수정 된 침전 법은 요도 엑소 좀을 분리

Summary

이 원고는 변형된 침전 기법을 사용하여 인간의 소변에서 엑소좀을 분리하는 프로토콜을 설명합니다.

Abstract

소변 및 혈장에서 신장 질환을 조기에 발견할 수 있는 바이오마커의 식별은 수년 동안 활발한 관심 분야였습니다. 40-100nm 크기의 소변 엑소좀 소포는 모든 네프론 분절의 세포에 의해 정상적인 조건에서 소변으로 방출되며 세포 유형을 대표하는 단백질, mRNA 및 microRNA를 포함할 수 있습니다. 신장 기능 장애 또는 손상 상태에서 엑소좀은 이러한 성분의 비율이 변화된 것을 포함할 수 있으며, 이는 질병의 바이오마커로 작용할 수 있습니다. 현재 요로 엑소좀을 분리하는 데 사용할 수 있는 방법은 여러 가지가 있으며, 이전에 초원심분리를 기반으로 한 3가지 방법, 나노멤브레인 한외여과 농축기를 사용하는 방법, 상업용 침전 시약을 사용하는 방법, 실험실에서 개발한 ExoQuick 시약을 사용한 침전 기법을 변형하는 방법 등 각 접근 방식에 대한 실험적 비교를 수행한 바 있습니다. 그 결과, 변형된 침전법(modified precipitation method)이 엑소좀 입자, miRNA 및 mRNA의 수율을 가장 높게 생성했으며, 이를 통해 후속 RNA 프로파일링을 위한 엑소좀 분리에 적합하다는 것을 발견했습니다. 우리는 변형된 엑소좀 침전법이 소변에서 엑소좀을 분리하기 위한 빠르고 확장 가능하며 효과적인 대안을 제공한다는 결론을 내렸습니다. 이 보고서에서는 사람의 소변에서 엑소좀을 분리하기 위해 ExoQuick 시약을 사용하여 수정된 침전 기법을 설명합니다.

Introduction

소변 엑소 좀은 miRNA가 ¹ 농축 한 것으로 나타났습니다 소변 배수 시스템을 긋고 사구체 족 세포, 신장 세뇨관 세포와 세포를 포함 비뇨기 공간에서 정상 및 병적 인 상태에서 모든 종류의 세포에서 파생 된 multivesicular 기관 (MVB)의 100 나노 미터의 작은 내부 소포 있습니다 ^-2. 많은 연구자들은 건강한 사람의 소변뿐만 아니라 신장 및 / 또는 체계적인 질병에 ^3-5 가진 사람에서 분리 된 엑소 좀에 별개의 단백질을 발견했다. 엑소 좀은 ^8-9 초 원심 분리 또는 침전에 ^10-11 nanomembrane 필터를 조합, 예컨대 수크로오스 또는 ^6-7없이 두 단계 차동 초 원심 분리 등의 다양한 방법을 이용하여 분리 할 수있다. 우리는 최근에 소변 엑소 좀을 격리하며 miRNA의 단백질 바이오 마커 ^(11)를 검출하는, 간단하고, 빠르고, 확장 가능하고 효과적인 방법을 개발했다. 바이오 마커는 다양한 생물학적 다양한 유체에서 발견 될 수 있지만, UR오프라인은 비교적 비 침습적 방식으로 다량으로 얻을 수 있기 때문에 신장 및 요로 질환 환자를위한 가장 편리한 선택이다.

소변 엑소 좀을 ^6-11을 분리하는 방법은 여러 가지가 있지만, 가장 일반적으로 사용되는 절차는 30 % 자당 쿠션 차동 초 원심 분리에 따라 달라집니다. 이 방법은 효율적이며,이 절차와 절연 얻어진 엑소 좀의 품질이 높은 반면, 기술 자체는 숙련 된 사람이 필요하고 시간이 많이 소요되는 여러 단계를 초 원심 분리에 필요하다. 여과 및 침전 등의 다른 방법은, 독점적 인 침전 시약을 사용하는 것을 포함하여, 엑소 좀의 분리를 위해 개발 된 (즉, ExoQuick-TC : 시스템 생명 과학, 마운틴 뷰, CA). 이 시약을 사용하여 침전 빠르고 비교적 쉽지만, 절연 엑소 좀의 순도는 초 원심 메트 비해 낮다OD. 최근 우리는 우리 실험실에서 개발 ExoQuick ^11-TC를 사용하여 침전 법의 변형을 포함 비뇨기 엑소 좀의 분리를위한 여섯 방법을 비교 하였다. 우리는이 수정 침전 법은 단백질, miRNA의, mRNA를 자체 빠르고 초 원심보다 쉽게​​ 구현했다 절차의 높은 수량을 산출 한 것으로 나타났습니다. 여기, 우리는 단계적으로 수정 된 침전 법의 실험 프로토콜을 설명하고 엑소 분리하는 다른 방법에 비해이 기술의 장점과 단점에 대한 논의를 포함한다. 변성 침전 법은 exosomal 단백질과 상관하고, 소변 엑소 수율을 감소하는 것으로 알려져 탬-Horsfall 단백질 제거하여 엑소 입자의 초기 침전을 포함한다. 우리는 이러한 수정은 소변에서 exosomal 준비의 수율과 순도를 증가 것을 발견했다.

Protocol

주 :. 변성 침전 법을 이용하여 엑소 좀 뇨의 분리에 관련된 단계는도 1에 도시되는 초기 단계 원심 분리에 의해 큰 사균의 제거 및 세포 파편을 포함한다. 각각의 후속 단계에서 수집 된 상층 액에서 얻은 최종 펠렛은 단백질, RNA 및 DNA의 분리를위한 추가의 추출 용액에 용해되는 엑소 좀에 대응한다.

소변 1. 컬렉션

1. 소변 수집하기 전에, 제조업체의 지시에 따라 단백질 분해 효소 억제제 칵테일을 준비하고 빈 멸균 용기에이 칵테일의 3.125를 가하여. 프로테아제 저해제 칵테일을 포함하는 튜브이어서 소변 수집 지원자에게 분배 될 수있다.
   주 : 프로테아제 억제제를 첨가하는 이유는 소변에서 단백질 분해를 최소화하는 것이다. 우리는 특별히에서 프로테아제 억제제 칵테일을 사용하지만시그마, 다른 시판 프로테아제 억제제가 치환 될 수있다.
2. 처음 무효 소변의 약 10 ml의를 수집합니다. 즉시 수집 후 저장 또는 냉동하지 않고 소변을 처리합니다. 수정 된 침전 법을 사용하여 중복에 소변 엑소 좀을 분리; 다른 비뇨기 엑소 입자의 정량화 동안 중복 중 하나는, DNA, RNA 및 총 단백질 추출을위한 것이다.
   참고 : 24 시간 소변 시료를 4 ℃에서 저장하여 엑소의 격리를 위해 수집 할 수 있습니다.

세포 파편과 탬-Horsfall 단백질 2. 제거 (THP)

1. 15 ml의 원심 분리기 튜브에 소변 샘플을 전송합니다. 원심 분리기 37 ° C에서 10 분 동안 17,000 XG에 소변 10ml의 세포 및 세포 찌꺼기 (도 1)를 제거한다.
2. 피펫을 사용하여, 추가 처리를 위해 새로운 튜브에 뜨는을 전송합니다. 차단 용액 500 μL의 펠렛을 재현 탁 (250 mM의 크로즈, 10 밀리미터 하시 느니라최종 농도 200 ㎎ / ㎖)에서 37 ° C : DL-디티 오 트레이 톨 (DTT 10 분 인큐베이션 anolamine, pH를 7.6).
   참고 : DTT는 수확량 감소로 이어지는, 엑소 좀 트랩 THP를 저하 추가됩니다. 뜨는 전송하는 동안 방해받지 펠렛을 떠날주의, 상층 액은 펠릿이 없는지 확인합니다.
3. 소용돌이 펠렛 시료 펠릿까지 매 2 분을 완전히 용해시킨다. 그런 다음 용해 펠릿에 격리 솔루션의 500 μl를 추가합니다.
4. 즉시 37 ℃에서 10 분 동안 17,000 XG에 분리 펠릿 용액, 원심 첨가 한 후. 피펫은 뜨는 및 이전 버전 수집 된 상층 액과 결합.
5. SDS-PAGE 분석을위한 격리 솔루션의 50 μL에 펠렛을 재현 탁.
   주 : TBS 또는 PBS 펠릿을 재현 탁 대신 분리가 사용될 수도있다.

엑소 펠렛 3. 분리

1. 수집 된 supern 11 히드로atant, ExoQuick-TC 시약 3.3 ml에 추가하고 적어도 12 시간 동안 4 ° C에서 배양한다.
   주 : TC-ExoQuick 시약을 상층 액 부피의 비는 증가 또는 exosomal 수율을 감소하도록 조정될 수있다. 우리는 추가 시약의 낮은 볼륨 엑소 좀 작은 수율을 생산하는 것을 관찰했다.
2. 부화 후, 원심 분리기 25 ° C에서 30 분 동안 10,000 XG에 샘플 / ExoQuick-TC 믹스.
3. SDS-PAGE 분석을위한 새로운 튜브에 뜨는을 전송합니다.
4. 엑소 좀 펠렛은 DNA, RNA 및 단백질 추출 및 CD9 ^{11 ELISA를} 이용한 엑소 입자의 정량화 -80 ° C에서 저장 될 수있다.
   참고 : 엑소 펠릿이 제한 동결 융해와 1 년 동안 -80 ° C에 저장할 수 있습니다.

4. 바이오 마커 검출 및 엑소 펠렛의 분석

1. 하류 분석에서, DNA / RNA / 단백질 단리 키트 및 RNA 분리 KI를 사용하여 엑소 좀 펠렛으로부터 DNA, RNA 및 단백질을 추출제조업체의 지침에 따라 t. 샘플 2 μL의 260 nm와 280 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 Nanodrop 분광 광도계를 이용하여 농도를 결정한다.
2. 정량 실시간 RT-PCR (qPCR에)의 TaqMan 마이크로 RNA 분석을 사용하여이 또는 miRNA에 특이 적 프라이머 (우리의 경우, 우리는 인간은 miR-192과의 miR-1207-5p 별 분석을 사용) 수행합니다.
3. SDS-PAGE 분석을 위해 일차원 전기 영동을 4 내지 12 % 비스 -Tris 겔 분리 단백질 시료를 사용한다. 제조업체의 지시에 따라 실버 염색 키트를 사용하여 젤을 가시화.
4. 제조업체의 지시 사항에 따라 PVDF 멤브레인을 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행합니다. 웨스턴 블롯 검출 종양 감수성 유전자 (101) 단백질 또는 TSG101에 세포 사멸 연결된 유전자-2 상호 작용하는 단백질 X 또는 ALIX와 마우스 단일 클론 항체에 토끼 폴리 클로 날 항체를 사용합니다. 오픈 액세스 NIH ImageJ에 소프트웨어에 의해 밴드의 밀도를 정량화 (http://rsbweb.nih.gov/ij/) 또는유사한 프로그램.
5. 제조업체의 지시에 따라, CD9 ELISA 키트를 사용하여 얻어진 뇨 엑소 입자의 수​​를 정량화.

Results

소변 엑소 좀은 신장 상피 세포에서 분비되는 단백질의 miRNA와 mRNA의 바이오 마커를 수행한다. 이러한 엑소 좀의 분리 및 검출은 당뇨병 성 신증으로 신장 질환의 조기 발견을위한 유용한 진단 도구를 제공 할 수있다. 인간을 대상으로 수집 된 소변 샘플에서 엑소 좀의 분리를위한 몇 가지 방법이 있습니다. 우리는 이전에 소변 엑소 분리의 여섯 방법을 비교하여 단백질의 mRNA와 miRNA의 수준 ⁽¹¹⁾ 결과 조사 하였다. 여기에 우리의 목표는 구체적으로 우리가 소변 엑소 좀을 효율적으로 분리를 위해 개발 한 수정 침전 법을 설명했다.

도 1은 변형 된 침전 법을 이용하여 엑소 좀 뇨의 분리에 관련된 여러 단계의 개략적 인 대표 흐름도를 설명한다.<...

Discussion

소변에서 엑소 좀 침전을 포함하는 대부분의 방법은 탬-Horsfall 단백질 (THP)에 의해 형성되는 고분자 네트워크의 제거를 해결하지 않습니다. 이 단백질은 추정되는 트랩 초기 저속 원심 엑소 좀 동안 소변에 다량으로 존재한다. 수정 된 방법에서 우리는 엑소 침전하기 전에 DTT를 사용하여 THP를 감소시켰다. 도 2에 도시 된 바와 같이, THP 더 많은 양이 단백질의 제거를 나타내는, 최종 상등액과 펠렛 엑소 아니 THP로, 미처리 펠릿 뇨에서 관찰되었다. 펠릿의 단백질의 정량은 여섯 배 높은 수율을 표시하고, 펠릿 CD9 ELISA 정량에, 그것은 ^{(결과는도 11에} 도시 생략) 소변 1 ㎖ 당 엑소의 수율 변성 침전 법 5 배 높았다 관찰되었다. 바이오 마커 알릭스 ⁶ TSG101 ⁸ 엑소 펠릿 검출되었다; 우리는이 단백질이 집중 사용 하 감지 할 수변성 침전 법의 샘플. 우리는 또한 수정 된 침전 법 ^(11)를

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Corning 15ml 원심분리기 튜브	Corning(Sigma Aldrich)	CLS430791
프로테아제 억제제 칵테일	Sigma Aldrich	P8340
원심분리기	Sorvall
DL-dithiothreitol	Sigma Aldrich	D9779	최종 농도 200mg/ml
Novex NuPAGE SDS-PAGE 시스템(4-12% Bis-Tris Gel 1.0mm, 10웰	)Invitrogen	NP0321BOX	SDS-PAGE 분석용
ECL Advance 웨스턴 블로팅 검출 키트	GE Healthcare Life Sciences	RPN2135	바이오마커
Exoquick-TC 시약	시스템 Biosciences (SBI)	EXOTC50A-1	엑소좀 분리용
엑소좀 CD9 ELISA Complete Kit	System Biosciences (SBI)	EXOEL-CD9-A-1	엑소좀 정량화용
AllPrep DNA/RNA/단백질 미니 키트	Qiagen	80004	DNA, RNA, 단백질 분리용
Rneasy MinElute Cleanup kit	Qiagen	74204
NanoDrop 2000 UV-Vis 분광 광도계	단백질 정량화를 위한	Thermo Scientific
ProteoSilver Sliver Stain Kit	Sigma Aldrich	PROTSIL1-1KT	SDS-PAGE 젤
염색용Xcell SureLock Mini-Cell 전기영동 시스템	Life Technologies		SDS-PAGE 겔 실행용
TaqMan microRNA 분석	Life Technologies		RT-PCR 분석용
qBasePlus v1.5 소프트웨어	Biogazelle NV		RT-PCR 분석 데이터 분석용
Millipore		에 대한 토끼 다클론 항체	바이오마커의 웨스턴 블롯 검출용
TSG101	Abcam		바이오마커의 웨스턴 블롯 검출