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방법 논문

라이브 식세포에 Phagolysosome 속생의 연구

13.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/51201

⸱

2014년 3월 10일

 ,  , 
1Research Group Phagosome Biology, Helmholtz Centre for Infection Research, 2Division of Mycobacterial Research, National Institute for Medical Research

이 논문에서

초록

식세포는 삭제 및 된 phagosomes에 침입하는 미생물을 제거함으로써 선천성 면역 시스템에서 중요한 역할을한다. 성숙의 phagosome는 초기의 phagosome는 세포질에있는 다양한 세포 소기관 및 구획이 잘 조율 된 상호 작용을 통해 급격한 변화를 겪게되는 동안의 복잡하고 단단하게 통제 된 과정입니다. 자신의 세포 용해 및 살균 속성으로 된 phagosomes를 부여하는에 의한 식세포의 생리 기능을 위해 필수적이며이 과정은, 리소좀과 phagosomes를위한 성숙의 마지막 중요한 단계로 간주됩니다 phagolysosomes의 생합성로 된 phagosomes의 융합에 절정에 이른다. 이 보고서에서, 우리는 phagolysosome의 생합성의 특징이다 콘텐츠 전달을의 phagosome하는 리소좀의 역동적 인 과정의 정성 및 정량 분석​​을 위해 라이브 셀 이미징 기반 방법을 설명합니다. 이 접근법은 phagocy 모델로의 IgG 코팅 된 마이크로 비드를 사용내강 리소좀화물 프로브로 tosis 및 형광 - 복합 덱스 트란 분자, 시간 경과 이미징 및 공 초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 라이브 대식 세포에서 실시간으로 된 phagosomes에 lysosmal 콘텐츠의 동적 전달을 수행하기 위해. 여기에 우리가 자세히 배경, 준비 단계 및 기타 실험실에서이 방법의 쉽고 정확한 배치를 가능하게하는 단계별 실험 설정에 대해 설명합니다. 우리의 기술 방법은, 간단한 강력한, 가장 중요한 것은, 쉽게 다른 시스템과 같은 각종 식세포 종류, 기능 상실 실험 상이한 프로브의 사용과 같은 여러 가지 실험 설정에서 phagosomal 상호 작용 및 성숙을 연구하기 위해 적응 될 수 있으며, 식세포 입자.

서론

대 식세포 등의 전문 식세포는 면역 시스템에서 중요한 재생할 수 있습니다. 선천성 면역 시스템 방어의 첫 번째 라인 인 이외에, 그들은 또한 역할 1-3 제시 그들의 시그널링 및 항원을 통하여 적응 면역의 활성화에 중요한 역할을한다. 전문 식세포의 기능이 다방면 동안, 성숙의 phagosome는 전문 식세포 4,5의 살균 및 항원 처리 기능의 중요한 골격이다. 수용체 매개 말림 및 박테리아와 같은 식세포 대상의 이해에 따라, 초기의 phagosome는 상호 작용과 세포 내 이입 네트워크의 구획 및 여러 다른 세포 소기관 6과의 교류의 복잡하고 잘 조율 된 순서를 통해 간다. 화합물의 성질은 이러한 셀룰러 엔티티뿐만 아니라 규제와 교환 및 융합 이벤트의 타이밍은 내강 phagosomal의 환경 및 phagos을 결정OMAL 막 조성과, 따라서 7, 성숙의 phagosome 8의 운명.

성숙의 phagosome의 생리 학적 관련성은 탈출 체포 또는 성숙의 phagosome 9를 파괴하기 위해 다양한 세포 내 병원균에 의해 사용되는 다양한 전략을들 수있다. 가수 분해 효소 및 성숙의 phagosome 7 안티 박테리아 요소 벌크 그들을 부여한다 늦은 엔도 솜 / 리소좀 구획의 phagosome의 융합, 이러한 전략의 대부분은 직접 또는 간접적으로 성숙의 phagosome 프로세스의 최종적이고 중요한 단계를 방지 , 8,10. 자연의 생리 학적 상태가 활용되고있는 특정 실험 설정에서 영향을 긍정적으로 또는 부정적으로되는 경우이 마지막 중요한 단계의 분석은 따라서 phagosomes를 성숙의 상태에 대해 강한 지표를 저희에게 제공 할 수 있습니다.

늦은 엔도 좀 / 리소좀 함설정 해제는 일반적으로 각종의 존재에 의해 초기 세포 내 이입 구획에서 정의한 고유 세포 내 이입 경로의 말단 구획, 특정 마커 분자를 무대로 간주된다. 예를 같은 사람 11 중 리소좀 관련 막 단백질 (램프)로 가수 분해 효소 또는 막 구성 요소에 대한. 단말 내 이입이 구획-금후 리소좀는 또한-식세포 / 이입 통로 (12)의 단부에 소화의 최종 단계를 위해 주요 위치 역할을 간단히 언급. 이러한 방식으로, 난소 화성 프로브는 세포 외 환경에서의 엔도 시토 시스와 macropinocytosis 통해로드 될 수 있고, 그것은 흡수 및 체이스의 정의 사이클에 따라도 13, 14를 축적 리소좀으로 세포 내 이입 경로를 통해 반송. 15-17 endocyticprobes 등 유기 난소 화성 고분자 덱스 트란 형광 현미경 형광 - 복합 프로브는 일반적으로 사용됩니다.

, 우리는 된 phagosomes에 리소좀 내강 내용의 전달을 분석하여 성숙의 phagosome을 조사하기 식세포화물로 IgG의 코팅 마이크로 비즈의 활용에 대해 설명합니다. 라이브 골수 유래 대 식세포 (BMM) 및 공 초점 레이저 주사 현미경 시간 경과 비디오 영상에서 리소좀의 즉시 검출 마커로 형광 - 복합 덱스 트란 프로브를 사용하여, 우리는 최고를 가진 된 phagosomes에화물 배달의 동적 프로세스를 따라야 시간 해상도. 우리는 통계적으로 Microsoft Excel을 사용하여 분석 및 그래프 패드 프리즘 소프트웨어 (14, 18)를 사용하여 제시 수집 시간 경과 영상 데이터는 오픈 소스와 무료로 사용할 이미지 분석 소프트웨어, 피지 (또는 ImageJ에)를 사용하여 평가 될 수있는 방법에 대해 설명합니다.

우리의 방법에 대한 설명에 이어, 유사한 실험의 phagosome 성숙에 미치는 영향을 조사하기 위해 수정 된 설정 요인을 사용하여 설계 될 수 있으며, 거의 모든 OT부착 차 또는 세포 라인 포식 세포의 그녀의 유형을 포함하여 기능 실험의 유전 손실 유전자 아웃을 노크 노크 다운, 돌연변이 또는 융합 단백질, 식세포 - 대상, 마이크로 비드 코팅 화합물, 엔도 좀 / 리소좀 프로브 및 요인 등의 표현 그 중에서도 사이토킨, 화학 억제제 또는 siRNA의이 방법의 기본적인 접근 방식에 적용될 수있는 모든 변수이다.

우리는 다음과 같이이 방법의 목표와 기본 요구 사항을 정의 :

  • 방법의 목표 : 식세포의 살아있는 세포에서 높은 시간 해상도와 성숙의 phagosome의 직접 양적 및 질적 관찰과 분석을 가능하게하는.
  • 식세포화물 : 적절하게 코팅 된 미세 입자 또는 생물학적 대상입니다. 여기에서 우리는 쉽게 구단-γ 수용체 매개 식균 작용을 통해 내장되어 3 μm의 구형 폴리스티렌 미립자 IgG의 코팅 사용합니다. 또한, 모든 미생물 또는 코팅 된 마이크식세포 수용체는 세포에 존재하는 roparticle가 사용될 수있다.
  • 식세포 : 해당 식세포 수용체를 표현 자기편 식세포. 여기에서 우리는 풍부 구단-γ 수용체를 표현 마우스 기본의 BMMs를 사용합니다. 또한, 수지상 세포 (DC), 단핵구 또는 식세포 상피 세포 또는 유전자 돌연변이 또는 녹아웃 변형이 사용될 수있다.
  • 리소좀화물 : 찬란 리소좀 프로브. 여기에, 텍사스 레드 - 복합 70,000 킬로 달톤의 덱스 트란 (Dex70kD)는 리소좀의 내강화물로 사용됩니다. 대안 적으로, 산도있는 분해 능력으로 phagosomal 속성에 대한 세포 구획 또는 세포 기관, 또는 적절한 프로브의 형광 검출 마커, 성숙의 phagosome의 진행을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
  • , 예를 들어 분자, 화합물, 유전자 노크 다운, 또는 할 수 돌연변이 단백질의 일시적 발현 신​​호 : 요인에 영향을 미치는. 여기, 우리는 FORG있다간단히하기 위해 이러한 요소 중 하나를 사용하지만, 돌연변이 단백질 발현 및 Kasmapour 등. 18 된 phagosomes의 식균 작용 또는 상황과 이동성에 영향을 / 수있는 모든 요소를 참조하십시오 노크 다운에 영향을 미치는 요인과 최근의 예를 들면, 또는 성숙 된 phagosomes와 상호 작용하는 구획은 잠재적으로 사용될 수있다.

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프로토콜

이 프로토콜의 동물 관리 및 모든 절차는 기관 및 국가의 지침을 따르십시오.

"Π-"사전으로 표시됩니다 준비를 준비합니다.

1. BMMs의 준비

  1. 자궁 전위에 의해 생쥐의 컬링을 수행합니다.
  2. 조직에서 대퇴골과 경골 뼈, 무료 뼈를 제거하고 골수의 접근을 위해 양 끝을 잘라.
  3. 얼음처럼 차가운 PBS 또는 다음 단계까지 얼음에 100 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신 100 U / ㎖ 페니실린, 보충 얼음처럼 차가운 DMEM 배지 (뼈를 유지합니다.
    참고 : 오염의 위험을 최소화하는 클래스 II 바이오 외상 하에서 다음과 같이 실시한다.
  4. 1 ML의 주사기에 부착 된 26 G (0.45 ㎜) 바늘을 사용하여 차가운 PBS + 페니실린 / 스트렙토 마이신 수질 공동을 세척합니다.
  5. 10 분 350 XG에 부드러운 원심 분리하여 펠렛 세포는 BMM 메드에서 펠렛을 재현 탁멸균 미생물학 IUM 플레이트는 배양 접시를 noncoated.
    1. BMM 매체의 제조
      • 둘 베코의 수정 이글스 중간 DMEM
      • 10 % 불 활성화 FCS
      • 20 % 마우스 섬유 아세포 L929 세포주의 배양 상등액 (대 식세포 콜로니 자극 인자, M-CSF의 소스)
      • 5 % 말 혈청
      • 2 MM의 글루타민
    2. L929 세포주의 배양 배지의 제조;
      • RPMI (로즈웰 파크 기념 연구소) 1640 배지
      • 10 % 불 활성화 FCS
      • 2 MM의 글루타민
    3. 마우스 섬유 아세포 L929 세포주의 배양 상등액의 제조;
      • 합류 L929 세포는 175cm에서 배양 1:4 분할 된 20 ㎖ L929 중형 및 배양 상청을 사용하여 2 일간이 플라스크는 48 시간 후에 수집하고, 여과하고 BMM-배지에 첨가
  6. 에서 플러시 세포를 품어CO 2 분위기 5 %에서 37 ° C에서 인큐베이터에서 대퇴골.
  7. 배양의 각 48 시간 (최대 72 시간) 한 후, 매체를 대기음 최대 10 일 동안, 신선한 BMM 매체로 대체합니다. 유동 세포 계측법에 의해 테스트로 세포의 95 % 이상은 CD14에 양성이었다. CD14은 대 식세포에 의해 주로 발현 패턴 인식 수용체이다. 이 수용체 양성 세포의 비율을 결정하여, 부착 BMMs의 순수 배양이 생성되었습니다.

주의 : 다른 세포 유형이 사용되면 그에 따라 세포 준비 및 배양.

2. 식세포화물로 마이크로 비즈의 코팅

  1. 1 ㎖ 구슬 현탁액의 준비를 위해, 2.5 %의 400 ㎕를 3 μm의 카르 폴리스티렌 마이크로 입자, 또는 다른 미세 입자를 사용합니다.
  2. 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 비드 현탁액을 전송, PBS로 3 회 세척하고 500 MM 2 100 ㎕를 추가 - (N-모르 폴리 노) 에탄ulfonic 산 나트륨 염, 비드 펠렛의 pH 6.7에서 MES 버퍼.
  3. 멸균 DDH 2 O 50 μL에 50 μg 마우스 IgG의 (폴리 클로 날 IgG 항체)를 녹여 구슬 서스펜션을 추가 할 수 있습니다.
  4. 멸균 DDH 2 O (450 μL)으로 1 ㎖에 현탁액을 입력합니다.
  5. RT에서 회전하는 바퀴에 15 분을위한 솔루션을 품어.
  6. ML 10 ㎎ /의 농도 EDAC 가교제, N-(3 - 디메틸 아미노 프로필)-N'-에틸 카르 보디이 미드 히드로 클로라이드를 준비하고 비드 현탁액에 14 μL를 추가한다.
    참고 : EDAC 크로스 링크 비즈의 표면에 카르복실기와 IgG의 그룹을 아미노 및 비드 표면에서의 IgG의 고정화를 촉진한다. 이 구슬의 이해에 중요하기 때문에이 솔루션은 새로 제조되어야한다.
  7. 실온에서 1 시간 동안 회전 바퀴에 서스펜션을 품어.
  8. EDAC 가교제의 14 μl를 추가하고 실온에서 1 시간 동안 회전 바퀴에 서스펜션을 품어.
  9. 마이크로 원심에서 2 분 동안 10,000 XG에서 현탁액을 원심 분리기.
  10. 비즈 중지 버퍼에 펠렛을 재현 탁하고 2 분 동안 10,000 XG에서 솔루션을 회전시켜, 가교 반응을 중지하기 위해 스톱 버퍼 (10 MM 트리스, 산도 9.4에서 1 % 트리톤-X 100)의 3 배 씻으십시오.
  11. PBS로 3 배 구슬을 세척하고 1 ML PBS에서 펠렛을 재현 탁.
    선택 사항 : 30 ~ 50 μL의 작업 분주을 준비합니다.
  12. 더 이상 3-4 주 이내에 4 ℃에서 IgG의 코팅 비드 현탁액을 저장하지 않고 현탁액을 동결 할 수 없다.

참고 사항 : 0.02 %의 최종 농도 (w / v) 박테리아 성장 및 오염을 방지하기 위해 현탁액에 첨가 될 수의 나트륨 아 지드와 같은 방부제. 이 경우 종래의 사용에 비즈의 세탁 방부제의 세포 독성 효과를 피하기 위해 수행되어야한다. 2 분 동안 10,000 XG에서 현탁액의 나누어지는 원심 분리기 다시하여 구슬을 세척PBS의 펠렛을 일시 중단. 세탁 3 회 반복합니다.

3. 덱스 트란 프로브 스톡 용액의 조제

  1. 텍사스 레드 70,000 킬로 달톤을 녹이고, 20 밀리그램에서 PBS에있는 덱스 트란 (Dex70kD)는 제조업체의 지침에 따라, -20 ° C에서 / ㎖ 및 저장.
    참고 : 몇 개월까지 -20 ° C에서 주식을 유지, 또는 4 ° C에서 몇 주 동안, 제조 업체의 설명서를 참조하십시오.
  2. (희석 될 농축 된 용액을 몇 배 약 1 ㎎ / ㎖에서 (DMEM, 10 % FCS, 2 mM의 L-글루타민) 완전한 DMEM 세포 배양 배지에 희석하여 재고 실험에 대한 덱스 트란 용액을 제조 세포에 추가하기 전에 20 ㎍ / ㎖의 최종 작업 농도).
  3. 솔루션을 균질화하고 나중에 이미징 동안 유물 세대로 이어질 수 집계를 해소하기 위해 5 분 동안 덱스 트란 나누어지는 초음파 처리하기 위해 초음파 수조를 사용합니다.
  4. 최대 g에서 원심 분리기마이크로 원심에서 5 분 솔루션에서 분해되지 않은 수풀이나 오염 물질을 제거하는 데 필요한 권한입니다.
  5. 조심스럽게 튜브의 하단에 펠릿을 피하면서 신선한 튜브에 상청을 이동하고 완전 DMEM 세포 배양 배지에서 20 ㎍ / ml의 최종 농도로 작동 용액을 희석.
  6. 0.2 μm의 주사기 장착 필터를 사용하여 필터 멸균 솔루션입니다.

4. 덱스 트란 미리로드

  1. 시드 라이브 세포 이미징 유리 바닥 접시에있는 세포 및 부착 및 적응을 위해 (5 % CO 2 분위기에서 37 ° C에서) 적어도 12 시간 동안 배양한다.
    참고 : 접시 당 (네 구획까지) 여러 실험을 수행 할 수 있도록 가능한 세그먼트 유리 바닥 요리가 있습니다.
  2. 프로토콜 3에 설명 된 DMEM 용액에 덱스 트란을 준비한다. 37 ℃의 물을 욕조를 사용하여, DMEM 용액의 준비 덱스 트란을 따뜻하게
  3. 대기음 매체차 흡수 2-8 시간 동안 CO 2 분위기 5 %에서 37 ° C에서 조심스럽게 세포에 덱스 트란 솔루션을 추가하고 품어.
    계획 및 사용 실험을 반복 할 때 엄격하게이 기간에 유지되는 프로브와 세포 유형에 따라 프로토콜을 최적화 참고. 이 세포 내 이입 경로에있는 덱스 트란 축적의 프로필과 실험 따라서 재현성을 위해 필수적입니다.
  4. 배와 데워진 완전한 DMEM 매체 세포를 씻으십시오; 대기음 매체와 신선한 배지로 조심스럽게 세포를 씻어.
  5. CO 2 분위기 5 %에서 37 ° C에서 4-12 시간 동안 완전한 DMEM 배지로 세포를 품어.
  6. 데워진 완전한 여과 페놀 레드가없는 DMEM 배지로 한 번 세포를 씻으십시오.
  7. 최적의 이미징 결과를 위해, 영상의 시작하기 전에 예비 가온 완벽한 필터링 페놀 레드가없는 DMEM 배지 최소 30 분으로 변경. 페놀 레드 배경 잡음을 증가 형광 신호의 담금질을 일으킬 수도따라서 이미지의 명암과 선명도를 줄일 수 있습니다.

주 : 사용되는 프로브 및 세포의 종류에 따라 미리 계획된 최적화 프로토콜에 따라, 현미경 및 미리 촬상 설정을 설정한다.

5. IgG의 코팅 구슬을 추가

  1. RT에 preprepared 1 % 구슬 현탁액의 나누어지는 평형 2 ~ 3 분 동안 초음파 수조에서 초음파 처리.
  2. 오염 (좋은 시작 농도는 1 μL / 2cm 2 접시 표면입니다)의 위험을 최소화하기 위해 클래스 II 생물 안전 캐비닛에서 완전한 여과 페놀 레드 무료 DMEM 매체에 1 % 구슬 현탁액의 1-6 μl를 추가합니다.
    참고 : 여기에 BMMs는 25,000 세포 / 웰에 접종하고, 1 % 주식 비드 현탁액의 10 μL가 접시에 배지에 첨가 하였다. 이 약 15:1 구슬 / 세포 비율을 동일합니다. 비 사용 비드 소재하는 세포의 유형에 따라 조정되어야한다; 난.전자. 폴리스티렌 비즈가 큰 숫자에 훨씬 빠르고, 따라서 자기편 세포와 접촉 싱크대 온 반면, 라텍스 구슬, 낮은 밀도를 가지고 신속하게 바닥에 가라 앉지 않습니다.
    참고 : 실험에 따라서는, 사전에 관측 될 영역을 선택하는 장점이 될 수있다. 비드 현탁액을 따라서 양호한 흡수 사건을 관측 할 확률을 증가만을 유리 바닥 접시의 특정 영역에 첨가 될 수있다.
  3. 구슬의 밀도 구름이 부드럽게 유리 바닥 접시에 현탁액을 피펫으로 확산 될 수있다.
  4. 구슬은 유리 바닥 접시의 바닥에 가라 앉아 부착 식세포와 같은 평면에서 약 때까지 기다립니다.
  5. 관심 (ROI)의 영역에 초점을 시간 경과 영상을 시작합니다.

참고 : 촬상이 사용되는 이미징 시스템에 따라 진행되는 동안은, 그 STA 포커스 미세 조정할 필요가있을 수도부 합성 및 세포 관찰의 이동성. 그러나 이것이 불가능 렌더링 수 있음을 강력하게 재 집중의 결과로 초점이 비행기에서 이탈 된 phagosomes의 적절한 분석을 확인합니다.

6. 영상

최적의 영상 품질을 위해 아래의 일반 지침을 따르십시오;

  1. 이러한 레이저 주사 또는 스피닝 디스크 시스템으로 공 촛점 이미징 시스템을 사용한다.
    참고 : 라이카 LAS AF 소프트웨어에 의해 제어 및 환경 제어 챔버를 장착 한 라이카 TCS SP5 AOBS 레이저 스캐닝 공 초점 현미경이 시간 경과 비디오 영상을 위해 여기에 사용되었다.
  2. 이러한 등 스캐닝 속도, 배율, 해상도 등의 촬상 설정을 최적화. 사용되는 시스템에 따라 7-20 초마다의 프레임 레이트에 대해 허용하는 방법.
    참고 : 여기에, 200 Hz에서 스캔 속도 2 배 스캐너 줌과 512 X 512 픽셀의 열매의 해상도에서 2 배의 라인 평균3 ~ 5 초 / RAME 사이의 녹화 시간에 lted. 매 10 초에있는 프레임의 속도는 최소 120 분의 지속 시간과 시간 경과 영화를 기록하는 데 사용되었다.
  3. 사용 영상 시스템 및 프로브 (들)에 따라 적절한 여기 / 방출 설정을 사용합니다.
    1. 과도한 광 표백을 방지하기 위해 설정을 최적화.
      참고 : 여기에, 텍사스 레드 덱스 트란 70kD는 DPSS (561 나노 미터) 레이저와 발광 빛이 610 nm에서 방출 피크 600-650 nm에서 라이카 하이브리드 검출기 (유압)에 의해 검출 된을 사용하여 흥분했다. 레이저 강도는 신호 강도에 적응 및 형광 물질 (들)와 세포의 레이저 광의 포토 독성 효과의 광 표백을 최소화하기 위해 가능한 한 낮게 유지되어야한다. 일반적으로, 적절하고 안정적​​인 신호 강도를 구하는 스캐닝 속도, 라인 평균화, 스캔 해상도, 프레임 간격과 영상의 재생 시간을 양립하고 비드 흡수와의 phagosome 성숙 계의 전체 재생 시간을 포착하는 것이 중요운.
  4. 그들은 형광가 결합되지 않은 경우 구슬을 관찰 시야 (BF) 채널을 포함합니다.
    주 : 텍사스 레드 채널 옆 BF 채널 비드를 시각화하는데 사용되었다 동일 DPSS 레이저는 광원 및 신호가 포토 멀티 플라이어 (PMT) 검출기로 검출되었을 때 사용 하였다.
    참고 : 한 부씩 인쇄 될 데이터를 획득 할 때 동일한 녹화 설정을 적용해야합니다. 대부분의 중요한 매개 변수는 다음과 같습니다 여기 레이저 강도, 검출기 설정, 인수 설정, 배율과 프레임 간격. 관측 데이터 포인트 (매 12 초에서 프레임을 다른 세트로 매 7 초에 인수 한 프레임 관찰을 대조하는 등)를 중복하지 않으므로 동일한 프레임 간격을 사용하지 않는 것은 곡선 평균 단계를 필요로합니다. 이 데이터는 평가를 위해 필요한 단계를 증가하고 OriginLab에서 같은 곡선 평균화 기능을 가진 소프트웨어를 추가, '필요의 기원 프로 통계 소프트웨어 ( http://www.originlab.com/ ).
  5. 바람직하게는, 사용되는 영상 시스템의 기본 파일 형식으로 시간 경과 비디오를 저장하고 압축 된 형식으로 수출하지 마십시오.

주 : (. LIF) 여기서, 시간 경과 영화를 본 뒤 피지에서 열려 가져온 기본 라이카 LAS AF 형식의 파일에 저장되었다. 피지가 포함 된 바이오 형식 가져 오기 플러그인을 사용하여 대부분의 현미경 제조 업체에서 기본 파일 형식을 읽을 수 있습니다. JPG 또는 TIFF 또는 AVI 컨테이너 형식의 비디오 파일로 이미지 시리즈에서 시간 경과 동영상 파일을 보내면 필요하거나 권장하지 않습니다. 네이티브 현미경 파일 포맷을 사용하여, 손실 압축 알고리즘 (예를 들면 JPEG)을 피함으로써 일본어 관찰에서 최적의 이미지 품질을 유지하는 것 외에도 확실히 해당 파일의 메타 데이터 (타임 스탬프, 배율, 레이저 및 수집 강도검출기의 설정 등) 보존과 피지에 사용할 수 있습니다. 어떤 이유로 시간이 경과 비디오 파일을 분석을위한 다른 형식으로 수출해야하는 경우, 이러한 TIFF 이미지 시리즈와 별도의 RGB 색상 (빨강, 녹색, 파랑)이 이미 채널 등의 압축 파일 형식을 사용해야합니다 피지가 종종 성공적으로 내 보낸 파일에 다른 색상 채널에서 BF 채널을 분리 할 수​​있는 단계. 또한, 참고로 원래의 현미경 파일을 보존해야합니다.

7. 시간 경과 영화 분석

  1. ImageJ에, 피지 또는 유사체 신호 연결 분석 기능을 제공하는 다른 소프트웨어를 사용합니다.
    참고 : 여기에, 피지는 시간 경과 영화의 분석에 사용 하였다. 피지에서 무료로 다운로드 할 수 개편 도구 메뉴 추가 기본 플러그인과 이미지 처리 패키지를 포함하는 ImageJ에 배포합니다 http://fiji.sc . 이 종파에 설명 된 프로세스이온은 그림 2에 묘사되어있다.
  2. "열기", "파일"을 클릭하고 파일을 선택하거나 드래그 피지에 파일을 놓아에 의해 피지에서 파일을 엽니 다.
  3. 다음과 같은 옵션을 선택합니다;
    1. 보기를 스택 :보기 Hyperstack와 스택,
    2. 색상 옵션 : 컬러 모드는 색상 화,
    3. 별도의 창으로 분리 채널 스플릿 채널 (기록 된 모든 RGB 색상 채널에 대한 별도의 창이 열립니다).
  4. 경우에 이미지 시리즈는, "파일" "가져 오기", "이미지 시퀀스"대상 이미지 시리즈가 포함 된 폴더에있는 모든 이미지 파일을 선택으로 이동하여 피지에 시리즈를로드, 사용됩니다.
    1. 필터를 설정하고 인스턴스에 대한 일련의 로딩 이미지를 선택, 조건;
      1. 이미지 수 :로드 될 프레임 수.
      2. 이미지를 시작하는 시리즈의 시작 프레임 인 이미지.
      3. 증가 : 증가 사이에프레임 (등 모든 프레임, 초당 프레임,.)로드 할 수 있습니다.
      4. 파일 이름이 포함되어 있습니다 ( "채널 1"의 이미지가 멀티 채널 시간 경과 비디오의 색 분리 한 후 표시되는 방법을 일반적으로는 "C001"을 설정하여 예를 들어) 파일 이름을 사용하여 특정 채널에 대한 필터링.
  5. , "... 스케일을 설정합니다", "분석"을하려고 상자 "글로벌"을 확인하고 "스케일을 제거합니다"를 클릭하여 확장을 제거합니다.
    주 :이 단계는 서로 다른 배율을 평가하여야한다 다양한 실험 세트에 대해 사용 된 경우의 화상의 픽셀 기반 분석을 허용한다. 배율 설정이 항상 일정하게 유지되었으며 기본 현미경 파일을 직접 피지에 가져온 경우 피지 현미경 파일의 메타 데이터의 확대와 규모의 데이터를 이해하고 사용할 수 있습니다,이 단계는 건너 뛸 수 있습니다.
  6. 측정 매개 변수를 설정"지역", "표준 편차", "통합 밀도", "표시 레이블"과 "회색 값을 평균", "설정 측정", "분석"로 이동하고 다음 상자를 선택하여의.
  7. 측정하고, "OK"로 확인 될 프로브에서 신호를 포함하는 컬러 채널로 재 지정합니다.
  8. 측정이 시작하여야하고 윈도우의 상부 에지 클릭 BF 채널 창을 선택하는 프레임으로 이동.
  9. 내면 비드에 원형의 투자 수익 (ROI), 즉 관심 영역 (ROI)을 선택합니다 "타원형 선택 도구"를 사용합니다. 선택은 BF 채널에서와 같이 볼 수 비드의 바깥 쪽 가장자리에 단단히 장착되어 있는지 확인합니다.
    참고 : PC를 사용하는 경우 원형 투자 수익 (ROI)을 보장하기 위해 선택 도구를 사용하는 동안, 시프트 키를 누르고 있습니다.
  10. 최적의 비드의 전체 말림 전에 몇 프레임이 완료 측정을 시작하고 있습니다완전히 형성 초기 비드의 phagosome가 형성되고 식세포 컵 닫힌 프레임있는. 이 BF 채널에서 상대적으로 명확하게 분간 할 수 있어야합니다.
  11. "분석"과 측정을 실행하는 "측정"을 클릭하여 이동하며, 결과는 "결과"라는 제목의 별도의 창에 표시됩니다.
  12. 다음 프레임으로 이동 비드가 이동 한 경우의 ROI의 위치를​​ 조정하고, 측정을 반복한다. 결과는 결과 창에서리스트에 추가 될 것이다; 각 분석 프레임은 "라벨"열에있는 값에 기초하여 식별 될 수있다.
    참고 : (측정 값의 예를 들어 "M") 바로 가기 키를 사용하여 크게 평가 프로세스를 가속화 할 수있다, 바로 가기의 목록을 확인하고 메뉴 "플러그인"에서 의상 사람을 지정합니다.
  13. 모든 관련 프레임의 측정을 완료 한 후, 결과는 MS 엑셀과 같은 스프레드 시트 애플리케이션에 복사 할 수있다. 열 "IntDen는"intensitie를 묘사측정이 리디렉션되었다는 채널에서 선택된 영역들.

8. 표백 수정

사용되는 프로브와 영상 설정에 따라 사진 표백가 발생할 수 있습니다. 그 정도에 따라이 강하게 평가의 결과에 영향을 미칠 수있다. 그러나이 효과는 부분적으로 측정 값에 변화의 동일하지만 반대의 비율을 적용하여 해결할 수 있습니다. 본 경우에, 광 - 표백 계수는 각각의 phagosome의 분석과 관련된 시간 기간 동안 전체 프레임의 시간에 따른 신호 강도의 감소, 또는 프레임의 구체적으로 자른 영역을 측정함으로써 계산 될 수있다. 이 프로세스는도 3 및도 4에 도시된다.

  1. 피지의 '플러그인'메뉴에서 전체 프레임의 일반적인 감소, 또는 시간에 ROI 특정 프로브 신호 강도 (그림 3을 결정하기 위해 "시계열 분석"플러그인을 사용).
    참고 : 시계열 분석 플러그인에서 다운로드 할 수 있습니다 http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/time-series.html 플러그인 메뉴의 경우에는 존재하지.
  2. 만 분석의 phagosome의 프레임에 해당하는 프레임에 대해, MS Excel에서 시간 (초)에 대한 측정을 그린다.
  3. 플롯에 선형 추세 선 (그림 4A)를 적용, 감소 신호에 대한 음의 기울기는 사진 표백 효과의 존재를 나타냅니다.
  4. 분석의 phagosome (그림 (b)와 (c))의 값을 반전 경사를 적용 수정 신호 강도 (SI) = 원시 SI + (시간 (초) * 경사 역)

참고 : 각각의 단일 분석의 phagosome는 기록 시간 경과 영화 중 (완전 흡수 프레임에서 시작) 특정 시간 간격이있을 것이다, 포토 bleac에게힝는 특정 기간에 대해 다시 계산해야하며, 특정의 phagosome에서 측정 된 값을 수정하는 경우에만 유효합니다.

9. 데이터 평가

  1. 데이터를 대조하고 적절한 소프트웨어 표백 보정 값의 평균 및 통계 오차를 계산한다.
  2. 적절한 형태의 평가 데이터를 그린다.

참고 : 여기에, 과학적인 통계와 소프트웨어 그래프 패드 프리즘을 플로팅 ( http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ )를 사용 하였다. 프리즘 소프트웨어는 한 모든 데이터가 동일한 프레임 속도 (즉, 모두가 같은 하나의 프레임마다 10 초와 같은 간격으로 함께 인수했다)가 같이 해당 오류 표시기 평균 곡선을 생성하고 플롯 할 수 있습니다.

참고 : 같은 experim의 반복 내에서 절대 SI 값의 넓은 변화를ENT 세트는 매우 큰 통계 오류를 소개하고 데이터를 사용할 수 없게됩니다. 프로토콜, 예를 들어, 영상 설정, 대조하는 서로 다른 실험이 반복되는 가운데 엄격하게 동일한 개최되지 않은 경우에 해당 될 수 있습니다.

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결과

이미징을위한 세포와 구슬의 올바른 준비가 중요합니다. 그림 1은 BMMs에 대한 우리의 최적화 된 프로토콜을 기반으로 파종, 프로브 로딩이 방법의 초기 이미징 단계의 개요를 보여줍니다. 그것은 프로토콜 파라미터가 세포와 사용되어야 프로브의 종류에 따라 시험하고 최적화 할 수 있다는 것이 필수적이다.

사전로드 된 세포의 IgG 코팅 된 비드를 첨가 한 결과, 소정 배율 설정으로 유지하면서 시야가 가능한 셀들의 가장 큰 수있는 잠재적 인 흡수 이벤트의 최대 개수를 제공하는 방식으로 선택되는 것이 중요 프로토콜. 도 2에 도시 된 바와 같이,이 방법은 각 시간 경과 비디오 분석 가능한 된 phagosomes의 큰 수를 제공 할 수있다. 각 실험 세트의 비디오 수율 당 데이터 포인트의 증가에 더하여,이 변화에 의해 도입 periphe 편차 감소RAL 조건과 데이터의 안정성을 증가시킨다.

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토론

다음 섹션에서 우리는 제시된 방법과 그 한계의 중요한 단계를 설명합니다. 또한, 우리는 그들의 솔루션과 일반적인 문제 중 일부를 연결 가능한 수정 사항을 소개하고 우리의 방법의 장점뿐만 아니라이 방법에 적합한 보완적인 방법을 고려할 것입니다.

비드 표면의 IgG의 결합을 포함한 비드의 제조는, 결정적이고 unfresh 제제의 사용은 피해야한다. 그것에 추가, 그것은 덱스 트란 갓 모든 실험 전에 냉동 보관 (희석 및 소독)에서 준비하는 것도 중요합니다. 이 덱스 트란의 로딩이 셀룰러 흡수 및 구획 분포 및 축적 일관성을 달성하기 위해 정확한 일정을 따르는 것이 중요하다. 또, 동일 현미경 설정 및 소프트웨어 설정뿐만 아니라, 가능 (예 TE 한 일정 주변 조건을 유지할뿐만 아니라 사용하는 것이 중요mperature, CO 2, 습도, 비드 또한 기술, 등.). 또 다른 중요한 점은 뷰 또는 그 셀의 필드의 선택이다, 샘플을 ...

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공개 사항

저자가 공개하는 게 없다.

감사의 글

우리는 원고의 중요한 읽기의 phagosome 생물학 실험실의 구성원을 감사드립니다. 이 작품은 헬름홀츠 젊은 탐정 그랜트 (이니셔티브와 헬름홀츠 협회의 네트워킹 기금) 및 우선 순위 프로그램의 독일 연구위원회 (도이치 Forschungsgemeinschaft, DFG)의 SPP1580 교부금에 의해 지원된다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Dulbecco's Modified Eagles Medium (D-MEM)PAA, 오스트리아E15-009
Dulbecco's Modified Eagles Medium without phenol red (D-MEM)PAA, 오스트리아E15-047
Fetal Bovine Serum (FBS)PAA, AustriaA15-151
L-GlutaminePAA, AustriaM11-004
PBSPAA, AustriaH15-002
페니실린/스트렙토마이신PAA, 오스트리아P11-010
WillCo-dish® 유리 바닥 접시 (35 mm ∅, #1.5)WillCo Wells, NetherlandsGWSt-3522
CELLviewTM 유리 바닥 접시, 35 mmGreiner Bio one, 독일627871대안: 분절된
Carboxylated 라텍스 마이크로스피어로Polysciences, USA#09850다른 직경에서 사용 가능, 우리는 3 μ m
폴리스티렌 미립자Kisker Biotech, 독일PPs-3.0COOH
Triton-X 100ROTH, 독일305.1.3
마우스 전체 IgGRockland, 미국010-0102
EDAC crosslinkerSigma-Aldrich, 미국E6383-1g
10 mM TrisSigma-Aldrich, 미국T1503
1-ml 주사기 Omnifix -FB.Braun, 독일9161406V
26  G 바늘 (0.45*25 mm)B.Baun, 독일4657683
RPMI 1640PAA, 오스트리아E15-039
호스 세럼Gibco, 미국16050-122
MES 수화물시그마-알드리치, 미국M2933
0.2 μ M 실린지 장착 필터Sartorius, 독일83.1826.001
사용 가능

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