방법 논문

ECM 단백질 나노 섬유 및 나노 구조 엔지니어링 사용하여 표면 시작 회의

DOI:

10.3791/51176

⸱

2014년 4월 17일

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Carnegie Mellon University, 2Department of Materials Science and Engineering, Carnegie Mellon University

이 논문에서

요약

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단일 또는 다수의 세포 외 기질 단백질로부터 나노 섬유 및 나노 구조 복합체를 얻는 방법을 설명한다. 이 방법은 조직 공학 및 생명 공학 응용 프로그램의 다양한 사용을위한 조정 가능한 구성과 아키텍처 무료 서 단백질 계 물질을 생성하는 단백질 표면의 상호 작용을 사용합니다.

초록

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조직의 세포 외 기질 (ECM)의 합성과 밀접 규제 섬유 직경, 조성 및 조직 차원 섬유 성 단백질의 네트워크를 형성하기 위해 세포에 의해 조립된다. 구조적지지를 제공하는 것 외에도, ECM의 물리 화학적 특성은 접착 성, 분화 및 세포 사멸 등 다양한 세포 과정에 중요한 역할을한다. 생체, ECM은 단백질 내에서 암호화 된 자기 조립 (fibrillogenesis) 사이트를 노출시킴으로써 조립할 . 이 과정은 다른 단백질을 다양하지만, 피브로넥틴 (FN) fibrillogenesis 잘 특징입니다 세포 매개 ECM 조립을위한 모델 시스템 역할을합니다. 특히, 세포는 불용성 섬유로 어셈블리에 대한 바인딩 사이트를 펼치고 노출 FN 이량 체 및 actomyosin 생성 수축력을 바인딩하는 세포막에 인테그린 수용체를 사용합니다. 이 수용체 - 중재 과정은 조직 SCA에 세포에서 ECM을 조립하고 구성하는 세포 수레. 여기, 우리는 ECM 단백질을 전개하고 불용성 섬유로 그들을 조립하는 단백질 표면의 상호 작용을 이용하여 세포 매개 매트릭스 어셈블리를 되풀이되었습니다 방법이라면 시작한 어셈블리 (SIA)를 제시한다. 첫째, ECM 단백질들은 부분적으로 (펼치) 변성 및 암호화 된 바인딩 도메인을 노출 소수성 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 표면에 흡착된다. 펼쳐진 단백질은 다음 열 감응성 폴리 (N-이소 프로필) (PIPAAm) 표면에 미세 접촉 인쇄를 통해 잘 정의 된 마이크로 및 나노 패턴을에 전송됩니다. PIPAAm의 열 트리거 용해 최종 조립과 잘 정의 된 지오메트리와 불용성 ECM 단백질 나노 섬유 및 나노 구조의 릴리스로 연결됩니다. 복잡한 구조는 미세 접촉 인쇄에 사용되는 PDMS 스탬프에 엔지니어링 정의 된 패턴에 의해 가능하다. FN 이외에, SIA 프로세스는 라미닌, 피브리노겐으로 사용될 수 있고 콜라겐은 I 및 IV는 다 성분 ECM의 나노 구조를 만드는 입력뚜. 따라서, SIA는 생체 내에서 ECM의 구조와 구성을 다시 요약하기 위해 단백질 조성물, 섬유 형상 및 지지체 구조를 정확하게 제어하여 ECM 단백질 계 물질을 설계하는 데 사용될 수있다.

서론

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조직의 세포 외 기질 (ECM)를 부착, 증식, 분화 및 세포 사멸 1-3 포함한 여러 세포 프로세스의 물리적, 화학적 조절에 관여 다기능 단백질로 구성되어있다. ECM은, 합성, 조립 및 세포 조직의 구성 단백질 섬유 조직의 종류와 발달 단계에 따라 달라 독특한 성분, 섬유의 크기, 형상 및 상호 연결된 구조를 가지고있다. 최근 작품은 ECM이 조성과 구조의 측면에서 ECM을 recapitulating하는 조직 공학 및 생명 공학 응용을위한 생체 모방 재료의 개발을 가능하게 할 수 있다고 제안, 설계 조직 4를 형성하는 세포를 안내하는 유익한 단서를 제공 할 수 있음을 보여 주었다.

제조 방법의 수는 조직에 ECM의 측면을 모방 할 중합체 골격을 설계하기 위해 개발되었다. 예를 들어, 전기 방사 및 위상 저전압 회로 차단기ATION 모두 다운 수십 마이크로 미터에서 나노 미터 5-7 수십에 이르는 직경 섬유의 다공성 매트릭스를 형성하는 능력을 증명하고있다. 두 가지 기술은 나노 섬유의 다공성 매트릭스는 발판 (8)에 세포 부착 및 침투를 지원할 수있는 것으로 나타났습니다. 그러나 이러한 접근 방식을 만들 수 있습니다 가능한 섬유 형상, 방향 및 3D 아키텍처에....

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프로토콜

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포토 리소그래피를 사용하여 마스터 몰드 1. 제작

  1. ECM 단백질 나노 섬유, nanofabrics 및 제조 할 수있는 나노 구조는 첫 번째 (CAD) 소프트웨어를 컴퓨터 지원 설계를 사용하여 설계되었습니다. 이 CAD 파일은 그 다음, 포토 마스크로 전사된다. 포토 마스크의 분류는 특징의 해상도에 의존 할 것이다; 투명도 기반의 포토 마스크와 기능에 대한 충분한은 ~ 10 ㎛까지 크기. 작은 기능은 10 ㎛ 유리 포토 마스크에 크롬이 필요합니다 <. 여기에 제시된 나노 섬유 및 나노 구조의 모든 투명도 기반의 포토 마스크를 이용하여 제조하고, 따라서 두께가 나노 미터 스케일했지만 횡되지 치수 하였다.
    참고 : 그것은 (통과 자외선 방지) 포토 마스크의 영역이 어둡게되는 구분하는 것이 중요하고 투명하게되는이 같은 (UV 빛이 통과 할 수 있도록), 포토 레지스트의 종류에 따라 (양 또는 음) 마스터 몰드의 최종 지형을 지시 할 것이다.
  2. 마스터 몰드의 제조를 시작하기 위해 15 분 동안 150 ° C의 설정, 핫 플레이트에 배치하여 4 "실리콘 웨이퍼를 탈수.
  3. 스핀 코터의 진공 척에 웨이퍼를 중앙. 웨이퍼의 중간에 SU8 2015 네가티브 포토 레지스트를 붓고 웨이퍼의 3 분의 2가 덮여 때까지 동심원 쏟아져 계속합니다.

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결과

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SIA는 섬유 치수를 정확하게 제어 엔지니어링의 ECM 단백질 나노 섬유의 할 수있다. 이 방법을 설명하기 위해 50 × 20 ㎛, 평면 치수 FN 나노 섬유의 배열은 PIPAAm 코팅 커버 슬립 (그림 2A)로 패턴 화 하였다. PIPAAm 표면 (그림 2B)에 패턴 때 그들이 고유의 사전 스트레스를 받고 있었기 때문에 릴리스에 따라, 섬유는 계약. FN 나노 섬유의 분석들은 50.19의 평균 길이가 단 분산 시험판했다 밝혀 ± 19.98 ± 0.17 ㎛, 0.49 ㎛의 폭 (그림 2C). 분명 계약에도 불구하고, FN 섬유는 출시 후 여전히 14.15의 평균 길이가 단 분산했다 ± 2.65 ± 0.32 μm의 (그림 2D)의 0.92 μm의 폭. 원자 힘 현미경은 SIA 분리 프로세스와 연관된 섬유 치수 변화의 높은 해상도 관점을 제공했다. 특히, 섬유는 시험판했다~ 5 nm의 (그림 2E.......

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토론

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SIA의 방법은 여기에서 모방 세포 매개 매트릭스 어셈블리를 제시하고 조정할 수있는 크기, 조직 및 구성과 ECM 단백질 나노 섬유 및 나노 구조의 설계를 가능하게한다. 세포 생성 ECM과 동일하지는 않지만, SIA는 기계적 변형 21 일 동안 전개 / 가역 접는를 받아야 세포 20을 바인딩 할 수 있습니다 나노 단백질 섬유 (20)로 구성 ECM을 만듭니다. 이것은 생체 내에서 발견 된 ECM의 여러 속성을 요점을 되풀이 ECM 단백질의 자료를 구축 할 수있는 독특한 기능을 제공합니다. 예를 들어, ECM 나노 파이버는 다른 기술과 불가능한 제어 레벨에 특정 길이로 제조 될 수있다. 우리는 단 분산 나노 섬유의 배열 길이의 정확한 제어와 폭 시험판 (그림 2C) 및 릴리스 후 (그림 2D)과 (그림 2)을 생성 할 수있는 기능을 보여줍니다. FN 나노 제조에 의해 입증 이러한 ECM 나노 섬.......

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공개 사항

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저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

감사의 글

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금융 지원은 NIH 감독의 새로운 혁신 상 (1DP2HL117750)에서 다우드-ICES 교제 QJ과 AWF에, 재생 의학 T32 교육 프로그램 (2T32EB003392)에 NIH 역학에서 JMS에 제공되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
폴리(N-이소프로필아크릴아미드) / PIPAAmPolysciences21458-1040,000 Mw
Sylgard 184 실리콘 키트(PDMS)다우코닝은 10개 부품 베이스와 1개 경화제를 혼합합니다.
부탄올
피브로넥틴BD 생명과학354008인간, 1mg
라미닌BD 생명과학354239초순수, 마우스, 1mg
음성 감광액MicrochemSU8-2015
SU8 개발자Microchem
Sonicator Branson M3510Branson Ultrasonic CorporationCPN-952-318
Thinky ARE-250 믹서Thinky Corporation
Spincoater특수 코팅 시스템G3P-8
유리 커버 25mm 직경, No 1.5Fisher Scientific12-545-86

참고문헌

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  1. Geiger, B., Bershadsky, A., Pankov, R., Yamada, K. M. Transmembrane crosstalk between the extracellular matrix and the cytoskeleton. Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 793-805 (2001).
  2. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
  3. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -l

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재인쇄 및 허가

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Surface Initiated AssemblyECM Protein NanofibersMicrocontact PrintingPDMS StampsPIPAAm SurfaceProtein AdsorptionThermal DissolutionFibronectin AssemblyLaminin IncorporationTissue Engineering Scaffolds

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