신경 줄기 / 전구 세포 (NPC가)의 이식은 재생 신경의 큰 약속을 보유하고 있습니다. 의 NPC의 전신 배달은 뇌와 중추 신경계의 실험 만성 염증성 손상에 의해 영향을 설치류 및 영장류의 척수에 줄기 세포를 제공하는 효과적인 침략 낮은 및 치료 매우 효과적인 프로토콜로 설정되어 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
신경 줄기 / 전구 세포 (NPC들)은 재생 신경과 뇌의 수리 또는 복원을 목표로 이식 방법에 대한 유망한 줄기 세포의 원천입니다. 이 지시문은 뇌 수리가 신경 질환의 여러 전임상 모델에서 초점 또는 전신 NPC 이식 후 달성하는 광범위한 증거에서 생겨났다.
이러한 실험 결과는 긴급 평가를 필요로 뇌 질환에 대한 회복 줄기 세포 치료의 주요 장애물 중 하나로서 세포 전달 경로를 발견했습니다. 뇌실질 내 줄기 세포 이식은 척수 손상과 파킨슨 병으로 격리와 접근 뇌 병변을 특징으로하는 병리에 대한 논리적 인 접근 방식을 나타냅니다. 불행하게도,이 원칙은 다발성 경화증 (MS)를 포함, 다 초점 염증 및 (시간과 공간 모두) 전파 특성에 의해 특징 조건에 제대로 적용 할 수있다. 예, 뇌 SYST에 의해 대상으로EMIC NPC 전달은 뇌 및 중추 신경계 (CNS)의 실험 만성 염증성 손상에 의해 영향을 설치류 및 영장류의 척수 세포를 제공하는 저 침습 치료 효과가 프로토콜이되고있다.
세포 전달이 대안적인 방법은, NPC의 pathotropism에 (ⅰ) 기능성 세포 부착 분자 및 염증성 사이토 카인 및 케모카인 수용체를 통해 환경을 감지하도록 특별히 타고난 용량 의존; (II) 누출 해부학 정맥 주사 후 장벽 (. IV) 또는 뇌 실내 (ICV) 주사를 건너; (III) 염증성 뇌와 척수 손상의 여러 혈관 주위 사이트 (들)의 수준에 축적; 및 (iv) 생체 내에서 다른 호스트 표적 세포 상 현저한 조직 영양 및 면역 조절 효과를 발휘한다.
여기에서 우리는 우리가 IV에 대한 개발 방법을 설명합니다. 및 <EM> ICV의 만성 CNS 염증성 탈수 초화의 모델로 실험자가 면역 뇌척수염 (EAE)와 생쥐의 동계의 NPC의 전달, 그리고 재생 신경의 염증이 뇌의 선택적 타겟팅에 대한 가치있는 기술과 조직의 줄기 세포 전달을 직시하다.
서론
강력한 증거 CNS 장애 1-8의 동물 모델에서 체세포 신경 줄기 / 전구 세포 (NPC가)의 이식의 치료 효능을 입증 생체 내 연구에서 생겨났다. 이러한 실험 결과는 임상 응용 프로그램으로 변환하기 전에 그럼에도 불구하고, 호스트에 줄기 세포의 전달과 관련된 문제의 수는 신중한 검토가 필요합니다. 다 초점, 만성 염증성 뇌 질환 (nonhematopoietic) 원기를 회복시키는 줄기 세포 치료의 발전으로 특히 상당한 장애물은 NPC 주입의 최적 경로를 식별합니다. 대상 질병의 병태 생리의 확고한 이해 (초점 또는 다 초점, 기본 염증 또는 기본 퇴행성) 및 전달 기술과 관련된 가능성과 위험 문제의 신중한 분석은 줄기 세포 전달을위한 최적의 프로토콜을 식별합니다.
동안 초점 ( 예. 신경계의 실질에) 줄기 세포 이식 손상의 공간적으로 밀폐 된 공간을 특징으로 중추 신경계 질환의 치료에 대한 논리적 인 접근 방식 (예를 들면 파킨슨 병과 헌팅턴의 질병, 뇌와 척수 외상성 손상, 뇌졸중), 바로 그 방법을 증명할 수 예, 다 초점 만성, 공간적으로 전파 CNS 손상은 시간이 지남에 축적 MS, 같은 조건에서 실질적으로 가능하지합니다. 후자의 경우, 각각의 병변에 초점 세포 주사를 ....
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프로토콜
동물과 관련된 모든 절차는 1986 년 (SP에 PPL 번호 2천4백57분의 80)의 역할은 동물 (과학적 절차)에 따라 영국 본사의 승인을 실험실 동물 관리의 원칙에 따라 수행된다.
성인 쥐의 뇌의 Subventricular 지대 (SVZ)에서 체세포 신경 줄기 / 전구 세포 (NPC가) 1. 유도
- 절개 악기와 미디어의 준비
NB : 해부 악기 사용하기 전에 (이 파파인을 희석하는 데 도움이 효소의 활성을 최적화) 준비 및 37 º C에서 적어도 20 ~ 30 분에 데워진되기 전에이 두 솔루션은 1-2 시간을 준비해야합니다.- 하나의 직선 날카로운 가위, 하나의 작은 수술 가위로 두 개의 작은 곡선 톱니 모양의 집게를 압력솥.
- '소화'솔루션 : 두 개의 별도의 50 ML 튜브를 준비합니다 :
해결책 # 1 : 25 ml의 얼의 균형 소금 솔루션 (EBSS) + 10 ㎎ 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) + 10 ㎎의 L-시스테인;과
솔루션 # 2 : 25 ML EBSS + 50 mg의 파파인. - , 표피 성장 인자 (EGF; 20 NG / ㎖), 및 항생제; 0.002 %, 염기성 섬유 아세포 성장 ....
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결과
NPC 유도 및 특성
SVZ 해부는 기계 및 효소 분해 (그림 1A)에 의해 6~8주 된 C57BL / 6 마우스의 (N = 5-7 마우스 / 수영장) 풀에서 수행됩니다. CGM에서 배양 몇 일 후, 자유 부동을 neurospheres는 (그림 1A 및 1B)를 형성 시작합니다. 주요 분야는 수집 및 기계적으로 모든 4-5 DIV 계대 있습니다. 계대시, 라이브와 죽은 세포의 수는 확정 누적 세포 수는 성장 곡선 (그림 1C)를 생성하기 위해 꾸몄다. 이는 따라서 NPC 제제의 해외 안정성을 평가하기 위해, 간접 파라미터를 제공하는 전파 속도의 표시를 제공한다. 미분화 신경 세포 (예를 들어, 네 스틴) (그림 2A)을 neurospheres로 확산되면, NPC의 유사 분열 활동의 마커 (5 ㎍ / ㎖의 포스 히스톤 H3, PHH3)을 표현한다. 치.......
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토론
체세포 줄기 세포 기반 요법은 MS2 11과 같은 만성 염증성 CNS 장애 치료를위한 가장 유망한 전략의 하나로 부상하고있다. 자신의 치료 효과를 유지하는 메커니즘은 아직 완전히 규명 될 필요가 있지만, 신경 퇴행성 질환의 다양한 실험 모델에서 NPC 이식의 큰 영향은 세포가 곧 인간의 연구에 적용 할 수있다 줄기 다소 도발적인 믿음에 상승을 부여하고있다. 그러나, 우리는 몇 가지 주요 문제에 직면하고 (다 능성 대 동종, 만능 대자가) 이식을위한 이상적인 줄기 세포 소스의 식별 및 최적의 경로로 어떤 대답없는 질문, 해결해야 이러한 혁신적인 치료의 잠재적 인 인간의 응용 프로그램을 envisaging 전에 관리.
신경 퇴행성 질환은 약간의 공간적 예 (제한되는, 자신의 pathophysiologies에 차이가 있습니다.에서 척수배심원, 뇌졸중) 다른 하나는 시공간 보급 (예를 들어, MS)을.......
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공개 사항
저자가 공개하는 게 없다.
감사의 글
저자는 비판적으로 원고를 검토하고 증거 편집 재이든 스미스 감사합니다. 이 작품은 국립 다발성 경화증 학회 (NMSS, 부분적인 보조금 RG-4001-A1)에서지지를 받고있는, 이탈리아의 다발성 경화증 협회 (AISM가 2010/R/31을 부여), 이탈리아 보건부 (GR08-7), 생명, 방카 아그리콜라 POPOLARE 디 라 구사 (BAPR), 유럽 연구위원회 (ERC) ERC-2010-엑츄에 부여 계약에 따라 없음 260511-SEM_SEM과 유럽 공동체 (EC) 7 회 프레임 워크 프로그램 (FP7/2007-2013) 날개 보조금 협정 N * 내지 아래; 280772 - IONE.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Cell culture | |||
| EBSS | Sigma | E2888 | |
| L-Cystein | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Papain | Worthington | 30H11965 | |
| EDTA | Fisher Scientific | D/0700/50 | |
| Mouse NeuroCult 기초 매체 | 줄기 세포 기술 | 05700 | |
| NeuroCult 증식 보충제 | 줄기 세포 기술 | 05701 | |
| Heparin | Sigma | H3393 | |
| Basic 섬유 아세포 성장 인자 | Peprotech | 100-18B-1000 | |
| 표피 성장 인자 | Peprotech | AF-100-15-1000 | |
| Pen / Strep | Invitrogen | 1514012 | |
| Matrigel (코팅 솔루션) | BD Biosciences | 354230 | |
| NeuroCult® Differentiation Kit (Mouse) | Stem Cell Technologies | 05704 | |
| Accumax | eBioscience | 00-4666-56 | |
| Dulbecco's PBS (DPBS) (10x) without Ca and Mg | PAA Laboratories | H15-011 | |
| Myco trace | PAA Laboratories | Q052-020 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| 면역형광 | |||
| 일반 염소 혈청 | PAA Laboratories | B11-035 | |
| 폴리에틸렌 글리콜 p-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)-페닐 에테르 | 시그마 알드리치 | T8787 | |
| 마우스 안티 네스틴 | Abcam | ab11306 | |
| 토끼 안티 GFAP | DAKO | 203344 | |
| 마우스 안티 히스톤 H3 (포스포 S10)" | Abcam | ab14955 | |
| Rabbit anti MAP-2 | Abcam | ab32454 | |
| Rat anti MBP | AbD SEROTEC MCA409S | ||
| Anti-O4 항체, clone 81 | MAB345 | Millipore | MAB345 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| 마운팅 솔루션 | DAKO | S3023 | |
| EAE | |||
| Freund's Adjuvant Incomplete | Sigma Aldrich | F5506 | |
| Mycobacterium tuberculosis | DIFCO | H37Ra | |
| MOG(35– 55) | Espikem | ||
| Pertussis 독소 | 목록 생물학 실험실 | 181 | |
| Tissue processing | |||
| Iris scissor straight | Fine Sciences Tools | 14060-09 | |
| 무딘/구부러진 집게 | Fine Sciences Tools | 11080-02 | |
| Brain slicer | Zivic Instruments | BSMAS005-1 | |
| 수술 블레이드 | Swann-Morton | 324 | |
| P200, P1000 피펫 | |||
| 케타민 (Vetalar) | Boehringer Ingelheim | 01LC0030 | |
| 자일라진 (Rompun) | Bayer | 32371 | |
| 입체 프레임 | KOPF | 모델 900 | |
| 해밀턴 주사기 | 해밀턴 | 7762-04 | |
| 파라포름알데히드(PFA) | 시그마 | 158127 | |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6100 |
참고문헌
- Ben-Hur, T., et al. Transplanted multipotential neural precursor cells migrate into the inflamed white matter in response to experimental autoimmune encephalomyelitis. Glia. 41, 73-80 (2003).
- Pluchino, S., et al.
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재인쇄 및 허가
