎ / ㎖)와 코트.
    4. 다음 날 (문화의 날) 라미닌으로 다음 코트 PBS에서 3 회 세척에 (2.5 ㎍ / ㎖, 자연 마우스 라미닌) + 5 % V / V를 열 - 불 활성화 된 태아 혈청 (FCS) 2 시간에 대한 PBS에 희석 37 ° C.
  2. 배아 일 18 일 (E18) 쥐의 해마를 해부하고 칼슘과 마그네슘, 얼음에 냉장을 포함하는 PBS로 수집합니다. 주 : 동물을 포함한 모든 실험 프로토콜 멜버른 대학의 동물 윤리위원회에 의해 승인되었다.
  3. 제조업체의 지침에 따라 파파인 해리 키트 파파인과 DNA 분해 효소 I 솔루션을 준비합니다.
    1. 1 ㎖ 파파 용액에 50 ㎕의 DNA 분해 효소의 I 솔루션을 추가합니다.
    2. 참고 : 한 번첫 번째 준비, 파파인 솔루션과 DNA 분해 효소 I 솔루션은 개별적으로 (각각, 파파인과 DNA 분해 효소 I 0.5 ㎖ 및 25 ㎕의 분취 량)을 분취에 분배하고 필요할 때까지 -20 ° C에서....

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Results

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여기에 제시된 가지 색의 형광 면역 염색 기법 (그림 1에 개략적으로 도시) 살아있는 세포의 막 횡단 단백질의 세포 외 도메인을 라벨에 유용합니다. 인큐베이션 기간 동안, 면역 글로불린은 액세스 에피토프에 결합하고 함께 결합 된 항체와 단백질 분자의 인구의 비율은, endocytosed된다. 또, 새로 합성 된 단백질은 순방향 매매를 통해 세포 표면에 도달 할 수 있고, 재활용 단백질 분자는 플라즈마 막 (10)에 리턴 될 수있다.

이 방법은 두 가지 단백질 풀, 세포 표면의 검출에 최적화 연구에서 단백질에 대한 특정 동일한 기본 항체를 사용하여, 내면화하고있다. 종래 permeabilization에 고정 셀에 하나의 형광 태그 된 이차 항체를 적용함으로써, 고정시의 세포 표면에 지역화 된 단백질을 검출 할 수있다. 토르의 결합ough 초기 이차 항체에 의해 구속되지 않은 나머지 단백질 - 일차 항체 표면 복합체의 결합을 금지.......

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Discussion

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여기에 설명 된 기술은 (가 Arancibia-Càrcamo 등. 리뷰) 세포 표면의 바이오 티 닐화 (12)의 보완이며 그것은 내면화 단백질의 세포 내 현지화에 대한 정보를 보존하기위한 선택의 방법, 적절한 일차 항체에 제공 세포 에피토프를 사용할 수 있습니다. 또, 시간 경과에 단백질 매매 / 내재화의 정량 단백질 추출물을 준비 할 필요없이 (일차 항체와 생균 배양에 걸쳐 서로 다른 시간에 커버 슬립을 고정함으로써) 수행 될 수있다.

강도 또는 번호와 관심 영역에 puncta에의 크기 (예를 들어, 소마에서 설정된 거리에 피라미드 신경 세포 인 somata 또는 인접 정점 수상 돌기의 정점 지역) 공 초점 이미지의 서로 다른 조건에서의 측정 및 비교를 (염색 예를 들어, 기저 수준에 비해 자극 8,9). 내면화 수용체 SIGNAL 강도는 표면 수용체의 정상화 될 수있다. 대안 적으로, 기술은 이전에 내재화 항체 - 결.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 그림에 대한 지원은 Teele Palumaa 감사합니다. 국립 보건 의학 연구위원회, 호주에서 프로젝트 그랜트 1,008,046 재정 지원.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Ca 및 MgInvitrogen14040182
Neurobasal 배지Invitrogen21103-049
B27 보충제Invitrogen17504-044
L-GlutamineInvitrogen25030-081
Papain Dissociation SystemWorthington Biochemical CorporationPDS
소 혈청 알부민 시그마 알드리치 오스트레일리아A9418
Hank' s 칼슘, 마그네슘, 페놀이 없는 균형 잡힌 소금 용액레드 Invitrogen (Gibco)14175-079
Poly-D-LysineSigma Aldrich AustraliaP0899
Natural mouse lamininInvitrogen23017-015부분 표본을 만들기 전에 얼음에서 해동
Fetal bovine serum HyCloneThermo Fisher
FluorodeoxyuridineSigma Aldrich 호주F0503
우리딘시그마 알드리치 호주U3003
18 mm 라운드 글라스 커버슬립Menzel Glä serCB00180RA1
VECTASHIELD 수성 장착 매체Vector LaboratoriesH1400
당나귀 안티-래빗 Dylight 649 Jackson ImmunoResearch Laboratories711-495-152
AffiniPure Fab fragment 염소 안티-토끼 1gG (H+L) Jackson ImmunoResearch Laboratories111-007-003
파라포름알데히드Sigma Aldrich AustraliaP6148TOXIC - 흄 후드 처리
Triton-X-100Sigma Aldrich AustraliaT8787
Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-rabbit 2° 항체Invitrogen - Molecular ProbesA21206

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lewis, T. L. Jr, Mao, T., Arnold, D. B. A role for myosin VI in the localization of axonal proteins. PLoS Biol. 9, (2010).
  2. von Zastrow, M., Williams, J. T. Modulating neuromodulation by receptor membrane traffic in the endocytic pathway. Neuron. 76, 22-32 (....

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