수정 된 침전 법은 요도 엑소 좀을 분리

요약

이 원고는 변형된 침전 기법을 사용하여 인간의 소변에서 엑소좀을 분리하는 프로토콜을 설명합니다.

초록

소변 및 혈장에서 신장 질환을 조기에 발견할 수 있는 바이오마커의 식별은 수년 동안 활발한 관심 분야였습니다. 40-100nm 크기의 소변 엑소좀 소포는 모든 네프론 분절의 세포에 의해 정상적인 조건에서 소변으로 방출되며 세포 유형을 대표하는 단백질, mRNA 및 microRNA를 포함할 수 있습니다. 신장 기능 장애 또는 손상 상태에서 엑소좀은 이러한 성분의 비율이 변화된 것을 포함할 수 있으며, 이는 질병의 바이오마커로 작용할 수 있습니다. 현재 요로 엑소좀을 분리하는 데 사용할 수 있는 방법은 여러 가지가 있으며, 이전에 초원심분리를 기반으로 한 3가지 방법, 나노멤브레인 한외여과 농축기를 사용하는 방법, 상업용 침전 시약을 사용하는 방법, 실험실에서 개발한 ExoQuick 시약을 사용한 침전 기법을 변형하는 방법 등 각 접근 방식에 대한 실험적 비교를 수행한 바 있습니다. 그 결과, 변형된 침전법(modified precipitation method)이 엑소좀 입자, miRNA 및 mRNA의 수율을 가장 높게 생성했으며, 이를 통해 후속 RNA 프로파일링을 위한 엑소좀 분리에 적합하다는 것을 발견했습니다. 우리는 변형된 엑소좀 침전법이 소변에서 엑소좀을 분리하기 위한 빠르고 확장 가능하며 효과적인 대안을 제공한다는 결론을 내렸습니다. 이 보고서에서는 사람의 소변에서 엑소좀을 분리하기 위해 ExoQuick 시약을 사용하여 수정된 침전 기법을 설명합니다.

서론

소변 엑소 좀은 miRNA가 ¹ 농축 한 것으로 나타났습니다 소변 배수 시스템을 긋고 사구체 족 세포, 신장 세뇨관 세포와 세포를 포함 비뇨기 공간에서 정상 및 병적 인 상태에서 모든 종류의 세포에서 파생 된 multivesicular 기관 (MVB)의 100 나노 미터의 작은 내부 소포 있습니다 ^-2. 많은 연구자들은 건강한 사람의 소변뿐만 아니라 신장 및 / 또는 체계적인 질병에 ^3-5 가진 사람에서 분리 된 엑소 좀에 별개의 단백질을 발견했다. 엑소 좀은 ^8-9 초 원심 분리 또는 침전에 ^10-11 nanomembrane 필터를 조합, 예컨대 수크로오스 또는 ^6-7없이 두 단계 차동 초 원심 분리 등의 다양한 방법을 이용하여 분리 할 수있다. 우리는 최근에 소변 엑소 좀을 격리하며 miRNA의 단백질 바이오 마커 ^(11)를 검출하는, 간단하고, 빠르고, 확장 가능하고 효과적인 방법을 개발했다. 바이오 마커는 다양한 생물학적 다양한 유체에서 발견 될 수 있지만, UR오프라인은 비교적 비 침습적 방식으로 다량으로 얻을 수 있기 때문에 신장 및 요로 질환 환자를위한 가장 편리한 선택이다.

소변 엑소 좀을....

프로토콜

주 :. 변성 침전 법을 이용하여 엑소 좀 뇨의 분리에 관련된 단계는도 1에 도시되는 초기 단계 원심 분리에 의해 큰 사균의 제거 및 세포 파편을 포함한다. 각각의 후속 단계에서 수집 된 상층 액에서 얻은 최종 펠렛은 단백질, RNA 및 DNA의 분리를위한 추가의 추출 용액에 용해되는 엑소 좀에 대응한다.

소변 1. 컬렉션

1. 소변 수집하기 전에, 제조업체의 지시에 따라 단백질 분해 효소 억제제 칵테일을 준비하고 빈 멸균 용기에이 칵테일의 3.125를 가하여. 프로테아제 저해제 칵테일을 포함하는 튜브이어서 소변 수집 지원자에게 분배 될 수있다.
   주 : 프로테아제 억제제를 첨가하는 이유는 소변에서 단백질 분해를 최소화하는 것이다. 우리는 특별히에서 프로테아제 억제제 칵테일을 사용하지만시그마, 다른 시판 프로테아제 억제제가 치환 될 수있다.
2. 처음 무효 소변의 약 10 ml의를 수집합니다. 즉시 수집 후 저장 또는 냉동하지 않고 소변을 처리합니다. 수정 된 침전 법을 사용하여 중복에 소변 엑소 좀을 분리; 다른 비뇨기 엑소 입자의 정량화 동안 중복 중 하나는, DNA, RNA 및 총 단백질 추출을위한 것이다.
   참고 : 24 시간 소변 시료를 4 ℃에서 저장....

결과

소변 엑소 좀은 신장 상피 세포에서 분비되는 단백질의 miRNA와 mRNA의 바이오 마커를 수행한다. 이러한 엑소 좀의 분리 및 검출은 당뇨병 성 신증으로 신장 질환의 조기 발견을위한 유용한 진단 도구를 제공 할 수있다. 인간을 대상으로 수집 된 소변 샘플에서 엑소 좀의 분리를위한 몇 가지 방법이 있습니다. 우리는 이전에 소변 엑소 분리의 여섯 방법을 비교하여 단백질의 mRNA와 miRNA의 수준 ⁽¹¹⁾ 결과 조사 하였다. 여기에 우리의 목표는 구체적으로 우리가 소변 엑소 좀을 효율적으로 분리를 위해 개발 한 수정 침전 법을 설명했다.

도 1은 변형 된 침전 법을 이용하여 엑소 좀 뇨의 분리에 관련된 여러 단계의 개략적 인 대표 흐름도를 설명.......

토론

소변에서 엑소 좀 침전을 포함하는 대부분의 방법은 탬-Horsfall 단백질 (THP)에 의해 형성되는 고분자 네트워크의 제거를 해결하지 않습니다. 이 단백질은 추정되는 트랩 초기 저속 원심 엑소 좀 동안 소변에 다량으로 존재한다. 수정 된 방법에서 우리는 엑소 침전하기 전에 DTT를 사용하여 THP를 감소시켰다. 도 2에 도시 된 바와 같이, THP 더 많은 양이 단백질의 제거를 나타내는, 최종 상등액과 펠렛 엑소 아니 THP로, 미처리 펠릿 뇨에서 관찰되었다. 펠릿의 단백질의 정량은 여섯 배 높은 수율을 표시하고, 펠릿 CD9 ELISA 정량에, 그것은 ^{(결과는도 11에} 도시 생략) 소변 1 ㎖ 당 엑소의 수율 변성 침전 법 5 배 높았다 관찰되었다. 바이오 마커 알릭스 ⁶ TSG101 ⁸ 엑소 펠릿 검출되었다; 우리는이 단백질이 집중 사용 하 감지 할 수변성 침전 법의 샘플. 우리는 또한 수정 된 침전 법 ^(11)를

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Corning 15ml 원심분리기 튜브	Corning(Sigma Aldrich)	CLS430791
프로테아제 억제제 칵테일	Sigma Aldrich	P8340
원심분리기	Sorvall
DL-dithiothreitol	Sigma Aldrich	D9779	최종 농도 200mg/ml
Novex NuPAGE SDS-PAGE 시스템(4-12% Bis-Tris Gel 1.0mm, 10웰	)Invitrogen	NP0321BOX	SDS-PAGE 분석용
ECL Advance 웨스턴 블로팅 검출 키트	GE Healthcare Life Sciences	RPN2135	바이오마커
Exoquick-TC 시약	시스템 Biosciences (SBI)	EXOTC50A-1	엑소좀 분리용
엑소좀 CD9 ELISA Complete Kit	System Biosciences (SBI)	EXOEL-CD9-A-1	엑소좀 정량화용
AllPrep DNA/RNA/단백질 미니 키트	Qiagen	80004	DNA, RNA, 단백질 분리용
Rneasy MinElute Cleanup kit	Qiagen	74204
NanoDrop 2000 UV-Vis 분광 광도계	단백질 정량화를 위한	Thermo Scientific
ProteoSilver Sliver Stain Kit	Sigma Aldrich	PROTSIL1-1KT	SDS-PAGE 젤
염색용Xcell SureLock Mini-Cell 전기영동 시스템	Life Technologies		SDS-PAGE 겔 실행용
TaqMan microRNA 분석	Life Technologies		RT-PCR 분석용
qBasePlus v1.5 소프트웨어	Biogazelle NV		RT-PCR 분석 데이터 분석용
Millipore		에 대한 토끼 다클론 항체	바이오마커의 웨스턴 블롯 검출용
TSG101	Abcam		바이오마커의 웨스턴 블롯 검출

ALIX 에 대한 마우스 단클론 항체: