형광표균의 세균세포 인구에 대한 종 내 경쟁 모니터링

요약

박테리아는 그들의 일생 도중 해롭거나 유익한 돌연변이를 축적할 수 있습니다. 유익한 돌연변이를 축적한 세포 개인의 인구에서 그들의 동료를 급속하게 능가할 수 있습니다. 여기서 우리는 형광으로 표시된 개별을 사용하여 시간이 지남에 따라 세균성 세포 인구에 있는 종 경쟁을 구상하는 간단한 절차를 제시합니다.

초록

박테리아와 같은 많은 미생물은 매우 빠르게 증식하고 인구는 높은 세포 밀도에 도달 할 수 있습니다. 인구에 있는 세포의 작은 분수는 항상 세포에 해를 끼치거나 유익한 돌연변이를 축적했습니다. 돌연변이의 체력 효과가 강한 선택적 성장 이점을 가진 하위 인구를 제공하는 경우에, 이 하위 인구의 개별은 급속하게 경쟁하고 그들의 즉각적인 동료를 완전히 제거할 수 있습니다. 따라서, 유익한 돌연변이를 획득한 세포의 작은 유전적 변화 및 선택 중심축적은 세포 집단의 유전자형의 완전한 변화로 이어질 수 있다. 여기서 우리는 그람 양성 모델 박테리아 부틸리스의형광 표시 개인의 공동 재배에 의해 시간이 지남에 따라 세균 세포 인구에서 각각 유익하고 해로운 돌연변이의 급속한 클로날 팽창 및 제거를 모니터링하는 절차를 제시한다. 이 방법은 세균 세포 집단의 개인 들 간의 종 내 경쟁을 표시하는 것이 쉽고 매우 예시적입니다.

서론

토양 박테리아는 일반적으로 유연한 규제 네트워크와 광범위한 신진 대사 용량을 부여합니다. 두 가지 기능을 모두 사용하면 세포가 쌍백과 단백 동화 경로를 조정하여 주어진 생태 틈새 시장^1에서사용할 수있는 영양소를 위해 동료 및 기타 미생물과 경쟁 할 수 있습니다. 그러나, 박테리아가 그들의 환경에 적응할 수 없는 경우에 그밖 기계장치는 종의 생존을 설명할 수 있습니다. 실제로, 많은 박테리아가 빠르게 증식하고 인구가 높은 세포 밀도에 도달할 수 있기 때문에 인구 하위 인구는 선택적 성장 이점을 가진 세포를 제공하고 그러므로 그들의 적정성을 증가시키는 유익한 돌연변이를 자발적으로 축적할 수 있습니다. 더욱이, 돌연변이 핫스팟 및 스트레스 유발 적응 돌연변이 발생은 부적응된 박테리아^2,3의진화를 용이하게 할 수 있다. 따라서, 연속선택 하에서 돌연변이와 성장의 축적은 동일한^4,5세내에서도 엄청난 미생물 다양성의 기원이다. 자연에서와 마찬가지로, 세균 게놈의 형성은 또한 선택하에 지속적인 재배 때문에 실험실에서 발생합니다. 이것은 기본 연구 및 산업에서 전 세계적으로 사용되는 그람 양성 박테리아 B. subtilis의 길들여지는 것으로 예시됩니다. 1940년대에 B. 서브틸리스는 DNA 손상 엑스레이로 처리되....

프로토콜

1. 한천 접시, 문화 매체, 극저온, 프리컬쳐 준비

1. 성장 매체와 필요한 시약을 준비합니다(재료 및 시약 표 참조).
2. B. 서브틸리스 균주(예:. BP40(rocG⁺ gudB^CR amyE::P_gudB-yfp)및 BP52(rocG⁺ gudB⁺ amyE::P_gudB-cfp)각각 1개와 2개의 활성 GDHs를 발현)^2는 SP 중간 식도 플레이트에 대한 경쟁 실험에서 단일 콜로니를 얻을 수 있다. 플레이트를 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
3. 단일 콜로니를 가지고 4 ml LB 액체 매체를 포함하는 무균 배양 튜브를 접종하십시오. 28°C와 220 rpm에서 하룻밤 사이에 박테리아를 성장시다.
4. 세포가 lyse 또는 산발적으로 피하기 위해 28 °C에서 하룻밤 배양을 성장시다.
5. 표준 분광계를 사용하여 600nm(OD_600)의파장에서 배양물의 광학 밀도를 측정합니다.
6. 배양이 2.0의 OD_{600에 <....}

결과

여기서 설명된 방법은 각각 형광경 CFP와 YFP를 인코딩하는 cfp 및 yfp 유전자로 표지된 B. 서브틸리스 균주로 구성된 세포 집단에서 종 내 경쟁을 시각화하기 위해 성공적으로 적용되었다. 도 3에도시된 바와 같이, 이 방법은 매우 예시적인 방식으로 종내 경쟁을 시각화하는 데 사용될 수 있다. 작은 부위에 샘플을 발견함으로써 세포 집단의 복제 구성을 한눈에 볼 수 있게 되었다. 정량 분석에 적합하지는 않지만, 이러한 접근법은 처음에 두 균주를동일한 양으로 포함하는 세포 집단의 개발에 대한 상이한 성장 파라미터(즉 질소 소스)의 효과를 대략 추정하는 데 유용하다(그림3). 더욱이, 소규모 접근법에서 동일한 성장 조건하에서 재배된 상이한 B. 서브틸리스 균주의 체력은 단일 한천판을 사용하여 시험될 수 있다. 정량 적 해석의 경우 한천 판의 전체 표면에 샘플을 전파하는 것이 좋습니다. 이것.......

토론

박테리아^16의경쟁력있는 적합성을 분석하기 위해 몇 가지 방법이 개발되었습니다. 많은 경우에 박테리아는 다른 항생 저항 카세트^17로표지되었습니다. 우리의 접근 방식과 유사하게, 항생제 저항 카세트를 가진 세포의 라벨링은 정의된 성장 조건하에서 박테리아의 경쟁적 적합성의 평가를 허용합니다. 더욱이, 이 방법은^{염색체(17)에}특정 궤적에서 서로 다른 세포의 경쟁력있는 적합성을 결정하는 데 사용될 수 있다. 그러나, 경쟁 적인 체력을 모니터링 하는 항생제 저항 카 세트를 사용 하 여 몇 가지 단점이 있다. 저항 유전자의 발현은 주로 불평등한 강도를 갖는 프로모터에 의해 구동되기 때문에 항생제에 대한 내성을 부여하는 효소는 아마도 다른 수준에서 생산된다. 따라서, 약한 피트 니스 효과이 접근 으로 감지 되지 않을 수 있습니다. 우리의 접근에서, 둘 다 형광유전자는 동일 선택 마커와 통합되고 그들의 발현은 동일 프로모터^2에의해 구동됩니다. 항생제 내성 카세트로 경.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
(NH4)2SO4	Roth, Germany	3746
Agar	Difco, USA	214010
Ammonium ferric citrate (CAF)	Sigma-Aldrich, Germany	9714
CaCl2	Roth, 독일	5239
Glucose	Applichem, 독일	A3617
글리세롤	Roth, 독일	4043
K2HPO4• 3H2O	Roth, 독일	6878
KCl	Applichem, 독일	A3582
KH2PO4	Roth, 독일	3904
KOH	Roth, 독일	6751
MgSO4• 7H2O	Roth, 독일	P027
MnCl2	Roth, 독일	T881
MnSO4• 4H2O	Merck Millipore, 독일	102786
NaCl	Roth, 독일	9265
영양 육수	Roth, 독일	X929
글루타민산 칼	Applichem, 독일	A3712
Tryptone	Roth, 독일	8952
Tryptophan	Applichem, 독일	A3445
효모 추출물	Roth, 독일	2363
1.5 ml 반응 튜브	Sarstedt, 독일	72,690,001
2.0 ml 반응 튜브	Sarstedt, 독일	72,691
15 ml 나사 캡이 있는 플라스틱 튜브	Sarstedt, 독일	62,554,001
페트리 접시	Sarstedt, 독일	82.1473
1.5 ml 폴리스티렌 큐벳	Sarstedt, 독일	67,742
15 ml 유리 배양 튜브	브랜드, 독일	7790 22
100 ml 알루미늄 캡이 있는 쉐이크 플라스크	브랜드, 독일	928 24
멸균 10 ml 유리 피펫	브랜드, 독일	278 23
인큐베이터(28 및 37 ° C)	New Brunswick	M1282-0012
표준 피펫 세트 (2-20 μ 엘, 10-100 μ 엘, 100-1,000 μ l)	Eppendorf, Germany	4910 000.034, 4910 000.042,
1.5 및 2 ml 반응 튜브용 탁상용 원심분리기	Thermo Scientific, Heraeus Fresco 21, Germany	75002425
15 ml 플라스틱 튜브용 탁상용 원심분리기	Heraeus Biofuge Primo R, 독일	75005440
표준 분광 광도계	Amersham Biosciences Ultrospec 2100 pro, Germany	80-2112-21
입체 형광 현미경	Zeiss SteREO Lumar V12, 독일	495008-0009-000
냉동고 (-20 및 -80 ° C)	-	-
냉장고 (4 ° C)	-	-
Autoclave	Zirbus, LTA 2x3x4, 독일	-
pH 측정기	pH 측정기 766, Calimatic, Knick, Germany	766
Vortex	Vortex 3, IKA, Germany	3340000
Balance	CP2202S, Sartorius, Germany	)으로
Staedler, Germany	317-9
파워 포인트 프로그램	Microsoft, 미국	-
Office Excel 프로그램	Microsoft, 미국	-	데이터 처리 프로그램
Adobe Photoshop CS5	Adobe, 미국	CS6로 대체,	이미지 처리 용 컴퓨터 프로그램
컴퓨터	PC 또는	Mac-ZEN
pro 2011 소프트웨어 입체 형광 현미경 용	Zeiss, Germany	410135 1002 110	AxioCam MRc Rev. Zeiss
Specific solution recipes
SP Medium
8 g 영양 육수
0.25 mg MgSO4• 7H2O
1g KCl
15g 한천, 필요한 경우 고체 SP 매체
H2O			오토클레이브와 함께 1L 추가; C
1 ml CaCl2 (0.5 M), 여과
1 ml MnCl2 (10 mM), 여과
2 ml 구연산암모늄(CAF, 2.2 mg/ml), 여과
LB Medium
10 g 트립톤
효모 추출물
5g, NaCl
고체 LB 매체			필요한 경우
H2O			오토클레이브와 함께 1L를 추가합니다. C
C-Glc 최소 매체
200 ml 5 x C 염
10ml L-트립토판(5mg/ml), 여과
10ml 구연산암모늄 철산염(CAF, 2.2mg/ml), 여과
10ml III' 염
25ml 포도당(20%)			121 °에서 20분 동안 고압멸균;
C 멸균 H2O
CE-Glc 최소 매체
200 ml 5 x C 염
10ml L-트립토판(5mg/ml), 여과
10ml 암모늄 구연산철(CAF, 2.2mg/ml), 여과
’
20 ml 글루타메이트 (40 %)
, 25 ml 포도당 (20 %), 121 °C에서 20 분 동안 오토 클레이브; C
는 멸균 H2O
20 g KH2PO4
80 g K2HPO4• 3H2O
16.5 g (NH4)2SO4
add 1 L 멸균 H2O			오토클레이브에서 20분 동안 121°°C; C
III' 염
0.232g MnSO4• 4H2O
12.3 g MgSO4• 7H2O
는 멸균 H2O와 함께 1L를 추가하고 121°°C에서 20분 동안 오토클레이브합니다. C
40 % 글루타메이트 용액
200g L- 글루타민산은
약 80g KOH
멸균 H2< / sub>O			오토 클레이브로 0.5L를 121 °C에서 20 분 동안 추가합니다. C
< 강>0.9 % 식염수 (NaCl) 용액 < / 강력 >
1L을 멸균 H2< / sub>O			오토 클레이브와 함께 121 °deg에서 20 분 동안 추가합니다. C
50 % 글리세롤 용액
295 ml 글리세롤 (87 %)
멸균 H 2 < / sub>O			오토 클레이브와 함께 0.5 L를 추가합니다. C
박테리아 (모든 균주는 Bacillus subtilis 균주 168)
Bacillus subtilis BP40 (rocG+ gudBCR amyE::P gudB-yfp)	실험실 균주 수집
Bacillus subtilis BP41 (rocG+ gudBCR amyE::P gudB-cfp)
Bacillus subtilis BP52 (rocG+ gudB+ amyE::P gudB-cfp)
Bacillus subtilis BP156 (rocG+ gudB+ amyE::P gudB-yfp)

륨 검은색 펜(영구 마커대체다운로드용 15g 한천, 121°°에서 20분 동안살균 살균10g, 용 15g 한천, 121°C에서 20분 동안로 살균로 살균10ml III에 의해 멸균염5 x C 염과 함께 1 L을 추가합니다를 첨가하여 pH를 7.0으로 조정하고, 121 °C에서 20 분 동안