Method Article

적혈구에 대한 항체에 의한 보체 활성의 정량 검출하는 방법

DOI:

10.3791/51161

⸱

January 29th, 2014

 ,  , 
1Department of Immunopathology, Sanquin Research and Landsteiner Laboratory Academic Medical Center, University of Amsterdam, 2Department of Hematology, Academic Medical Center, University of Amsterdam

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서 우리는 적혈구에 대한 항체에 의해 유도 된 보체 활성화를 측정하기위한 두 가지 분석을 설명합니다. 현재의 분석을 통해 가장 큰 장점은 양적 및 쉬운 해석하는 성격이다.

Abstract

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적혈구 (적혈구)에 대한 항체는 간 (혈관 외 용혈) 또는 적혈구의 혈관 내 용해에 이르는 보체 수용체를 통해 가속 정리의 결과로 활성화를 보완하기 위해가 발생할 수 있습니다. 혈관 내 용해 선도 특히 - - 활성화를 보완하기 위해 선도적 인 동종 항체 (자가 면역 용혈성 빈혈, AIHA에서 볼 수있는 것처럼) (예 ABO) 또는 적혈구 항원에 대한자가 항체가 잠재적으로 유해 할 수 있으며 치명적인 1. 현재 인해 적혈구에 (자동) - 항체 활성화를 보완은 RBC 또는 RBC 용해 1-4을 반영하는 nonquantitative 용혈성 분석에 의해 보완 증착을 반영하는 쿰스 테스트를 사용하여 체외에서 평가된다. 그러나, 보체 억제제의 효능을 평가하기 위해, 그것은 정량적 기법을 가지고 필수적이다. 여기에서 우리는 이러한 두 기술에 대해 설명합니다. 첫째, 환자의 혈청에서의 항체에 의해 유도되는 적혈구에 C3 및 C4 증착을 검출하는 분석법이다 사전하고 처리하며. 이를 위해, FACS 분석은 형광 표지 된 항-C3 또는 항-C4 항체로 사용된다. 이어서, 정량 분석​​ 용혈성 설명한다. 환자의 혈청에 의해 유도 된이 분석에 보완 - 중재 용혈이 발표 헤모글로빈의 분광 검출 만들기 사용을 측정한다. 이러한 분석은 모두 항체에 의한 보체 활성화의 연구를 촉진, 재현성과 정량이다.

Introduction

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적혈구 (적혈구)에 대한 항체는받는 사람의 적혈구에 존재하지 않는 항원을 발현하는 적혈구의 수혈에 의해 유발 될 수있다. 이러한 알로 - 항체는 다음과 같은 수혈 5에 활성화를 보완에 의한 중증 급성 용혈성 수혈 반응을 일으킬 수 있습니다. 자가 면역 용혈성 빈혈 (AIHA), 환자는 자신의 적혈구에 대한 자동 항체가있다. 이것은 비장 및 / 또는 간 6,7 보체 수용체 활성화를 통해 보완 할 수 자동 항체의 경우 식세포상의 Fcγ 수용체에 결합하여 적혈구의 IgG의 상호 작용을 통해 세포의 가속 간극에 이르게한다. 혈관 내 용혈의 결과로 전격 보체 활성화는 드물지만 종종 치명적이다. 가속, 급성 빈혈 알로 또는 항체 결과, 따라서 잠재적으로 치명적인 조직의 저산소증 중 하나에 의해 유도 된 매개 RBC 파괴를 보완. AIHA의 자동 항체 dependin, 따뜻하고 차가운 항체로 분류된다그들은 적혈구 (각각 37 ° C 이하)에 바인딩 최적의 온도에 g. 따뜻한 항체의 IgG 아이소 타입의 일반적이며, IgM 항체의 차가운 항체는 8,9 이소. AIHA 예 : lymphoprolyferative 장애, 결합 조직 질환, 고형 종양, 감염이나 약물에 보조 할 수 있지만, 50 %의 경우에 AIHA 특발성 9입....

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Protocol

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1. 브로 멜라 인 처리 적혈구의 준비

  1. 세척 0 형식의 적혈구는 1X PBS (2 ~ 5 분 664 XG에 원심 분리)으로 3 배.
  2. 37 ℃에서 10 분 동안 0.5 % 브로 멜라 인 솔루션의 두 개의 볼륨으로 포장 적혈구의 1 볼륨을 품다
  3. 세포는 1X PBS로 3 배 씻으십시오.
  4. 세포는 1 주일 이상 1X PBS에서 39 ° C에서 3 % 용액으로 저장 될 수있다.

2. FACS에 의한 적혈구에 C3와 C4 증착 분석

  1. 56 ℃에서 30 분 동안 샘플을 가열함으로써 환자 혈청의 필요량 (또는 다른 안티 RBC 항체 소스) 열 불 활성화
  2. (5 mM의 Veronal, 150 mM의 염화나트륨, 0.05 %의 젤라틴의 pH 7.4)과 VBG는 + +에서 그들을 재현 탁 - VBG에 브로 멜라 인 처리 적혈구를 세 번 씻으십시오 (VBG - + 2 mM의 MgCl2를 2 + 10 mM의 염화칼슘 2)에게주는 0.5 % 용액.
  3. (F 유리 진주 둥근 바닥 판에 다음과 같은 구성 요소를 피펫또는 적절한 혼합) : 25....

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Results

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그림 2A는 적혈구의 대표 산점도를 보여줍니다. FSC-A 플롯 (P1) - 하나의 적혈구에 적합한 게이트 드 FSC-W에서 볼 수 있습니다. 적혈구의 보통 약 95 %는이 P1 게이트 (단일 세포) 내에 있지만, 환자 혈청의 높은 비율을 사용하는 경우 안티 RBC IgM 항체가 환자의 혈청에 존재 특히,이 70 ~ 80 %로 떨어 뜨릴 수 있습니다.

C4 증착에 AIHA 환자 혈청의 효과에 대한 대표적인 결과는 그림 2B 및 그림 2C에서 C3 증착에 표시됩니다. 이들 도면에서 알 수있는 바와 같이, 예상되는 바와 같이, 더 많은 환자 혈청 자세한 보완 증착에 이르게한다. 이상하게도, 보수 증착은 두 가지 긍정적 인 피크에서 발생합니다. 적혈구가 하나의 기증자로부터 인출되어 있기 때문에 이것은 아마도, RBC 인구의 이질성에 의해 발생하지 않습니다. 우리는 아직이 현상의 원인을 조사하.......

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Discussion

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위의 분석을 재현하고 강력한 있습니다. 그들은 수행하기 쉽고 그것이 (96 - 웰 플레이트에서) 동시에 많은 샘플들을 수행 할 수있다. 따라서,이 방법은 ELISA 로봇 시스템 예를 들어, 완전 자동화 된 시스템에 적합하다. 현재 사용되는 기술과 대조적으로, 이러한 분석은 정량적이며 이것은 보체 억제제 효과의 연구에서 예를 도울 것이다. 또한, 해석은 현재 사용되는 분석법에 비해 개선하는 목적이다.

두 분석은 하나의 중요한 단계가있다. 그들은 하나의 이벤트로 계산되기 때문에 응집 적혈구는 인위적으로 높은 신호를 제공하기 때문에 FACS 분석에서 중요, 하나의 적혈구에 게이트입니다. 낮은 농도는 여전히 좋은 신호를 제공하기 때문에 그것은 낮은 환자의 혈청 농도를 사용하여 응집을 방지하기 위해 더 나은입니다. 용혈성 분석에서, 신중 상청액을 전송하는 데있어 매우 중요새 접시에 따고 배양은, 적혈구의 이월 때문에 (뜻 기포 등) 신뢰할 수없는 신호로.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자가 공개하는 게 없다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SZ와 DW는 Viropharma의 무제한 허가를받을 수 있습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
PBS프레지니우스 카비 
BSA시그마B-4287 
바르비탈파그론0261이 화학 물질은 약물 규제의 대상입니다.
나트륨 바르비탈Fagron0263이 화학 물질은 약물 규제의 대상입니다.
젤라틴머크1.0470.0500 
염화나트륨Merck1.06404.1000 
염화마그네슘Merck1.05833.0250 
염화칼슘머크1.0238.0500 
Dylight 488 아민 반응성 염료피어스46402 
Dylight 650 아민 반응성 염료피어스62265 
&알파; C5 (에쿨리주맙)알렉시온 제약 
FACS (Canto)BD적절한 레이저가 있는 모든 FACS를 사용할 수 있습니다.
분광 광도계(예: Multiskan 스펙트럼) Thermo Labsystems1500-193올바른 파장 범위의 모든 분광광도계를 사용할 수 있습니다
BD FACSDiva 소프트웨어 v 6.1.2BD643629호환 가능한 FACS 분석 소프트웨어를 사용할 수 있습니다
. Bromelain 산퀸K1121 
.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zeerleder, S. Autoimmune haemolytic anaemia - a practical guide to cope with a diagnostic and therapeutic challenge. Neth. J. Med. 69 (4), 177-184 (2011).
  2. Reardon, J. E., Marques, M. B. Laboratory evaluation and transfu....

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