방법 논문

PDMS 막에 마이크로 패턴 세포를 스트레칭

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DOI:

10.3791/51193

⸱

2014년 1월 22일

 , 
1UMR 144, Institut Curie

이 논문에서

요약

이 원고는 단방향 스트레칭을 사용하여 부착 세포 나 조직에 힘을 적용하거나 해제하는 방법을 제시한다.

초록

기계의 힘은 세포에 작용 및 / 또는 조직은 다수의 프로세스에 중요한 역할을한다. 우리는 폴리 디메틸 실록산 영상과 호환 (PDMS) 막에 도금 세포 스트레칭 장치를 개발했습니다. 이 기술은 재현하고 다양한입니다. PDMS 막을 구체적인 형상으로 세포 또는 조직을 한정하기 위해 마이크로 패턴 될 수있다. 첫 번째 단계는 딥 UV 기술로 PDMS 막 상에 미세 패턴을 인쇄하는 것이다. PDMS 막이어서 기계적 들것에 장착된다. 챔버는 스트레치 동안 활공 수 있도록 생체 적합성 그리스와 멤브레인의 상단에 바인딩됩니다. 세포를 시딩하고 미세 패턴에 몇 시간 동안 확산 할 수있다. 샘플은 마이크로 미터 나사를 이용하여 여러 번 연신 및 연신 될 수있다. 그것은 (30 % 정도)의 전체 범위에 스트레치를 적용하는 분 미만 소요됩니다. 여기에 제시된 기술에 필요한 동력 장치를 포함하지 않습니다신속 및 / 또는 컴퓨터 제어 연신 반복 스트레치 사이클 pplying 있지만이 구현 될 수있다. 세포 스트레칭이나 조직 세포의 힘, 기계적인 스트레스 나 조직의 형태 형성에 대한 세포 반응에 관련된 질문에 관심이있을 수 있습니다. 이 비디오 프리젠 테이션은 단순 해 보이는 이런 유형의 실험을 수행 할 때 발생할 수있는 일반적인 문제를 방지하는 방법을 보여줍니다.

서론

고등 생물의 조직을 구성하는 세포는 기계적인 긴장과 외부 환경이나 주변의 세포 1, 2에서 하나 오는 스트레칭 힘이 적용됩니다. 세포에 적응하고 조직의 무결성을 유지하기 위해 이들의 힘에 저항한다. 이러한 힘은 개발 3,4 동안 조직의 형태 형성에 중요하다. 배양 된 세포에 기계적인 힘을 적용하는 것은 조직에 일어날 일에 모방 할 수있는 방법이지만, 세포의 모양과 세포의 변형 5,6의 양적 및 독립 제어와. 이를 위해 여러 가지 기술들이 사용될 수있다. 하나는 (전체 세포 또는 그 일부)를, 예를 들어 AFM 또는 파생 7,8 또는 세포가 성장 기판을 스트레칭을 사용하여 셀을 누를 수 있습니다.

이 문서에서 설명하는 방법은 세포로 도금 평면 기판을 스트레칭하는 방법을 보여줍니다. 이 기술은 원래 평가하기 위해 개발 된 힘의 역할은 m에 작용itotic 포유 동물 세포 9. 유사 분열 세포가 수축 섬유를 통해 기판에 연결 상태를 유지하고 막을 스트레칭 차례로 분열 스핀들의 회전을 유발하는 섬유에 힘을 발휘. 접착제 미세 패턴을 결합하고 스트레칭의 관심은 힘과 개별 셀의 모양을 독립적으로 제어를 달성하는 것입니다. 그것은 축 스트레칭이인가 된 상태에서, 완벽하게 등방성 둥근 모양으로 난형 세포를 스트레칭 예를 들어 수 있습니다. 세포는 미세 패턴에 엮어되지 않으면 축성 대부분의 세포는 스트레치 축과 정렬 된 장축을 갖는 세포 연신율 결과 스트레칭. 이것은 장축 정렬과 셀에 적용된 스트레칭 효과의 영향을 분리하기 위하여 다음 어렵다.

이 디바이스는 시간이 오래 경과 형광 현미경을 포함한 모든 살아있는 세포 이미징에 적합하고, 약은 실험 기간 동안 추가 할 수 있습니다. 깊은 UV를의 미세 방법 10Azioune에 상세하게 설명했다 등. PDMS 11 패터닝는 설명했다 Azioune 등. 12 프로토콜을 스트레칭 선물 카르 피 등. (13)의 비디오 버전입니다

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프로토콜

1. PDMS의 보호

  1. PDMS의 조각을 잘라 약은 전 장에서 X 20mm 35mm (예를 들어, GelPak, 재료의 표에 나와있는대로)가.
  2. 플라스틱의 상단과 하단에 보호 층을 제거 (필요한 경우)와 페트리 접시를 (처리 문화를 셀 수 없습니다) 플라스틱 PDMS를 배치 핀셋을 사용합니다.
  3. / 분 (30) 진동에서 회 전자에 5 분 동안 70 % 에탄올로 PDMS를 씻으십시오.
  4. 거기에 공기를 유입하여 표면을 건조시킵니다.
  5. 약 5 ㎝의 UV 전구에서 거리에서 5 분 깊은 UV (λ = 180 nm의)와 조명 (램프 참고 용 재료 장을보고, 매개 변수는 다른 램프에 따라 다를 것이다).
  6. 각각의 조각을 PDMS를위한 EDC / NHS 용액 200 μL (용액의 반응성이 시간 만에 붕괴 때문에 그냥 사용하기 전에 준비해야합니다)를 준비합니다. pH가 6.0에서 0.05 M MES + 0.5 M NaCl을 버퍼 1 ㎖를 들어, 설포-NHS의 11.5 밀리그램과 EDC의 19.2 밀리그램을 추가합니다.
  7. 이동조명되지 않은 페트리 접시의 뚜껑에 페트리 접시에서 PDMS의 장. 이는 PDMS의 주변은 매우 소수성 보장하고 다음 단계를 용이하게한다.
  8. EDC / NHS 솔루션을 추가하고 실온에서 15 분 동안 품어.
  9. 물과 EDC / NHS를 씻어.
  10. PLL-g-PEG 용액 (HEPES 10 mM의 pH를 8.6에서 0.5 ㎎ / ㎖)를 첨가하고 3 시간에 하룻밤 실온에서 품어.
  11. 물을 PLL-g-PEG를 씻어. (PLL-g-PEG 기능화) 비활성화 된 PDMS는 4 ℃에서 며칠 동안 저장 될 수있다

2. PDMS의 패터닝

  1. PDMS 시트를 가지고 패터닝 microfeatures 베어링 합성 석영 포토 마스크에 배치 (그림 1 참조). PLL-g-PEG는 포토 마스크의 크롬 측에 직면 베어링 PDMS면을 넣습니다.
  2. 약 5cm의 UV 전구로부터의 거리에 포토 마스크를 통해 12 분 동안 밝히는.
  3. 마스크 + PDMS에 물을 천천히 마스크 오프 PDMS 껍질.
  4. 실온에서 1 시간 동안의 pH 8.6에서의 HEPES 버퍼에서 50 ㎎ / ㎖에서 피브로넥틴 용액으로 배양한다. 그것은 다른 사람에게 ECM 단백질을 사용하는 것이 가능하지만, 이러한 프로토콜이 테스트되지 않았다.
  5. PBS로 씻어.

3. 장치 설치

  1. 스트레칭 장치 (문제 해결을위한 토론 참조)에 이전에 비활성화 된 PDMS를 탑재합니다.
    1. 들것의 고정 부분에 PDMS의 한 쪽을 연결합니다.
    2. PDMS 시트의 너무 많은 클램핑하지 않고 들것의 모바일 부분에 다른 쪽을 고정합니다.
  2. 두꺼운 PDMS 찌르기에 PDMS의 사각형 (22mm X 19mm)을 잘라 (그림 2 참조) 세포와 미디어를 유지하는 풀 (또는 프레임)을 부여하기 위해 내부에 또 다른 사각형을 잘라.
  3. 이 풀을 PDMS에서 실리콘 그리스를 추가하고 의대를 만들 PDMS 시트의 상단에 배치IUM 풀을 유지. 그리스 스트레칭 동안 PDMS 시트에 풀의 활공을 허용합니다.

4. 셀 패터닝

  1. 센과 50 % 자랄 문화 플라스크에서 세포를 분리.
  2. 세포를 카운트하고 200,000 세포 / ml의 농도로 재현 탁 그들을.
  3. 풀의 세포 현탁액 1 ㎖ (자세한 내용에 대한 설명을 참조)를 추가합니다.
  4. 세포 (RPE-1 세포를 10 분 및 HeLa 세포를 20 분 소요되며, 세포 유형에 따라) 10-30 분 동안 패턴에 바인딩하자.
  5. 부드럽게 평형 배지 (배양기에서 매체를 평형)와 부동 세포를 세척하십시오.
  6. 세포가 패턴에 몇 시간 동안 전파하자 (RPE-1은 최소 2 시간이 필요합니다, 헬라 세포는 3 시간이 필요합니다).
  7. PDMS 나누기 경우 증발 매체의 누설을 방지하기 위해 풀의 상단에 커버 슬립을 추가합니다.
  8. 거꾸로 현미경에 장치를 넣어 영상을 시작합니다. 기름 침수 산부인과의 사용을 피하십시오이 때문에 문제를 중심으로 작동하지 않습니다으로 jectives.

5. 스트레칭

  1. X-,-y 및 z 축 (주로 X)의 무대 위치를 보정하는 동안 마이크로 미터 나사를 돌립니다. 스테이지 위치는 PDMS의 확폭 및 포커스의 손실을 상쇄하도록 보정 될 필요가있다. (토론 단락 "스트레치하는 동안"참조).

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결과

이 비디오 프로토콜에서 제시된 방법은 포유 동물 세포의 유사 분열 후퇴 섬유에의 힘의인가를 허용했다. 실제로, 세포 분열 동안, 유사 분열 단계에서, 포유류 세포는 구형 형상을 가지고, 기판에 부착 된 막에 의해 둘러싸인 얇은 액틴 케이블 뒤에 남겨 후퇴. 이 케이블 (수축 섬유) 부문에 가기 전에 셀 구조의 메모리입니다. PDMS 박막의 포토 마스크를 통해 깊은 UV와 미세 패턴 제작 (그림 1)은 세포 접착의 기하학적 제어를 허용했다. 중기의 발병에서 기판을 연신함으로써, 이러한 후퇴 섬유의 일부는 유사 분열 세포의 외피 (도 3)에인가되는 기계적 힘의 결과로 얻어 전지 본체에서 뽑아 하였다. 이러한 힘은 스핀들 축 (9)의 방향을 제어하는 것으로 하였다.

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토론

이 기술은 여러 번 사용하고 철저하게 테스트되어 있지만, 실패한 실험으로 이어질 수있는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다.

PDMS 소개 :

이 작품의 경우, GelPak, 시판 얇은 PDMS 시트를 사용 하였다. 또는 PDMS 시트는 PDMS 믹스에서 직접 캐스팅 할 수 있습니다. 더 재현하고, 사용자 정의 만든 PDMS에 비해 휴식 덜하기 때문에 우리는 GelPak를 사용하는 것이 좋습니다.

장치에 대한 :

이 프로토콜에 사용되는 스트레칭 장치는 "집에서"설계되었습니다,하지만 그 중 하나는 FlexCell의 같은​​ 상용 들것에 미세 기술을 적용 할 수 있습니다. 주문품 옵션은 더 융통성 있고 훨씬 저렴.

장치를 설치 :

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공개 사항

저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

감사의 글

이 작품은 프랑스 문화원 퀴리, 파리,에 의해 설립되었다. 기계 들것 데미안 CUVELIER (문화원 퀴리)에 의해 디자인되고 GREM에서 제조 된 (MECANIQUE-grem.com). PDMS의 패터닝 아마르 Azioune (보르도 II 대학)에 의해 개발되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
GelPakGelPak PF-60-X4다양한 두께/점착도를 사용할 수 있습니다. 한 가지 대안은 PDMS 를 캐스팅하는 것입니다. 자신.
실리콘 그리스GE Bayer SiliconesBaysilone-Paste이것은 생체 적합성
스트레칭 장치GREM mé입니다; canique들것 2011 
EDC (N- (3- 디메틸 아미노 프로필) -N &프라임 ; - 에틸 카르 보 디이 미드 하이드로 클로라이드)시그마3450-20 °C에서 6 개월 안정; C
NHS (N-Hydroxysulfosoxynimide 나트륨 염)Sigma56485습기로부터 보호
Pll-g-peg (PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) 20 mg)SurfaceSolutions (취리히) 
합성 석영 포토마스크Toppan의 표준 이진 포토마스크를 취하십시오
 
소 플라즈마 Sigma F1141에서 Quartz Fibronectin

참고문헌

  1. Vogel, V., Sheetz, M. Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 265-275 (2006).
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  4. Bosveld, F., et al. Mechanical control of morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-jointed planar cell polarity pathway. Science. 336 (6082), 724-727 (2012).
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  11. Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Théry, M., Piel, M. Protein micropatterns: A direct printing protocol using deep Uvs. Methods Cell Biol. 97, 133-146 (2010).
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  13. Carpi, N., Piel, M., Azioun, A., Cuvelier, D., Fink, J. Micropatterning on silicon elastomer (PDMS) with deep UVs. Protoc. Exch. , (2011).
  14. Sinha, B., et al. Cells respond to mechanical stress by rapid disassembly of caveolae. Cell. 144 (3), 402-413 (2011).

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