방법 논문

4D 공 초점 현미경을 사용하여 제브라 피쉬의 두개 안면 형태 형성 분석

DOI:

10.3791/51190

⸱

2014년 1월 30일

 ,  , 
1Institute for Cell and Molecular Biology, The University of Texas at Austin

이 논문에서

요약

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시간 경과 공 촛점 이미징은 배아 발달의 특성에 유용한 강력한 기술이다. 여기에서, 우리는 방법을 설명하고 두개 안면 야생 형에서 형태 형성뿐만 아니라 PDGFRA, smad5 및 SMO 돌연변이 배아를 특징.

초록

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시간 경과 영상은 형태 형성의 과정을 직접 관찰 할 수있는 기술, 또는 모양의 세대입니다. 때문에 광학적 선명도와 유전자 조작에 복종 할 의무에, 제브라 피쉬 배아는 살아있는 배아에서 형태 형성의 시간 경과 분석을 수행 할 수있는 인기 모델 생물이되고있다. 라이브 제브라 피쉬 배아의 공 촛점 이미징은 그 조직이 지속적으로 같은 유전자 또는 주입 염료로, 형광 마커로 표시되어 있어야합니다. 프로세스는 배아 마취 건강한 발달이 정상적으로 진행되는 방식으로 제 위치에 유지되는 것을 요구한다. 이미징을위한 매개 변수에는 다음과 같은 세 가지 차원의 성장을 고려하여 개발의 빠른 스냅 샷을 가져 오는 동안 개별 셀 해결의 요구에 균형을 설정해야합니다. 우리의 결과는 형광 표지 된 제브라 피쉬 배아의 생체 촬상있는 장기를 수행하고있는 다양한 조직 행동을 검출하는 능력을 입증두개 안면 기형을 일으키는 원인이되는 뇌 신경 능선. 마취 및 장착으로 인한 개발 지연을 최소화하고, 배아는 프로세스에 의해 무사히입니다. 시간 경과 이미징 배아는 개발 이후 지점에서 액체 배지로 돌아 왔고, 이후 몇 군데 또는 고정 할 수 있습니다. 형질 전환 제브라 피쉬 라인과 잘 특성화 운명 매핑 및 이식 기술, 영상의 증가 풍부한 원하는 조직이 가능합니다. 따라서, 생체 내 이미징의 시간 경과가 돌연변이 및 미세 주입 배아의 분석을 포함하여 제브라 피쉬의 유전 적 방법으로 강력하게 결합한다.

서론

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두개 안면 형태 형성은 여러 세포 유형 간의 상호 협조를 필요로 복잡한 다단계 과정이다. 두개 안면 골격의 대부분은 신경 능선 세포에서 파생되는 많은 인두 아치 1이라는 일시적인 구조로 지느러미 신경 튜브에서 마이그레이션해야합니다. 많은 조직과 같이, 두개 안면 골격 형태 형성의 발달은 특정 시점에서 배아의 정적 이미지에 의해 이해 될 수있는 것보다 더 복잡하다. 그것은 시간이 많이 걸리는 수행 할 수 있지만, 생체 시간 경과 현미경은 배아의 세포와 조직에서 연속보기를 제공합니다. 시간 경과 시리즈의 각 이미지는 다른 사람에게 컨텍스트를 준다, 그리고 현상이 발생하는 이유를 추론보다는 그 시간에 발생하는 것을 추론을 향한 구도자 이동하는 데 도움이됩니다.

생체 내 이미징에 따라서에 실험적인 접근을위한 강력한 설명 도구입니다형태 형성을 안내 경로를 해체. 제브라 다니오의 rerio는 척추 동물의 배아 발달의 인기 유전 모델이며, 특히 형태 형성의 생체 내 이미징에 적합합니다. 현대, 형질 전환 게놈 수정을위한 편리한 방법은 빠르게 제브라 피쉬 연구원에 사용할 수있는 도구의 수를 진행하고 있습니다. 이 도구는 유전자 조작과 현미경 이미....

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프로토콜

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1. 축산 및 돌연변이 대립 유전자

  1. (21) 기술로 제브라 피쉬를 올리고 번식.
  2. 본 연구에서 사용 된 제브라 피쉬의 돌연변이 대립 유전자는 16 b1059 smad5 B1100 (22)와, SMO의 b577 23 PDGFRA했다. 이 zebrafish의 변종에 대한 소스는 ZIRC 있습니다.

2. 솔루션 및 도구의 준비

참고 : 모든 솔루션과 구현이 사전에 향후 사용을 위해 저장 될 수있다.

  1. 이전 21 설명한 바와 같이 배아 미디어 (EM)을 확인합니다.
  2. 4g / L MS-222 (Tricaine)을 확인합니다. 450 ㎖의 멸균 물에 4g의 나트륨 인산염 (Na 2 HPO 4)을 녹입니다. 솔루션에 2g MS-222를 추가합니다. 7.0-7.2 내에서의 pH를 조정합니다. 500 ml의 총 부피에 멸균 물을 추가합니다.
  3. 선택 사항 : 4g / L 정향 오일을 확인합니다. 50 ML 원뿔 튜브에 0.2 g의 순수한 정향 오일의 무게를. 50 ㎖의 총 ....

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결과

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주동이의 방향 (동영상 1)에서 이동하는 동안 야생 형 배아에서 신경 능선 인구 다음, 인두 아치 전방 / 후방 및 지느러미 / 복부 축을 따라 연장. 30시간 포스트 수정 (HPF)에서, 제 인두 아치의 전방 / 후방의 길이는 1.8-1.9 배 지느러미 / 복부 높이 사이입니다. 지느러미 / 복부 신장 빠른 36.5 HPF까지 전방 / 후방 연장보다 꾸준히 진행된다. 여기에서, 지느러미 / 복부 높이의 고원 약 104 μm의 48 HPF를 통​​해. 전방 / 후방의 확장은 전체의 전방 / 후방의 길이가 48 HPF에서 1.95 배 지느러미 / 복부 높이 HPF 36.5에서 1.5 배 지느러미 / 복부 높이 아래에서 증가, 48 HPF를 통​​해 계속됩니다.

그 앞쪽 끝에서 첫 번째 인두 아치 상악 (등쪽)과 하악 구강 외배엽으로 구분 (복부) 도메인을 형성한다. 첫 번째 인두 아치의 상악 도메인은 F를 측정한다구강 외배엽의 후방 정점에의 말단 .......

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토론

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시간 경과 공 초점 현미경 개발의 분석을위한 강력한 도구입니다. 여기, 우리는 신경 능선 세포 레이블 유전자 변형을 사용하여 중요한 신호 전달 경로에 대한 돌연변이 있습니다 제브라 피쉬에서 인두 아치 형태 형성을 연구하는 방법의 유용성을 보여줍니다. 조직 수준뿐만 아니라 시간 경과 분석도 휴대 규모 28에서 분석에 적용, 분석한다. 대부분의 널리 사용되는 제브라 피쉬의 방법은 morpholinos와의 미세 주입, mRNA를, 또는 유전자 변형 구조뿐만 아니라 태아 사이의 이식 등의 시간 경과 현미경 실험에 통합 할 수 있습니다. 체류 현상 조직의 분석은 형광 라벨 조직에 능력에 의해 크로스 토크없이 다른 형광체의 원하는 수를 검출하는 공 초점 현미경의 능력에 의해 제한된다. 제브라 피쉬 배아의 클러치에서 영상화 할 수있는 사람의 수는 심각하게 제한되어 있지만 고급 기술동일한 시간주기에서 여러 배아의 자동 촬상을 허용한다. 쉽게 이른 시점에서 식별되는 돌연변이의 저속 분석을 수행하고자 할 때 특히 유용하다. .......

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공개 사항

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저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

감사의 글

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우리는 그들의 전문적인 물고기 케어 멜리사 그리핀과 제나 Rozacky 감사합니다. PDM 감사 EGN 지원, 관용과 인내를 작성. 이 작품은 JKE에 NIH / NIDCR R01DE020884에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
6lb 테스트 모노필라멘트 라인Cortland Line CompanySLB16
Agarose IAmresco0710
아르곤 레이저LASOS Lasertechnik GmbHLGN 3001
염화칼슘Sigma-AldrichC8106
모세관 튜빙, 100mm, 0.9mm IDFHC30-31-0
정향 오일Hilltech 캐나다, Inc.HB-102
고진공 그리스다우 코닝2021846-0807
Isotemp 건식조 인큐베이터Fisher Scientific2050FS
레이저 스캐닝 현미경Carl Zeiss AGLSM 710
황산 마그네슘 육수화물Sigma-Aldrich230391
현미경 커버 유리, 22 x 22-1Fisher Scientific12-542-B
현미경 커버 유리, 24 x 60-1Fisher Scientific12-545-M
염화칼Fisher ScientificM-11321
인산칼륨 이염기시그마-알드리치P3786
염화나트륨Fisher ScientificM-11624
인산나트륨 이염기성시그마-알드리치S7907
TempController 2000-2PeCon GmbH
트리카인-S웨스턴 케미컬, Inc.
륨 성

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Trainor, P. A., Melton, K. R., Manzanares, M. Origins and plasticity of neural crest cells and their roles in jaw and craniofacial evolution. Int. J. Dev. Biol. 47, 541-553 (2003).
  2. Eberhart, J. K., Swartz, M. E., Crump, J. G., Kimmel, C. B.

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재인쇄 및 허가

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